Saggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di sl-selectin umana.

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1 Istruzioni per l Uso sl-selectin ELISA Saggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di sl-selectin umana. BE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 INFORMAZIONI SUL PRODOTTO E MANUALE. USO PREVISTO 2 2. SOMMARIO 2 3. PRINCIPIO DEL TEST 3 4. REAGENTI FORNITI 4 5. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE 4 6. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI 4 7. MATERIALI NECESSARI MA NO FORNITI 5 8. PRECAUZIONI PER L USO 5 9. PREPARAZIONE DEI REAGENTI 6 0. PROCEDURA DEL TEST 8. CALCOLO DEI RISULTATI 0 2. LIMITI DELLA PROCEDURA 3. CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE 2 4. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI 5 5. SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI 6 6. SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST 7 7. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO (24) / 8

3 . Uso Previsto Saggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di sl-selectin umana. sl-selectin umana ELISA è per uso diagnostico in vitro. Non si usa per procedure terapeutiche. 2. Sommario Leukocyte-Endothelial Cell Adhesion Molecule-, L-selectina (LECAM-, MEL-4, LAM-, LEU-8, TQ, LEC.CAM-, DREG.56) appartiene alla famiglia delle molecola di adesione Selectine. Insieme con ELAM- (E-selectin) e GMP-40 (P-selectin) L-selectina media le interazioni iniziali dei leucociti con le cellule endoteliali. Struttura molecolare: La parte extracellulare di tutte le selectine è costituita da un dominio di lectin del tipo c aminoterminale che si lega specificamente ai leganti di carboidrati. Questo è seguito da un dominio EGFlike e, nel caso di L-selectin, da due brevi ripetizioni di consenso simili alle unità di consenso brevi in proteine di regolazione complementari. La porzione di transmembrana della molecola è seguita da una breve coda citoplasmatica. Le Selectine guidano le cellule polimorfo nucleari non attivate alle aree di infiammazione nella creazione di primi contatti con lo strato endoteliale. L-selectina in questo aspetto media il rolling delle PMN sulle cellule endoteliali. I partner potenziali di legame di L-selectina portano una carica negativa, probabilmente un acido sialico e / o solfato e può contenere mannosio e fucosi. Inoltre, L-selectina può anche interagire con ELAM- che si esprime sulle cellule endoteliali attivate da citocina. L-selenina è espressivamente costituita sulla maggior parte dei leucociti (PMN, monociti, sottogruppi di linfociti) in una forma apparentemente funzionale. È necessario per il legame dei linfociti alle venule endoteliali dei linfonodi periferici (e quindi serve come recettore di recupero dei linfociti) e per l'invasione di neutrofili in siti di infiammazione. Quando i neutrofili vengono attivati, L-selectina viene spartita mediante abbattimento proteolitico vicino alla fascia di transmembrana. I linfociti e i monociti possono anche liberare L-selectina dopo l'attivazione anche se le cinetiche sono significativamente inferiori. Un'ampia gamma di agenti di attivazione, inclusi C5a, fmlp, TNF, GM-CSF, IL-8, sono efficaci nell'indurre questa risposta. La forma di L-selectina (sl-selectina) è funzionalmente attiva e ad elevate concentrazioni può inibire l'attaccamento di leucociti all'endotelio. La principale fonte di sl-selectina nel siero sembra essere leucociti localizzati in tessuto. Determinazione della L-selectina solubile / circolante potrebbe fornire approfondimenti più dettagliati sulle modificazioni patologiche durante varie malattie: - allergia: l'espressione di L-selectina è ridotta-modulata su eosinofili recuperati dal fluido lavaggio bronco alveolare dopo la provocazione allergica. - Lavaggio broncoalveolare (BAL): BAL promuove transitoriamente l'attivazione e l'assunzione di PMN / monociti nello spazio bronco alveolare. Le cellule rispondono con un completo spargimento di L-selectina quando si muove dal sangue nello spazio bronco alveolare. - trombosi venosa profonda (DVT): La partecipazione dei PMN nell'iniziazione e nella propagazione della trombosi venosa. Probabilmente attraverso le leucociti di L-selectina aderiscono a zone di vene che servono da siti per l'innesco di trombi. - HIV: i pazienti affetti da infezione da HIV hanno mostrato livelli elevati di sl-selectina nel siero - diabete mellito dipendente dall'insulina (IDDM): i livelli sierici di L-selectina sono risultati elevati nei pazienti IDDM e nei soggetti a rischio di sviluppo di IDDM. - Sindrome di Kawasaki: i livelli di sl-selectina sembrano essere inferiori a quelli normali. - Popolazioni maligne delle cellule B: leucemia linfocitaria cronica delle cellule B, leucemia delle cellule pelose e linfoma della zona mantello sono positive di L-selectin. - infezione batterica neonatale: in caso di infezione intra-uterina i linfociti ottenuti dal sangue del cordone hanno una diminuzione dell'espressione di L-selenina. Questo è indipendente dall'età gestazionale, dal peso della nascita, dal ph dell'arteria ombelicale, dall'ematocrito, dal numero di leucociti, dal numero di neutrofili assoluto, dal livello di CRP o dalla febbre materna. - sepsi: i pazienti affetti da sepsi hanno mostrato livelli elevati di sl-selectina nel siero. La lesione endoteliale vascolare osservata in una sepsi può essere causata da enzimi derivati da neutrofili. Aderenza all'endotelio è un presupposto per questo processo. La misurazione di sl-selectina può fornire ulteriori approfondimenti sull'interazione tra l'attivazione dei neutrofili e il danno endoteliale nella sepsi gramnegativa. - chirurgia: i pazienti sottoposti a chirurgia a bypass cardiopolmonare possono sviluppare una perdita capillare postoperatoria acuta, a causa di infortuni endoteliali causati da neutrofili aderenti. In questi pazienti la L-selectina è completamente persa in una piccola ma progressivamente crescente percentuale di PMN, che potrebbe essere responsabile per i danni endoteliali (24) 2 / 8

