Una panoramica... Nucleotidi e acidi nucleici Prof.ssa Silvia Recchia Nella foto, la micrografia dei cromosomi durante la meiosi, la divisione dei geni che avviene nelle cellule sessuali. I componenti degli acidi nucleici Gli acidi nucleici sono macromolecole lineari, a catena, isolate per la prima volta dai nuclei delle cellule. L idrolisi completa di un acido nucleico fornisce una miscela di ZUCCHERO BASI ETEROCICLICHE (quattro tipi) ACIDO FOSFORICO I componenti degli acidi nucleici Zucchero D-ribosio 2-desossi-D-ribosio RNA DNA Basi eterocicliche
DNA vs RNA Nucleosidi Il legame tra basi eterocicliche e ribosio forma i diversi NUCLEOSIDI Il legame è di tipo β-n-glicosidico tra il carbonio anomerico del ribosio e l N 9 delle purine o N1 delle pirimidine Nucleosidi Il legame può avere due orientazioni: Syn e Anti. Anti è predominante. Nucleotidi Syn Anti Hanno numerosi gruppi polari e sono solubili in acqua. Sono facilmente idrolizzabili da soluzione acquose di acidi. I nucleotidi sono ESTERI FOSFATO dei nucleosidi. Possono essere mono-, di- e tri-fosfati (Es. TMP, TDP, TTP) I di- e tri-fosfati sono legati da legame anidridico, stabile e ad alta energia
Nucleotidi Nucleotidi TMP Il sito di fosforilazione è spesso l ossidrile al 5 del ribosio, ma può essere anche quello in 3 I nucleotidi possono essere idrolizzati da una base acquosa o per via enzimatica a nucleosidi e acido fosforico. Funzioni dei nucleotidi Unità strutturali degli acidi nucleici Deposito di energia delle reazioni di trasferimento di fosfato (ATP) Mediatore di processi cellulari (camp) Parte di coenzimi (NADH, FAD, CoA ) ATP, ADP, AMP, camp L'adenosina è presente come fosfato in varie forme. Il 5'-monofosfato, difosfato e trifosfato, così come il monofosfato 3',5'-ciclico, sono intermedi chiave in numerosi processi biologici. L'ATP contiene due legami di anidride fosforica ed ha la caratteristica di liberare quantità notevoli di energia quando si idrolizza ad ADP e, successivamente, ad AMP. Sono queste le reazioni che forniscono l'energía necessaria per altre reazioni biologiche.
NAD, FAD, CoA Coenzimi importanti contengono nucleotidi nella loro struttura: Coenzima A, nella cui struttura è presente l'adp, un agente biologico capace di trasferire i gruppi acilici, che ha un ruolo chiave nel metabolismo dei grassi. Coenzimi importanti contengono nucleotidi nella loro struttura: Il nicotinammide adenina dinucleotide (NAD) NAD, FAD, CoA NAD, FAD, CoA Coenzimi importanti contengono nucleotidi nella loro struttura: il flavina adenina dinucleotide (FAD) Strutturia primaria del DNA: i polinucleotidi I polinucleotidi si formano dalla condensazione di due o più nucleotidi tra il fosfato legato al!5 -OH del ribosio di un nucleotide ed il 3 -OH!del ribosio dell altro con eliminazione di H2O ogni fosfato ha ancora un protone acido che, a ph 7, è ionizzato (carica negativa sull'ossigeno). Se il gruppo fosfato fosse indissociato, la sostanza sarebbe un acido; polinucleotidi biologici = acidi nucleici.
