Biocarburanti. C. MAZZONI/BiotecnologieMicrobiche

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1 Biocarburanti

2 2! esaurimento dei combustibili fossili derivanti da petrolio (risorse non rinnovabili)! dipendenza dell Occidente dalle produzioni estere necessità di andare alla ricerca di FONTI DI ENERGIA ALTERNATIVE RINNOVABILI

3 3 Biocarburanti apple Bioetanolo L unico prodotto su scala industriale. Precursore del ETBE apple Biometano Prodotto su larga scala ma non utilizzato nei trasporti apple Biobutanolo Potrebbe essere utilizzato come additivo per gasolio e benzina. Precursore del BTBE apple Butil-t-butil-etere (BTBE) apple Etil-t-butiletere (ETBE)

4 4 Appl Microbiol Biotechnol Nov;77(1): Epub 2007 Sep 22

5 5 Trasporto dei biocarburanti apple Gassosi: idrogeno e metano. Difficili da trasportare apple Liquidi: alcol apple Altre caratteristiche desiderate: Calore di combustione alto Pressione e temperatura di infiammabilità

6 6 Applicazione alle macchine apple 1. Le macchine devono essere adattate ai nuovi carburanti apple 2. I nuovi carburanti devono essere modificati in funzione delle macchine apple 3. Usare una miscela di biocarburanti e carburanti tradizionali

7 7 BTL: Biomass-to-Liquid, ottenuto dalle biomasse tramite mezzi termochimici

8 8

9 9 BTL: SunDiesel Volkswagen ha una partecipazione Shell interessata

10 Produzione di BIOETANOLO

11 11

12 12

13 13 produzione di BIOCOMBUSTIBILI! soluzione alla domanda mondiale di energia! ridurre le emissioni di gas serra Il + comune biocombustibile EtOH perché? 1. è biodegradabile 2. produce meno emissioni di gas serra rispetto ai combustibili fossili 3. può sostituire additivi nocivi di altri combustibili (MTBE)

14 Stati Uniti EtOH (99% del biocombustibile totale prodotto) 14 Prodotto per fermentazione dagli zuccheri derivanti da grano (amido) e canna da zucchero (saccarosio) svantaggi e costi! abbondanti q.tà di fertilizzante azotato utilizzato (contaminazione delle H 2 O del sottosuolo)! erosione estensiva del suolo associata alla coltivazione di questo tipo di raccolto

15 soluzioni ideali per l ambiente 15 riduzione del danno ambientale partendo da fonti di C diverse da amido e saccarosio (limitanti) soluzioni migliori per la produzione miglioramento del macchinario enzimatico che interviene nella conversione degli zuccheri di partenza ingegnerizzazione dei ceppi etanologeni fermentanti BIOMASSA LIGNOCELLULOSICA CELLULOSA (fibre insolubili di β-1,4-glucano; 40-50%) EMICELLULOSA (polisaccaridi non cellulosici xilano; 25-35%) LIGNINA (complessa struttura polifenolica; 15-20%) ostile alla degradazione enzimatica a zuccheri fermentabili

16 16

17 17 Ecoetanolo da fonti che non siano cibo: Iogen

18 18 Biomassa lignocellulosica apple Cellulosa (fibre insolubili di beta1,4-glucano) 40-50% apple Emicellulosa (per lo più xilano) 25-35% apple Lignina (complessa struttura polifenolica) 15-20%

19 Biomassa lignocellulosica EtOH 3 steps 1. PRETRATTAMENTO TERMOCHIMICO 19 fase che la digeribilità del materiale lignocellulosico facilitando l accesso degli enzimi idrolitici acido (idrolisi emicellulose + sostanze chimiche tossiche per il microrganismo) alcalino (idrolisi della lignina) 2. SACCARIFICAZIONE ENZIMATICA fase di idrolisi di cellulosa ed emicellulosa CELLULASI endo-glucanasi (legami β-1,4-glicosidici interni) eso-glucanasi (rilasciano oligosaccaridi: cellobiosio e cellotriosio) β-glucosidasi o cellobiasi (idrolizzano gli oligosaccaridi a unità di glu) EMICELLULASI xilanasi (idrolizzano xilano a xilooligasaccaridi: xilobiosio e xilotriosio) β-xilosidasi (idrolizzano gli xilooligosaccaridi a unità di xilosio)

20 ! COMPLEXED SYSTEM o CELLULOSOMA (complesso multienzimatico che resta attaccato al materiale cellulosico)! NON COMPLEXED SYSTEM (enzimi liberi) FERMENTAZIONE fase di fermentazione degli zuccheri rilasciati nell idrolizzato lignocellulosico da parte di microrganismi etanologeni fermentanti IDROLIZZATO LIGNOCELLULOSICO: miscela di esosi (glucosio) e pentosi (xilosio) substrato non adatto per ceppi etanologeni wt S.cerevisiae necessità di creare mediante ing. genetica ceppi ricombinanti capaci di operare una co-fermentazione degli esosi e pentosi presenti nell idrolizzato

21 21 Perché S. cerevisiae? apple Fermenta efficacemente gli esosi apple Produce etanolo ad alta concentrazione apple E resistente all etanolo e altri composti inibitori che si originano dall idrolisi acida

22 22 1 lavoro (2004) ceppo ricombinante di S.cerevisiae capace di idrolizzare lo XILANO (emicellulosa) a xilosio attraverso la coespressione sulla superficie cellulare di 2 enzimi xilanolitici! gene XYN II (T.reesei) xilanasi II: xilano xilooligosaccaridi (xilobiosio e xilotriosio)! gene XylA (A.oryzae) β-xilosidasi: xilooligosaccaridi xilosio entrambe fusi con la regione 3 -terminale del gene per l α-agglutinina per permettere l esposizione di tali enzimi sulla superficie cellulare