4 3. Principio del Test I micropozzetti vengono rivestiti con un anticorpo di rivestimento anti- sl-selectin umano. Figura Micropozzetto Rivestito Il sl-selectin umano presente nel campione o nello standard si lega agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti e vi viene aggiunto l anticorpo sl-selectin anti-umano coniugato con l HRP, che si lega all sl-selectin umano catturata dal primo anticorpo. Figura 2 Anticorpo di Rivestimento Prima Incubazione Standard o Campione Coniugato HRP Dopo l incubazione, il sl-selectin anti-umano coniugato all HRP e non legato viene rimosso con una fase di lavaggio e ai pozzetti viene aggiunta una soluzione di substrato reattiva all HRP. Figura 3 Seconda Incubazione In proporzione alla quantità di sl-selectin umano presente nel campione o nello standard si forma un prodotto colorato. La reazione viene terminata aggiungendo l acido e l assorbanza si misura a 450 nm. Si prepara una curva standard sulla base di 7 diluizioni standard di sl-selectin umano e si determina la concentrazione della sl-selectin umano. Figura 4 Substrato Substrato post-reazione (24) 3 / 8

5 4. Reagenti Forniti busta d alluminio con Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpi monoclonale anti- sl-selectin umana flaconcino (6mL) con Coniugato-HRP (anticorpi monoclonale anti- sl-selectin umana) 2 flaconcini con Standard sl-selectin umana liofilizzati, 50 ng/ml dopo ricostituzione flaconcino (50 ml) con Diluente dei Campioni flaconcino (50 ml) di Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata 20x (PBS con %Tween 20) flaconcino (5 ml) di Soluzione di Substrato (tetrametil-benzidina) flaconcino (5 ml) di Soluzione Bloccante (Acido fosforico M) flaconcino (0.4 ml) di colorante blu flaconcino (0.4 ml) di colorante verde 2 Copripiastra Adesivi 5. Istruzioni di Conservazione Conservare i reagenti del kit a 2-8 C. Subito dopo l'uso riporre i reagenti nel luogo di conservazione a 2-8 C. La scadenza del kit e dei reagenti è indicata sulle etichette. La data di scadenza dei componenti del kit può essere garantita solo se questi sono conservati correttamente e, in caso di uso ripetuto di un componente, il reagente non è stato contaminato durante la prima manipolazione. 6. Prelievo e conservazione dei Campioni Con questo dosaggio sono stati testati i supernatanti delle colture cellulari, il siero, il plasma (EDTA, citrato, eparina) ed il liquido amniotico. Altri campioni biologici potrebbero essere idonei all uso per questo dosaggio. Dopo la coagulazione e la separazione, rimuovere il siero o plasma dal coagulo o gli cellulas il più presto possibile. Fare attenzione ad un possibile Effetto Hook dovuto ad alte concentrazioni nei campioni (vedi capitolo ). I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio. Non usare campioni emolizzati in maniera grossolana, o lipemici. I campioni devono essere aliquotati e conservati sotto zero a -20 C, per evitare la perdita di MCP- umano bioattivo. Se i campioni devono essere usati entro 24 ore, possono essere conservati a una temperatura tra 2 C ed 8 C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto 3.5). Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelato dev essere portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela (24) 4 / 8

