LA SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI: LA NUOVA FRONTIERA DELLA PMA?

LA SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI: LA NUOVA FRONTIERA DELLA PMA? Lodovico Parmegiani Centri Medici GynePro Bologna

Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI) L iniezione intracitoplasmatica degli spermatozoi (ICSI) trova indicazione in caso di: Sterilità da fattore maschile (oligo-asteno-teratospermia) Precedenti fallimenti Fecondazione in Vitro Tradizionale Numero limitato di ovociti da inseminare

La ICSI rappresenta la tecnica di inseminazione in vitro d elezione nei più importanti centri di procreazione medicalmente assistita (PMA) in tutto il mondo ICSI nel mondo

Qualità spermatozoi ed ICSI Nei primi anni di introduzione della ICSI l entusiasmo generato da tale tecnica rivoluzionaria (che permetteva gravidanze anche mediante l impiego di un solo spermatozoo immobile) ha indotto a pensare che i risultati in termini di fertilizzazione, divisione embrionaria ed impianto potessero essere indipendenti dalla qualità spermatica.

Qualità spermatozoi ed ICSI: 15 anni dopo In realtà a più di 15 anni dall introduzione della tecnica, in base alle esperienze accumulate nelle ICSI con spermatozoi immaturi (testicolari o epididimari) o anomali, numerosi studi hanno dimostrato che la qualità del nemasperma microiniettato può essere determinante nei processi di fertilizzazione e divisione embrionaria ed anche nella trasmissione di eventuali anomalie genetiche o cromosomiche.

Anomalie della cromatina spermatica Nuovi test diagnostici hanno messo in evidenza la presenza di anomalie del DNA spermatico non sono evidenziabili mediante una tradizionale analisi del liquido seminale (Lopes et al, 1998; Irvine et al, 2000; Zini et al, 2001). Decondensazione della cromatina Frammentazione della cromatina

Anomalie della struttura cromatinica spermatica: Sono associate con l incapacità di ottenere una gravidanza (sia mediante concepimento spontaneo che dopo fecondazione in vitro) o con l alta incidenza di aborti precoci. (Hoshi et al, 1996; Hammadeh et al, 1998; Evenson et al, 1999; Host et al, 2000; Larson et al, 2000; Spano et al, 2000; Virant-Klun et al, 2002; Benchaib et al, 2003; Bonde et al, 2003; Carrell et al, 2003; Henkel et al, 2003, 2004; Larson- Cook et al, 2003; Salehet al, 2003; Seli et al, 2004; Virro et al, 2004) Possono determinare malformazioni e patologie fetali. (Hansen et al, 2002; Aitken et al, 2004)

Selezione dello spermatozoo ideale Nonostante sia possibile limitare la percentuale di frammentazione del DNA spermatico mediante terapia farmacologia con antiossidanti (Greco et al, 2005): la selezione dello spermatozoo ideale (privo di anomalie cromosomiche o alterazioni cromatiniche) da impiegare nella ICSI rappresenta senza dubbio la nuova frontiera della PMA

SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI PER LA ICSI MEDIANTE ACIDO IALURONICO (HYALURONIC ACID HA)

SPERM SELECTION WITH HYALURONIC ACID: PHYSIOLOGICAL ICSI HUMAN FERTILIZATION The Extra Cellular Matrix (ECM) is a formidable barrier which the sperm must go through to reach the Zona Pellucida and to fertilize the oocyte.

SPERM SELECTION WITH HYALURONIC ACID: PHYSIOLOGICAL ICSI HUMAN FERTILIZATION Hyaluronic Acid (HA) plays a pivotal role in physiological sperm selection. H-20 protein ammalian Sperm Hyaluronidase Gmaachl & Kreil, 1993) ith HA binding domain distinct from hyaluronidase domain Gacesa et al., 1994)

SPERM SELECTION WITH HYALURONIC ACID: PHYSIOLOGICAL ICSI Sperms that are able to bind HA are mature and they have completed the spermiogenetic process of sperm plasma membrane remodelling, cytoplasmic extrusion and nuclear maturity (Huszar et al., 2003).

SPERM SELECTION WITH HYALURONIC ACID: PHYSIOLOGICAL ICSI Mature spermatozoa with high density of HA receptors: they bind permanently to HA. Immature spermatozoa with deficient maturity and plasma membrane remodelling: they are not able to bind to HA. (Cayli et al. 2003)

SPERM SELECTION WITH HYALURONIC ACID: PHYSIOLOGICAL ICSI HA-bound sperms show a 5.4-fold reduction on chromosomal anueploidies whereas a 4-fold increase in these chromosomal diseases is reported in ICSI offspring. (Jakab et al. 2005).

SPERM SELECTION WITH HYALURONIC ACID: PHYSIOLOGICAL ICSI The HA-containing media avoid any potential damaging effect of synthetic plastic polivinilpirrolidone (PVP), currently used to reduce sperm motility during ICSI procedure (Jean et al 2001).

SPERM SELECTION WITH HYALURONIC ACID: PHYSIOLOGICAL ICSI SPERM SELECTION WITH HYALURONIC ACID (HA) FOR INTRACYTOPLASMIC SPERM INJECTION (ICSI) ON A LIMITED NUMBER OF OOCYTES L.Parmegiani, S. Bernardi, E. Troilo, W. Ciampaglia, P.Pocognoli, C. Tabarelli de Fatis, G.E. Cognigni, M. Filicori Reproductive Medicine Unit GynePro Medical Centers Bologna, Italy

SPERM SELECTION WITH HYALURONIC ACID: PHYSIOLOGICAL ICSI Group PVP : 107 ICSI treatments with PVP to reduce sperm motility. Group HA : 125 ICSI treatments with HAcontaining product to sperm selection. In this group the sperms were selected for their bond to HA and easily detached by injecting pipette before ICSI. The main ICSI outcome measures between the two groups were observed.