23 Plasmidi pcas1-rgshis6-xyn II usato per l espressione di XYN II pucsxylaf proteina di fusione XylA-FLAGtag-α-agglutinina pucsxiixa XylA-FLAGtag-α-agglutinina e RGSHis6tag-XYNII-α-agglutinina 23 Trasformanti MT8-1/pCAS1-RGSHis6-XYNII (xilanasi II) MT8-1/pUCSxylAf (β-xilosidasi) MT8-1/pUCSXIIXA (co-esprimenti xilanasi II e β-xilosidasi)

24 Immunofluorescenza di rilevamento individuare i trasformanti confermare la presenza di XYN II e XylA sulla superficie cellulare 24 xilanasi xilosidasi Colonna 2 IgG anti-rgshis4 di topo (Ab 1 ario ) + IgG anti-topo coniugato con AlexaFluor 488 (V) (Ab 2 ario ) Colonna 3 IgG anti-flag di topo (Ab 1 ario ) + IgG anti-topo coniugato con AlexaFluor 546 (R) (Ab 2 ario ) Il segnale di fluorescenza V e R nei ceppi MT8-1/pUCSXIIXA confermava la co-espressione delle proteine di fusione XylA-FLAGtag-α-agglutinina (β-xilosidasi) e RGSHis6tag-XYNII-α-agglutinina (xilanasi II)

25 Saggi enzimatici misurare l attività della xilanasi (XYN II) e della β-xilosidasi (XylA) 25 attività simili N.B. I 2 enzimi mostrano le loro attività solo nei pellets cellulari (non nei supernatanti di coltura)

26 Andamento dell idrolisi di xilano 26 = MT8-1/pMUCS (controllo) = MT8-1/pCAS1- RGSHis6-XYN II = MT8-1/pUCSXIIXA (rilascia una > q.tà di zuccheri riducenti) Analisi HPLC dei prodotti di idrolisi rilasciati dopo 3h di reazione Colonna A = MT8-1/pMUCS (controllo) Colonna B = MT8-1/pCAS1-RGSHis6-XYN II Colonna C = MT8-1/pUCSXIIXA 1 = xilosio 2 = xilobiosio 3 = xilotriosio

27 MT8-1/pUCSXIIXA (co-esprimente XYNII e XylA) ingegnerizzato con pwx1x2xk (espressione intracellulare dei geni per l utilizzo dello xilosio) 27 MT8-1/pUCSXIIXA/pWX1X2XK (xilano xilosio EtOH)! gene XYL1 (P.stipitis) xilosio reduttasi (XR) NADPH-dipendente: xilosio xilitolo! gene XYL2 (P.stipitis) xilitolo deidrogenasi (XDH) NAD + -dipendente: xilitolo xilulosio! over-espressione gene endogeno XKS1 (S.cerevisiae) xilulosio kinasi (XK): xilulosio xilulosio 5P (pathway dei pentosi fosfato)

28 28 xilano = fonte di C = [zuccheri totali] = [EtOH] = MT8-1/pMUCS/pWGP3 (controllo) = MT8-1/pUCSXIIXA/pWX1X2XK consumo di xilano significativo della [EtOH] La + [EtOH] si osserva dopo 62h di fermentazione (7.1 g/l) Resa in EtOH = 0.30 g EtOH/g di carboidrato consumato N.B. Il substrato (xilano) non è completamente consumato (miglioramento degli enzimi xilanolitici XYN II e XylA)

29 Conclusioni 29 Molti impedimenti tecnici ed economici allo sviluppo di processi commercialmente praticabili utilizzanti biomassa lignocellulosica per ottenere produzione su larga scala di EtOH da usare come biocombustibile. 1. riduzione dei costi del processo (costo di produzione di EtOH da biomassa è >) 2. costi e efficacia degli enzimi idrolitici 3. miglioramento dei microrganismi fermentanti capacità di conversione degli zuccheri ad EtOH resistenza all EtOH ed eventuali inibitori tasso di crescita rapido ed efficiente tasso di fermentazione

30 30 E se potesse assimilare anche cello-oligosacaridi? apple Idrolisati di legno con acido solforico contengono xilosio e cello-oligosaccaridi (2-6 unità di glucosio) 57.5 g/l glucosio 15.1 g/l mannosio 9.3 g/l galattosio 11.2 g/lxilosio 10.2 g/l cellooligosaccaridi

31 31 Costruzioni Per degradare lo xilano Per degradare cello-oligosaccaridi Plasmidi integrativi MT8-1/Xyl Trasformazione in lievito MT8-1/Xyl/BGL MT8-1/BGL MT8-1/Con

32 32 Solo MT8-1/Xyl e MT8-1/Xyl/BGL possono usare lo xilosio

33 33 Solo MT8-1/BGL e MT8-1/Xyl/BGL possono usare il cellobiosio

34 Fermentazione di un mix di 34 zuccheri

35 Fermentazione di un idrolisato 35 lignocellulosico

36 36 Ancora bioetanolo da apple Zymomonas mobilis apple E. coli ricombinante che esprime adh di Z. mobilis apple Clostridi lignocellulosici Etc...

37 37 Biobutanolo apple La ricerca è ripresa da poco apple BP e Dupont stanno finanziando la ricerca apple Valido additivo per gasolio (30%-70% diesel) e cherosene (20%-80%)

38 38 apple MTBE (metil-tert-butiletere). Cancerogeno apple ETBE (etil-tert-butiletere). Da bioetanolo apple BTBE (butil-tert-butiletere). Da biobutanolo, promettente

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