6 7. Materiali necessari ma non forniti Pipette graduate da 5 ml e 0 ml Micropipette adattabili da 5 µl a 000 µl a canale singolo, con punte usa e getta Micropipette adattabili da 50 µl to 300 µl multicanale con punte usa e getta Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico. Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (lunghezza d onda di riferimento 620 nm) Acqua bidistillata o deionizzata Calcolatore statistico con programma che esegua l analisi di regressione 8. Precauzioni per l Uso - Tutti i prodotti chimici vanno considerati come potenzialmente pericolosi. Raccomandiamo, perciò, l'utilizzo di questo prodotto solo da personale addestrato alle tecniche di laboratorio e che siano avvezze alle comuni pratiche di laboratorio. Indossare abbigliamento idoneo come camici, guanti ed occhiali. Attenzione ad evitare contatto con la pelle e gli occhi. Nel caso di contatto con pelle o occhi, immediatamente lavare con acqua. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per specifici consigli. - I reagenti sono per uso in vitro diagnostico e non sono per uso terapeutico. - Non mischiare tra loro reagenti di diversi lotti o provenienza. - Non usare i kit dopo la data di scadenza. - Non esporre i reagenti del kit, durante la conservazione e incubazione a forti fonti di luce. - Non pipettare utilizzando la bocca. - Non mangiare o fumare nell'area dove sono utilizzati i reagenti dei kit o i campioni. - Evitare il contatto dei reagenti o campioni con la pelle o le mucose. - Guanti di gomma o lattice dovrebbero essere sempre indossati quando si usano reagenti e campioni. - Evitare il contatto tra il substrato del kit e agenti ossidanti e metallo. - Evitare schizzi o produzione di aereosol. - Per evitare contaminazione microbica o cross-contaminazione dei reagenti o dei campioni che invaliderebbero il test, usare sempre pipette e puntali mono-uso. - Usare vaschette pulite e dedicate per la dispensare il reagente substrato. - L'esposizione agli acidi inattiva il coniugato. - Acqua distillata o de-ionizzata deve essere utilizzata per la preparazione dei reagenti. - La soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente prima dell'utilizzo. - Decontaminare ed eliminare i campioni e tutto il materiale potenzialmente contaminante perchè potrebbero contenere agenti infettanti. Il metodo preferito per la decontaminazione è l'autoclavaggio per minimo ora a 2.5 C. - Gli scarti liquidi, non contenenti acido e gli scarti neutralizzati possono essere mischiati con sodio ipoclorido in un volume finale di.0 %. Lasciare minimo 30 minuti per l'effettiva decontaminazione. Scarti liquidi contenenti acido devono essere neutralizzati prima dell'aggiunta di sodio ipoclorido (24) 5 / 8

7 9. Preparazione dei Reagenti Prima di cominciare con le procedure del test i concentrati dei tamponi devono essere portati a temperatura ambientale e diluiti alle concentrazioni adeguate. Se i concentrati dei tampone presenta cristalli in sospensione, riscaldare lievemente i tamponi fino a ottenere la completa dissoluzione dei cristalli. 9.. Soluzione Tampone di Lavaggio (x) Versare l'intero contenuto (50 ml) del Tampone di Lavaggio concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 000 ml. Portare il volume finale a 000 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Trasferire il prodotto in una bottiglia pulita e conservare a temperature comprese fra 2 C e 25 C. Il Tampone di Lavaggio (x) è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Lavaggio (x) secondo la tabella seguente: Numero di Strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrato (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) Standard sl-selectin Umano Ricostituire lo Standard sl-selectin umano aggiunendo acqua distillata. Il volume di ricostituzione è indicato sull'etichetta della flaconcino dello standard. Girare o mescolare gentilmente per garantire la completa ed omogenea solubilizzazione (concentrazione dello standard ricostituito = 50 ng/ml). Lasciare lo standard a ricostituire per 0-30 minuti. Prima di fare le diluizione mescolare bene. La diluizione dello standard può essere fatto direttamente nella piastra (vedi 0.d.) oppure nei tubi (vedi 9.4.) (24) 6 / 8