Polinucleotide del DNA Polinucleotide del DNA Il legame fosfodiesterico è direzionale, e la sequenza va da 5 a 3 La sequenza (STRUTTURA PRIMARIA) delle basi definisce la molecola: 5 -pgpaptpc-3 I polinucleotidi biologici sono l ACIDO DEOSSIRIBONUCLEICO (DNA) e l ACIDO RIBONUCLEICO (RNA) Legame fosfodiestereo Sequenziazione del DNA Metodo di Maxam-Gilbert (1977) CATENA DNA 5000-10 6 unità Endonucleasi di restrizione FRAMMENTI 100-150 unità GRUPPO A di nucleotidi Elettroforesi su gel* 4 differenti condizioni: rompono i frammenti in corrispondenza di una base precisa GRUPPO B di nucleotidi Elettroforesi su gel* GRUPPO C di nucleotidi Elettroforesi su gel* GRUPPO D di nucleotidi Elettroforesi su gel* * separa in base al NUMERO (massa) delle unità nucleotidiche
Sequenziazione del DNA Sequenziazione del DNA Metodo di Maxam-Gilbert (1977) Metodo di Sanger (1977) http://www.biotechland.it/biotecnologie_sequenziamento%20dna_maxam%20gilbert.html Struttura secondaria del DNA: la doppia elica http://www.biotechland.it/biotecnologie_sequenziamento%20dna_sanger.html Il modello di Watson e Crick Elica destrorsa costituita da due catene polinucleotidiche antiparallele, avvolte attorno ad un asse comune Le basi sono all interno dell elica allineate!ad angolo retto con l asse dell elica (deossiribosio e fosfato all esterno) Le due catene sono unite da ponti idrogeno tra purine di una catena e pirimidine dell altra Nel 1950 Chargaff trovò che la quantità di A e T sono sempre uguali, e quelle di G e C sono sempre uguali. Nel 1953 Watson e Crick a Cambridge proposero il modello a DOPPIA ELICA, confermato poi dai dati a i raggi X di R. Franklin e M. Wilkins. G-C formano 3 legami idrogeno A-T formano 2 legami idrogeno Figura riportata nella pubblicazione originale di Watson e Crick Nature, Aprile 1953
Appaiamento delle basi Appaiamento delle basi Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2006
OLD Nature, Vol. 171, p.737, April 25, 1953 MOLECULAR STRUCTURE OF NUCLEIC ACIDS A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid We wish to s uggest a structure for the salt of deoxyribose nucleic acid (D.N.A.). This structure has novel features which are of considerable biological interest. A structure for nucleic acid has already been proposed by Pauling and Corey (1). They kindly made their manuscript available to us in advance of publication. Their model consists of three intertwined chains, with the phosphates near the fibre axis, and the bases on the outside. In our opinion, this structure is unsatisfactory for two reasons: (1) We believe that the material which gives the X-ray diagrams is the salt, not the free acid. Without the acidic hydrogen atoms it is not clear what forces would hold the structure together, especially as the negatively charged phosphates near the axis will repel each other. (2) Some of the van der Waals distances appear to be too small. Another three-chain structure has also been suggested by F raser (in the press). In his model the phosphates are on the outside and the bases on the inside, linked together by hyd rogen bonds. This structure as described is rather ill-defined, and f or this reason we shall not comment on it. We wish to put forward a ra dically different structure for the salt of deoxyribose nucleic acid. This structure has two helical chains each coiled round the same axis (see diagram). We have made the usual chemical assumptions, namely, that each chain consists of phosphate diester groups joining ß-Ddeoxyribofuranose residues with 3',5' linkages. The two chains (but not their bases) are related by a dyad perpendicular to the fibre axis. Both chains follow right- handed helices, but owing to the dyad the sequences of the atoms in t he two chains run in opposite directions. Each chain loosely resembles Furberg's2 model No. 1; that is, the bases are on the inside of the helix and the phosphates on the outside. The configuration of the sugar and the atoms near it is close to Furberg's 'standard configuration', the sugar being roughly perpendicular to the attached base. There is a residue on each every 3.4 A. in the z-direction. We have assumed an angle of 36 between adjacent residues in the same chain, so that the structure repeats after 10 residues on each chain, that is, after 34 A. The distance of a phosphorus atom from the fibre axis is 10 A. A s the phosphates are on the outside, cations have easy access to them. The structure is an open one, and its water