Video SPERM SELECTION WITH HYALURONIC ACID: PHYSIOLOGICAL ICSI

SPERM SELECTION WITH HYALURONIC ACID: PHYSIOLOGICAL ICSI PVP HA P ICSI treatments 107 125 Female partner age (Mean ± SD) 37.05 ± 4.44 37.46 ± 3.99 n.s. Fertilization rate 236/275 (85.8%) 304/332 (91.6%) n.s. Abnormal fertilization rate 3/275 (1.1%) 2/332 (0.6%) n.s. Cleavage rate 228/236 (96.6%) 282/304(92.7%) n.s. Top quality embryo rate 55/228(24.1%) 101/282(35.8%) 0.046

SPERM SELECTION WITH HYALURONIC ACID: PHYSIOLOGICAL ICSI DNA fragmentation in HA-selected sperms (Parmegiani et al., unpublished) Design - DNA fragmentation test on ejaculate sperms of 20 males (8 oligospermic-12 normospermic). Materials and methods Each semen sample underwent Sperm Chromatin Dispersion Test (Fernandez et al., 2003): 1. At 30 minutes from ejaculation (BASAL) 2. After Swim Up (SWIM UP) 3. After recovery in PVP by ICSI pipette (PVP) 4. After recovery in HA by ICSI pipette (HA)

SPERM SELECTION WITH HYALURONIC ACID: PHYSIOLOGICAL ICSI 20 patients. Mean age±se: 38.5±1.0 Mean motile sperm number X 10 6 ±SE: 39.4±7.3 (6-144) BASAL SWIM UP Sperms with fragmented DNA 1655 1100 Sperms observed 10,000 10,000 DNA fragmentation rate 16.5% 11.0% P=<0.001 PVP HA Sperms with fragmented DNA 442 214 Sperms observed 4,000 4,000 DNA fragmentation rate 11.0% 5.3% P=<0.001 (Parmegiani et al, unpublished)

SPERM SELECTION WITH HYALURONIC ACID: PHYSIOLOGICAL ICSI Result The DNA fragmentation rate was significantly lower in group HA than in group PVP. Conclusion HA-bound sperms show a 3-fold reduction of DNA fragmentation compared with the basal sample.

Selezione degli spermatozoi con acido ialuronico L esperienza pionieristica di GynePro nella selezione degli spermatozoi con acido ialuronico ha dimostrato: che la selezione degli spermatozoi con HA ottimizza i risultati quando la ICSI viene eseguita su un numero limitato di ovociti che la selezione degli spermatozoi con HA riduce di 3 volte l indice di frammentazione del DNA spermatico

ICSI FISIOLOGICA Per la capacità di ridurre le complicazioni genetiche e per la sua completa atossicità, la selezione degli spermatozoi con acido ialuronico finalizzata alla ICSI rappresenta il metodo di microinseminazione più simile al processo di fecondazione fisiologica. Questo tipo di approccio alla ICSI, che può essere definito ICSI FISIOLOGICA, viene routinariamente eseguito nel nostro centro di procreazione assistita GynePro-Bologna da almeno tre anni.

SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI PER LA ICSI MEDIANTE AMPLIFICAZIONE D IMMAGINE (INTRACYTOPLASMIC MORPHOLOGICALLY SELECTED SPERM INJECTION - IMSI)

Ultramorfologia degli spermatozoi Nuove sofisticate tecnologie di microscopia hanno permesso di osservare una correlazione tra integrità cromatinica e l ultramorfologia degli spermatozoi. Un osservazione in real-time a più di 6.300 ingrandimenti permette di individuare e selezionare gli spermatozoi che presentano un contenuto cromatinico integro (Bartoov et al, 2002).

Tale tipo di selezione richiede un sofisticato dispositivo di amplificazione di immagine applicato al sistema di micromanipolazione per la ICSI Amplificazione di immagine

Motile Sperm Organelle Morphology Examination (MSOME) Il criterio di riferimento per selezione degli spermatozoi ad alto ingrandimento viene definito Motile Sperm Organelle Morphology Examination (MSOME) (Bartoov et al, 1994)

Motile Sperm Organelle Morphology Examination MSOME Ultrafine Structure of the Sperm Cell SubCellular Organelles Acrosome Neck Nucleus Post Acrosomal Lamina Mitochondria Outer Dense Fibers Axonema

Intracytoplasmic Morphologically Selected sperm Injection (IMSI) L esecuzione della selezione spermatica a 6.300 ingrandimenti associata alla microiniezione viene definita Intracytoplasmic Morphologically Selected sperm Injection (IMSI), al fine di distinguere questa nuova procedura di inseminazione dalla ICSI tradizionale (Bartoov et al, 2003).

GynePro - IMSI Nel nostro centro GynePro-Bologna viene eseguita la selezione degli spermatozoi mediante un sistema di amplificazione di immagine che permette di raggiungere i 13.000 ingrandimenti.

IMSI - Indicazioni La ICSI con amplificazione di immagine trova indicazione nel trattamento di coppie che presentano poliabortività, ripetuti fallimenti dopo trattamenti ICSI tradizionali o con partner maschili che presentano un alto indice di frammentazione del DNA spermatico.

SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI LE NUOVE FRONTIERE ICSI FISIOLOGICA SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI CON ACIDO IALURONICO IMSI SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI MEDIANTE AMPLIFICAZIONE D IMMAGINE

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