8 9.2.. Diluzione Standard Esterna Etichettare 7 tubi, uno per ogni punto dello standard. S, S2, S3, S4, S5, S6, S7. Preparare diluizioni seriali :2 per lo standard nel seguente modo: Pipettare 225 ul di Tampone di Dosaggio (x) a tutti tubi. Pipettare 225 µl di standard ricostituito (concentrazione dello standard = 50 ng/ml) nel primo tubo, etichettato S, e mescolare (concentrazione dello standard = 25 ng/ml). Pipettare 225 µl di questa diluizione nel secondo tubo, etichettato S2 e mischiare accuratamente prima del successivo transferimento. Ripetere le 5 diluizioni seriali in modo da creare i punti della curva di calibrazione (vedere figura 5). Il Tampone di Dosaggio (x) serve come bianco. Figura 5 Transferire 225 µl S S2 S3 S4 - S7 Standard sp-selectin Umano ricostituito Tampone di Dosaggio (x) 225 µl Buttare 225 µl 9.3. Aggiunta di reagenti a colori: Blu-Dye, Verde-Dye Al fine di aiutare i nostri clienti ad evitare errori nel pipettare gli ELISA, offriamo uno strumento che aiuta a monitorare l'aggiunta di volumi anche molto piccoli di una soluzione alla reazione dando colori distintivi ad ogni passaggio della procedura ELISA. Questa procedura è opzionale, non interferisce in alcun modo con i risultati del test e è progettata per aiutare il cliente con le prestazioni del test, ma può anche essere omesso, semplicemente seguendo il libretto di istruzioni. In alternativa, le soluzioni coloranti provenienti dagli stock disponibili (Blue-Dye, Green-Dye) possono essere aggiunti ai reagenti secondo le seguenti linee guida:. Diluente dei Campioni: Prima della diluizione standard e campione aggiungere il Blue- Dye ad una diluizione di : 250 (vedi tabella di seguito) al Diluente appropriato (x) secondo la prova protocollo. Dopo l'aggiunta di Blue-Dye, procedere Secondo il libretto d'istruzione. 5 ml Diluente dei Campioni (x) 20 µl Colorante Blu 2 ml Diluente dei Campioni (x) 48 µl Colorante Blu 50 ml Diluente dei Campioni (x) 200 µl Colorante Blu (24) 7 / 8

9 2. HRP-Conjugate: Aggiungere la tinta verde ad una diluizione di : 00 (Tabella di seguito) al HRP-Conjugate, pronto all'uso 9.4. Controlli 3 ml HRP-Conjugate 30 μl Colorante Verde 6 ml HRP-Conjugate 60 μl Colorante Verde 2 ml HRP-Conjugate 20 μl Colorante Verde Ricostituire aggiungendo 00 μl di acqua distillata ai controlli liofilizzati (0-30 minuti). Centrifugare o mescolare con cautela per garantire una solubilizzazione completa ed omogenea. Per il resto trattare i controlli come i vostri campioni nel dosaggio. Per il range di controllo fare riferimento al certificato di analisi o all etichetta del flaconcino. Conservare i controlli ricostituiti aliquotati a -20 C. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. 0. Procedura del Test a. Prediluire i campioni prima di iniziare con la procedura di prova. Diluire campioni di siero, plasma e cellula di campione : 00 con Diluente di campione secondo il seguente schema: Diluizione : 0 μl di campione + 90 μl Diluente del campione Diluizione 2: 50 μl di diluizione μl Diluente del campione b. Determinare il numero di strip micropozzetti necessario a testare il numero desiderato di campioni, oltre al numero idoneo di pozzetti necessari per eseguire i bianchi e gli standard. Ogni campione, standard, bianco e campione di controllo opzionale dev essere dosato in duplicato. Rimuovere dal supporto le strip micropozzetti non usate e conservarle insieme all essiccante fornito nella bustina metallica, chiusa ermeticamente a una temperatura di 2-8 C. c. Lavare le strip micropozzetti due volte con un Tampone di Lavaggio di circa 400 μl per ogni pozzetto; aspirare completamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l altro. Prima di aspirare, lasciare il tampone di lavaggio all interno dei pozzetti per circa 0 5 secondi prima dell aspirazione. Fare attenzione a non scalfire la superficie dei pozzetti. Dopo l ultima fase di lavaggio, svuotare i pozzetti e picchiettare le strip micropozzetti su carta assorbente o su una salvietta di carta per rimuovere il Tampone di Lavaggio in eccesso. Usare le strip micropozzetti immediatamente dopo il lavaggio. In alternativa, le strip micropozzetti possono essere collocate capovolte su una carta assorbente bagnata per non oltre5 minuti. Non lasciar asciugare i pozzetti. d. Diluizione standard sulla piastra per micropozzetti (In alternativa, la diluzione standard si può preparare in tubi - vedi 9.2.): Aggiungere 00 μl Tampone per Dosaggio (x), in duplicato, a tutti i pozzetti degli standard. Pipettare 00 μl di standard preparato (vedi Preparazione dello Standard 9.5, concentrazione = 50 ng/ml), in duplicato, nei pozzetti A ed A2 (vedi Tavola ). Mescolare il contenuto dei pozzetti A e A2 aspirando ed espellendo ripetutamente (concentrazione dello standard S = 25.0 ng/ml) e trasferire 00 μl rispettivamente nei pozzetti B e B2 (vedi Figura 7). Fare attenzione a non scalfire la superficie interna dei pozzetti. Ripetere la procedura 5 volte creando due serie di diluizioni standard di MMP-9 umana con un range da 50.0 a 0.4 ng/ml. Eliminare 00 μl del contenuto degli ultimi micropozzetti (G, G2) usati (24) 8 / 8