content is rather high. At lower water contents we would expect the bases to tilt so that the structure could become more compact. The novel feature of the structure is the manner in which the two chains are held together by the purine and pyrimidine bases. The planes of the bases are perpendicular to the fibre axis. The are joined together in pairs, a single base from the other chain, so that the two lie side by side with identical z-co-ordinates. One of the pair must be a purine and the other a pyrimidine for bonding to occur. The hydrogen bonds are made as follows : purine position 1 t o pyrimidine position 1 ; purine position 6 to pyrimidine position 6. If it is assumed that the bases only occur in the structure in the most plausible tautomeric forms (that is, with the keto rather than the enol configurations) it is found that only specific pairs of bases can bond together. These pairs are : adenine (purine) with thymine (pyrimidine), and guanine (purine) with cytosine (pyrimidine). In other words, if an adenine forms one member of a pair, on either chain, then on th ese assumptions the other member must be thymine ; similarly for guanine and cytosine. The sequence of bases on a s ingle chain does not appear to be restricted in any way. However, if only specific pairs of bases can be formed, it follows that if the sequence of bases on one chain is given, then the sequence on t he other chain is automatically determined. It has been found experimentally (3,4) that the ratio of the amounts of adenine to thymine, and the ration of guanine to cytosine, are always bery close to unity for deoxyribose nucleic acid. It is probably impossible to build this structure with a ri bose sugar in place of the deoxyribose, as the extra oxygen atom would make too close a van der Waals contact. The previously published X-ray data (5,6) on deoxyribose nucleic acid are in sufficient for a rigorous test of our structure. So far as we can tell, it is roughly compatible with the experimental data, but it must be regarded as unproved until it has been checked against more exact results. Some of these are given in the following communications. We were not aware of the details of the results presented there when we devised our structure, which rests mainly though not entirely on published experimental data and stereochemical arguments. It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material. Full details of the structure, including the conditions assumed in building it, together with a set of co-ordinates for the atoms, will be published elsewhere. We are much indebted to Dr. Jerry Donohue for constant advice and criticism, especially on interatomic distances. We have also been stimulated by a knowledge of the general nature of the unpublished experimental results and ideas of Dr. M. H. F. Wilkins, Dr. R. E. Franklin and their co-workers at King's College, London. O ne of us (J. D. W.) has been aided by a fellowship from the National Foundation for Infantile Paralysis. J. D. WATSON F. H. C. CRICK 1. Pauling, L., and Corey, R. B., Nature, 171, 346 (1953); Proc. U.S. Nat. Acad. Sci., 39, 84 (1953). 2. Furberg, S., Acta Chem. Scand., 6, 634 (1952). 3. Ch argaff, E., for references see Zamenhof, S., Brawerman, G., and Chargaff, E., Biochim. et Biophys. Acta, 9, 402 (1952). 4. Wyatt, G. R., J. Gen. Physiol., 36, 201 (1952). 5. A stbury, W. T., Symp. Soc. Exp. Biol. 1, Nucleic Acid, 66 (Camb. Univ. Press, 1947). 6. W ilkins, M. H. F., and Randall, J. T., Biochim. et Biophys. Acta, 10, 192 (1953). NEW NEW OLD NEW OLD NEW It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material. Medical Research Council Unit for the Study of Molecular Structure of Biological Systems, Cavendish Laboratory, Cambridge. Conformazioni del DNA Conformazione B-DNA Il modello della doppia elica di Watson-Crick è in realtà una semplificazione. Le conformazioni ad elica del DNA vengono sono attualmente classificate in tre famiglie generali: Forma predominante = regolare elica destrorsa di Watson e Crick, con basi perpendicolari all asse dell elica. Si ottiene quando il DNA è completamente idratato (in vivo) OLD forme A, B e Z. 10 basi per giro completo dell elica 3,4 Ǻ = distanza tra due basi 36 = angolo rotazione tra due basi La superficie esterna mostra due solchi separati dalla catena fosfato-ribosio: solco maggiore (major groove) e solco minore (minor groove). Il pavimento di questi solchi è costitutito dai fianchi delle basi azotate.