10 Figura 6 Transferire 00 µl S S2 S3 S4 - S7 Standard sl-selectin Umano Ricostituito Tampone di Dosaggio (x) 00 µl Buttare 00 µl In caso di diluizione esterna dello standard (vedi 9.2.) pipettare 00 µl di queste diluizioni standard (S S7) nei pozzetti degli standard come da Tavola. Tavola Tavola rappresenta un esempio dell'organizzazione dei bianchi, standardi e campioni nei pozzetti: A B C D E F G Standard (25.0 ng/ml) Standard 2 (2.5 ng/ml) Standard 3 (6.3 ng/ml) Standard 4 (3.2 ng/ml) Standard 5 (.6 ng/ml) Standard 6 (0.8 ng/ml) Standard 7 (0.4 ng/ml) Standard (25.0 ng/ml) Standard 2 (2.5 ng/ml) Standard 3 (6.3 ng/ml) Standard 4 (3.2 ng/ml) Standard 5 (.6 ng/ml) Standard 6 (0.8 ng/ml) Standard 7 (0.4 ng/ml) Campione Campione Campione 2 Campione 2 Campione 3 Campione 3 Campione 4 Campione 4 Campione 5 Campione 5 Campione 6 Campione 6 Campione 7 Campione 7 H Bianco Bianco Campione 8 Campione 8 e. Dispensare 00 µl di Tampone di Dosaggio (x) in duplicato ai pozzetti de bianco. f. Dispensare 50 µl di Tampone di Dosaggio (x) in duplicato ai pozzetti dei campioni. g. Dispensare 50 µl di ogni campione in duplicato ai pozzetti dei campioni. h. Dispensare 50 µl di Coniugato-HRP a ciascun pozzetto. i. Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (8-25 C) per 2 ore, utilizzando, se disponibile, su un agitatore mecanico a 400 rpm. j. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 3 volte come descritto in punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo. k. Pipettare 00 µl di Soluzione di Substrato TMB in tutti i pozzetti. l. Incubare le strisce a temperatura ambiente (8-25 C) per circa 0 minuti. Evitare l'esposizione (24) 9 / 8

11 diretta a luci intense. È necessario monitorare i valori D.O. a livello della piastra e interrompere la reazione del substrato (vedi il punto prossimo del protocollo) prima che i pozzetti positivi cessino di essere appropriatamente registrabili. La determinazione del tempo necessario per lo sviluppo del colore dev'essere fatto per ogni singolo parametro. Si raccomanda di aggiungere la soluzione di stop quando lo standard più elevato ha sviluppato un colore blu scuro. Alternativamente lo sviluppo del colore può essere monitorato con un lettore ELISA a 620 nm. La reazione del substrato deve essere bloccata non appena viene misurato un valore della DO di m. Interrompere la reazione enzimatica pipettando rapidamente 00 µl di Soluzione Stopp in ciascun pozzetto, inclusi i pozzetti del bianco. È importante che la soluzione bloccante si diffonda rapidamente e uniformemente attraverso i micropozzetti per inattivare completamente l'enzima. I risultati devono essere letti immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione bloccante o entro ora se le strip sono conservate in un luogo buio a 2-8 C. n. Leggere l'assorbanza di ciascun micropozzetto su uno spettrofotometro che utilizza 450 nm come lunghezza d'onda primaria (620 nm come lunghezza d'onda di riferimento alternativa; valori da 60 nm a 650 nm sono accettabili). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del produttore e utilizzando i pozzetti del bianco. Determinare l'assorbanza sia dei campioni, sia degli standard. Note: In caso di incubazione senza agitazione i valori di densità ottica (D.O.) potranno essere più bassi di quanto indicato sotto. Tuttavia i risultati saranno da ritenersi validi.. CALCOLO DEI RISULTATI - Calcolare i valori medi dell assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati devono rientrare nel 20 % del valore medio. - Creare una curva standard segnando l assorbanza media di ogni concentrazione standard sull ordinata contro la concentrazione di sl-selectin umano sull ascissa. Disegnare una curva di bestfit congiungendo i punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri). - Per determinare la concentrazione di sl-selectin umano circolante per ogni campione, trovare prima il valore medio di assorbanza sull ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva standard. Nel punto d intersezione estendere una linea verticale fino all ascissa e leggere il valore corrispondente della concentrazione di sl-selectin umano. - Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni di colture celulai sono stati diluiti :200 (:00 prediluizione esterna, diluzione :2 sulla micropozzetti: 50µL campione + 50µL Tampone di Dosaggio (x)) la concentrazione letti dalla curva standard deve essere moltiplicata per la diluizione fattore (x200). - Il calcolo di campioni prediluati : 00 con una concentrazione superiore al livello può determinare livelli corretti e bassi di sl-selenina umana (Hook Effect). Tali campioni richiedono ulteriori prediluzioni esterne secondo i valori previsti di sl-selenina umani con il campione di diluente, al fine di quantificare con precisione il livello effettivo di sl-selenina umana. - Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione di sl-selectin umano conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i valori ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non essere validi. - La Figura 7 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per dedurne risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di strisce per micropozzetti su cui si fa il dosaggio (24) 0 / 8