Conformazione A-DNA Conformazione Z-DNA Ottenuto in condizioni di disidratazione non fisiologica (sembra non esistere in vivo) Elica destrorsa con catene antiparallele e basi inclinate (20 circa) rispetto all asse dell elica 10.9 basi per giro completo dell elica 33,1 rotazione angolare tra due basi adiacenti 2,9 Ǻ = distanza tra due basi adiacenti Struttura trovata in sequenze caratterizzate da alternanza di G e C (probabile anche in vivo) Elica è sinistrorsa e la dorsale zucchero-fosfato segue un andamento a zig-zag. Guanidine in posizione syn. Major groove molto superficiale e minor molto stretto. Conformazioni del DNA Conformazioni del DNA A B Z
Strutture superiori del DNA DNA circolare con superavvolgimento = 0 I batteri hanno cromosomi circolari Proprietà termiche Se il DNA è portato ad alte temperature i legami H diventano instabili e le due catene si separano: DENATURAZIONE TERMICA. Le sequenze ricche di A e T si denaturano più facilmente di quelle ricche in G e C. La temperatura alla quale il 50% del DNA è denaturato è detta Tm (Melting Temperature) dipende dalla sequenza. Dopo raffreddamento le basi si riappaiano: rinaturazione. DNA superavvolto negativamente Replicazione del DNA La formazione dell asola (loop) del filamento madre permette all oloenzima polimerasi III (giallo) di sintetizzare entrambi i filamenti figli. Nel sito dell enzima le catene madri devono passare con la stessa direzione. A ogni loop che si forma vengono legati circa 1000 nucleotidi (frammento di Okazaki); i vari frammenti dovranno poi essere legati da uno specifico enzima (ligasi).
Acidi ribonucleici: RNA Gli acidi ribonucleici (RNA) differiscono per tre aspetti importanti dal DNA:!! lo zucchero è il D-ribosio,! una delle quattro basi eterocicliche è l'uracile (al posto della timina)! molecole di RNA sono costituite da un unico filamento, sebbene possano essere presenti zone a elica, dovute al ripiegamento della catena su se stessa. Il D-ribosio, lo zucchero dell'rna, è diverso dal 2-deossi-D-ribosio, lo zucchero del DNA, in quanto ha un ossidrile sul C-2. Per il resto i nucleosidi e i nucleotidi dell'rna hanno!strutture simili a quelli del DNA. Acidi ribonucleici: RNA Effetto del 2-OH Il gruppo è ingombrate ed interferisce con la struttura della doppia elica (struttura A): RNA va incontro ad idrolisi spontanea 100 volte più velocemente di DNA. Acidi ribonucleici: RNA Le cellule contengono tre tipi principali di RNA: l'rna messaggero (mrna), che presiede alla trascrizione del codice genetico e funge da matrice della sintesi proteica; l'rna transfer (trna), che trasporta al ribosoma gli amminoacidi in forma attivata, pronti per la formazione dei legami peptidici; l'rna ribosomiale (rrna), che rappresenta circa l'80% dell'rna cellulare totale (trna=15%; mrna=5%) ed è il principale componente dei ribosomi.
mrna Hanno strutture tridimensionali (3D) complesse Esiste un mrna specifico per ogni proteina sintetizzata dalla cellula. Esiste almeno un trna per ogni amminoacido trna Ribosomi rrna I ribosomi sono formati da tre molecole di RNA ribosomiale e da proteine che si associano a formare due subunità di dimensioni differenti (una più grande dell'altra). Un ribosoma batterico ha una massa di circa 2700 kda, un diametro di circa 20nm. Subunità grande del ribosoma dell'archeobatterio Haloarcula marismortui. In blu le proteine, in giallo e rosa i due RNA Subunità piccola del ribosoma dell'eubatterio Thermus thermophilus. In blu le proteine, in rosa l'rna
Biosintesi delle proteine Biosintesi delle proteine Codice genetico Il codone viene definito come una sequenza specifica di 3 nucleotidi (tripletta) lungo l'mrna che codifica l'informazione per l'inserimento di uno specifico amminoacido durante la sintesi proteica o per la fine della stessa (definito codone di stop). Il codone è alla base del codice genetico. Biosintesi delle proteine Il codice è DEGENERE nel senso che codoni diversi possono codificare lo stesso amminoacido.