12 Figura 7 Curva standard rappresentativa per l sl-selectin umano ELISA. Il sl-selectin umano è stato diluito in 2 fasi seriali nel Tampone di Dosaggio (x). Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva standard dev essere eseguita per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio. 0 Absorption 450 nm Concentration (ng/ml) (24) / 8

13 Tavola 2 Dati tipici relativi all uso dell sl-selectin umano ELISA Lunghezza d onda: 450 nm Lunghezza d onda di riferimento: 620 nm Standard Concentrazione sl-selectin Umano (ng/ml) D.O. (450 nm) Bianco D.O. Media (450 nm) C.V. (%) I valori DO della curva standard possono variare a seconda delle condizioni di prestazione del dosaggio (ad es.: operatore, tecnica di pipettaggio o effetti della temperatura). Inoltre, il periodo di validità del kit può influenzare l attività enzimatica e quindi l intensità del colore. I valori misurati sono ancora validi. 2. LIMITI DELLA PROCEDURA - Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva standard per ogni esecuzione del test. - La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione crociata tra reagenti può casusare risultati erronei. - Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro riutilizzabili devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell uso. - Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o falsi negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la Soluzione di Lavaggio fresca, riempire con il Tampone di Lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti scoperti, o non permettere che si asciughino per periodi prolungati. - L uso della radioimmunoterapia ha aumentato significativamente il numero di pazienti con anticorpi umani IgG anti-topo (HAMA). HAMA può interferire con dosaggi che utilizzano anticorpi monoclonali murini, portando sia a risultati falsi positivi, sia falsi negativi. I campioni di siero contenenti anticorpi delle immunoglobuline murine possono essere ancora analizzati in questi dosaggi quando le immunoglobuline murine (siero, liquido ascitico o anticorpi monoclonali di specificità irrilevante) vengono aggiunti al campione (24) 2 / 8

14 3. Caratteristiche di Prestazione 3.. Sensibilità Il limite di rilevamento della sl-selectin umano definito come la concentrazione dell analita, risultante in un assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più 2 deviazioni standard), è stato determinato di 0.98 ng/ml (media di 6 dosaggi indipendenti) Riproducibilità Intra-Dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di sl-selectin umano. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di sl-selectin umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 3). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 3.7 %. Tavola 3 La concentrazione media di sl-selectin umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione Campione Esperimento Concentrazione media di slselectin umano (pg/ml) Coefficiente di Variazione (%) (24) 3 / 8

15 Inter-Dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di sl-selectin umano. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di sl-selectin umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 4). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 4.2 %. Tavola 4 La concentrazione media di sl-selectin umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione: Campione Concentrazione media di Coefficiente di sl-selectin Umano (pg/ml) Variazione (%) Test di Recupero Il test di recupero è stato valutato addizionando 3 livelli di sl-selectin umano al siero, plasma e supernatanti di colture cellulari. Le ricompense sono state determinate in 3 esperimenti indipendenti con 6 repliche ciascuna. La quantità di sl-selectin umano endogeno in campioni non addizionati è stata sottratta dai valori del test. Vedi Tavola 5 per i dati di recupero. Tavola 5 Esperimento Spike alto (%) Spike médium (%) Spike basso (%) 3.4. Parallelismo della Diluizione 4 campioni di siero con diversi livelli di sl-selecitin umano sono stati analizzati in diluizioni seriali multiple di 2 e con 4 replicati l uno. Il recupero rientrava in un range dal 82% al 96 % con un recupero medio complessivo del 89% (vedere Tavola 6) (24) 4 / 8

16 Tavola 6 Campione Diluizione :200 :400 :800 :600 :200 :400 :800 :600 :200 :400 :800 :600 :200 :400 :800 :600 Concentrazione Attesa di sl-selectin Umano (pg/ml) Concentrazione Misurata di sl-selectin Umano (pg/ml) Recupero di Concentrazione Attesa di sl-selectin Umano (%) Stabilità dei Campioni Stabilità a Congelamento - Scongelamento Aliquote di campioni di siero (non addizionati o addizionati) sono stati conservati a -20 C e scongelati 5 volte e sono stati determinati i livelli di sl-selectin umano. Con il congelamento e lo scongelamento non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività del sl-selectin umano Stabilità della Conservazione Aliquote di campioni di siero (addizionati o non addizionati) sono state conservate a -20 C, 2-8 C, a temperatura ambiente (TA) ed a 37 C e il livello di sl-selectin umano ne è stato determinato dopo 24 ore. Durante la conservazione alle condizioni sopraindicate non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività del sl-selectin umano Specificità Il saggio rileva sia sl-selenin umana naturale che ricombinante. L'interferenza di IL-8, sicam-, stnf-r, TNF-a, TNF-b, CD8, IL-2, IL-2R, IL-6, IL-6R, IL- CD44 e HER-2 sono stati valutati colpendo queste proteine a concentrazioni fisiologicamente rilevanti in un siero umano sl-selectin umano. Non è stata rilevata una crossreattività (24) 5 / 8

17 3.7. Valori Attesi Per la IL-22 umana è stato testato un pannello di 40 campioni di siero di donatori apparentemente sani (maschi e femmine) selezionati casualmente (random). I livelli misurati possono variare con la raccolta di campioni usata. Per i livelli di sil-2r umana misurati vedi la Tavola 7. Tavola 7 Matrice di Campione Numero di Campioni Valutati Intervallo (pg/ml) Media (pg/ml) Siero Plasma (EDTA) Plasma (Citrato) Plasma (Eparina) Per la sl-selectin umana è stato testato un pannello di 22 campioni di siero di donatori apparentemente sani (maschi e femmine) selezionati casualmente (random). I livelli sl-selectin umani rilevati sono compresi tra e ng/ml con un livello medio di ng/ml e una deviazione standard di 68,9 ng/ml. 4. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI Per gli ordini contattare: Per informazioni tecniche contattare: Vedi ultima pagina. IBL@IBL-International.com (24) 6 / 8

18 5. Sommario: Preparazione dei Reagenti 5.. Soluzione Tampone di Lavaggio (x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Lavaggio 20x (50 ml) a 950 ml di acqua distillata. Numero di strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (ml) Standard sl-selectin Umano Reconstituire il Standard liofilizzato di sl-selectin umano con acqua distillata. (Il volume di ricostituzione è dichiarato sull etichetta del flaconcino dello standard.) 6. Sommario di Procedura del Test. Campione prediligente con Diluente Campione : Determinare il numero di strisce di micropozzetti richiesto. 3. Lavare le strisce di micropozzetti due volte con il Tampone di Lavaggio. Acqua Distillata (ml) 4. Diluizione standard sulla piastra di micropozzetti: Aggiungere 00 μl di Tampone di Dosaggio (x), in duplicato, a tutti i pozzetti standard. Pipettare 00 μl di standard preparato nei primi pozzetti e creare diluizioni di standard trasferendo 00 μl da pozzetto a pozzetto. Scartare 00 μl dagli ultimi pozzetti. Alternativamente diluizione esterna dello standard in tubi (vedi 9.4..): Pipettare 00 μl di queste diluizioni dello standard nei micropozzetti. 5. Aggiungere 00 μl di Tampone di Dosaggio (x), in duplicati, ai pozzetti del bianco. 6. Aggiungere 50 μl di Tampone di Dosaggio (x)a tutti i pozzetti. 7. Aggiungere 50 μl di campione in duplicato a tutti i pozzetti. 8. Aggiungere 50 μl di Coniugato-HRP a tutti i pozzetti. 9. Coprire le strisce e incubare 2 ore a temperatura ambiente (8-25 C). 0. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 3 volte con il Tampone di Lavaggio. Aggiungere 00 μl di Soluzione di Substrato TMB a tutti i pozzetti. 2. Incubare le strisce di micropozzetti per circa 0 minuti a temperatura ambiente (8-25 C). 3. Aggiungere 00 μl di Soluzione Bloccante a tutti i pozzetti. 4. Azzerare il lettore di micropozzetti e misurare l intensità del colore a 450 nm. Nota bene: Se sono state seguite istruzioni in questo protocollo, i campioni sono stati diluiti : 200 (50 μl di campione prelevato : μl di campionamento del campione), la concentrazione legata dalla curva standard deve essere moltiplicata per il fattore di diluizione (x 200) (24) 7 / 8

19 7. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO. Klein, N. J.; Levin, M.; Strobel, S.; Finn, A.. Degradation of glycosaminoglycans and fibronectin on endotoxin-stimulated endothelium by adherent neutrophils: relationship to CDb/CD8 and L-selectin expression. J.Infect.Dis. 993; 67: Foxall, C.; Watson, S. R.; Dowbenko, D.; Fennie, C.; Lasky, L. A.; Kiso, M.; Hasegawa, A.; Asa, D.; Brandley, B. K.. The three members of the selectin receptor family recognize a common carbohydrate epitope, the sialyl Lewis(x) oligosaccharide. J.Cell Biol. 992; 7: Smith, C. W.; Kishimoto, T. K.; Abbassi, O.; Hughes, B.; Rothlein, R.; McIntire, L. V.; Butcher, E.; Anderson, D. C.. Chemotactic factors regulate lectin adhesion molecule (LECAM-)- dependent neutrophil adhesion to cytokine-stimulated endothelial cells in vitro. J.Clin.Invest 99; 87: Hogg, N.. Roll, roll, roll your leucocyte gently down the vein. Immunol.Today 992; 3: Moller, P.; Eichelmann, A.; Leithauser, F.; Mechtersheimer, G.; Otto, H. F.. Venular endothelium binding molecules CD44 and LECAM- in normal and malignant B-cell populations. A comparative study. Virchows Arch.A Pathol.Anat.Histopathol. 992; 42: Lampeter, E. R.; Kishimoto, T. K.; Rothlein, R.; Mainolfi, E. A.; Bertrams, J.; Kolb, H.; Martin, S.. Elevated levels of circulating adhesion molecules in IDDM patients and in subjects at risk for IDDM. Diabetes 992; 4: Jutila, M. A.; Kishimoto, T. K.; Finken, M.. Low-dose chymotrypsin treatment inhibits neutrophil migration into sites of inflammation in vivo: effects on Mac- and MEL-4 adhesion protein expression and function. Cell Immunol. 99; 32: Tozeren, A.; Ley, K.. How do selectins mediate leukocyte rolling in venules?. Biophys.J. 992; 63: Gory, S.; Dalmon, J.; Prandini, M. H.; Kortulewski, T.; de, Launoit Y.; Huber, P.. Requirement of a GT box (Sp site) and two Ets binding sites for vascular endothelial cadherin gene transcription. J.Biol.Chem. 998; 273: Schleiffenbaum, B.; Spertini, O.; Tedder, T. F.. Soluble L-selectin is present in human plasma at high levels and retains functional activity. J.Cell Biol. 992; 9: Finn, A.; Moat, N.; Rebuck, N.; Klein, N.; Strobel, S.; Elliott, M.. Changes in neutrophil CDb/CD8 and L-selectin expression and release of interleukin 8 and elastase in paediatric cardiopulmonary bypass. Agents Actions 993; 38 Spec No:C44-C Von Andrian,U.H.; Hansell,P.; Chambers,J.D.; Berger,E.M.; Torres,Filho,I; Butcher,E.C.; Arfors, K. E.. L-selectin function is required for beta 2-integrin-mediated neutrophil adhesion at physiological shear rates in vivo. Am.J.Physiol 992; 263:H034-H Stewart, G. J.. Neutrophils and deep venous thrombosis. Haemostasis 993; 23 Suppl : Zimmerman, G. A.; Prescott, S. M.; McIntyre, T. M.. Endothelial cell interactions with granulocytes: tethering and signaling molecules. Immunol.Today 992; 3: Spertini, O.; Schleiffenbaum, B.; White-Owen, C.; Ruiz, P., Jr.; Tedder, T. F.. ELISA for quantitation of L-selectin shed from leukocytes in vivo. J.Immunol.Methods 992; 56: Kishimoto, T. K.; Jutila, M. A.; Berg, E. L.; Butcher, E. C.. Neutrophil Mac- and MEL-4 adhesion proteins inversely regulated by chemotactic factors. Science 989; 245: Buhrer, C.; Luxenburger, U.; Metze, B.; Kattner, E.; Henze, G.; Dudenhausen, J. W.; Obladen, M.. Diminished cord blood lymphocyte L-selectin expression in neonatal bacterial infection. Eur.J.Pediatr. 993; 52: (24) 8 / 8

20 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. CONTENUTI: I reclami possono essere presentati inizialmente scritti o vocali. Successivamente devono essere completati in modo scritto includendo le prestazioni del test ed i risultati se si riferiscono a reclami per ragioni analitiche. GARANZIA: Il prodotto è garantito per essere esente da difetti dei materiali entro la specifica data di conservazione ed in modo conforme alle specifiche fornite con il prodotto. Il prodotto deve essere utilizzato secondo l'uso previsto, tutte le istruzioni riportate nelle istruzioni per l'uso e entro la data di scadenza del prodotto. Qualsiasi modifica della procedura di prova o lo scambio o la miscelazione di componenti di diversi lotti potrebbero avere effetti negativi sui risultati. Questi casi invalidano qualsiasi richiesta di sostituzione. LIMITAZIONE DI RESPONSABILITÀ: IN TUTTE LE CIRCOSTANZE, LA RESPONSABILITÀ DEL FABBRICANTE È LIMITATA AL PREZZO D'ACQUISTO DEL/DEI KIT IN QUESTIONE. IN NESSUN CASO IL PRODUTTORE SARÀ RESPONSABILE PER QUALSIASI DANNO INCIDENTALE O CONSEQUENZIALE, COMPRESI I DANNI PER PERDITA DI PROFITTO, SALUTE, DANNI PER PERSONE O PROPRIETÀ O ALCUNA ALTRA PERDITA INCIDENTALE O CONSEQUENZIALE. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: - IBL@IBL-International.com WEB: Symbols Version 4.5 (it) /