Interleukin-2 BE C. Istruzioni per l Uso

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1 Istruzioni per l Uso Interleukin-2 high sensitivity ELISA Dosaggio immunoenzimatico (strisce di micropiastra) per la determinazione quantitativa di Interleuchina-2 (IL-2) nel siero, plasma e supernatanti di colture cellulari umani. BE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 INFORMAZIONI SUL PRODOTTO E MANUALE 1. USO PREVISTO 2 2. SOMMARIO 2 3. PRINCIPIO DEL TEST 3 4. PRINCIPIO DI REAZIONE DI AMPLIFICAZIONE 5 5. REAGENTI FORNITI 5 6. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE 6 7. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI 6 8. MATERIALI NECESSARI MA NO FORNITI 6 9. PRECAUZIONI PER L USO PREPARAZIONE DEI REAGENTI PROCEDURA DEL TEST CALCOLO DEI RISULTATI LIMITI DELLA PROCEDURA CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE INFORMAZIONI PER GLI ORDINI SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST (27) 1/22

3 1. Uso Previsto L IL-2 umana ELISA è un dosaggio immunoassorbente legato a enzimi per il rilevamento quantitativo della IL-2 umana. L IL-2 umana ELISA è esclusivamente a uso della ricerca. Non si usa per procedure diagnostiche o terapeutiche. 2. Sommario L Interleuchina-2 (IL-2) gioca un ruolo fondamentale nell attivazione e nella proliferazione dei linfociti in seguito al priming degli antigeni. L IL-2 ha un ruolo fondamentale nell espansione della maggior parte delle cellule T, delle cellule natural killer e delle B-cellule durante alcune fasi del loro responso. L IL-2 è una glicoproteina 15 kda codificata da un singolo gene collocato nella regione q26-28 del cromosoma 4 umano. Il polipeptide dedotto dal cdna consiste di 153 amminoacidi. L espressione del gene IL-2 a livello dell attivazione trascrizionale è regolata da vari percorsi. Per l IL-2 indotto in modo autocrino sulla superficie delle T-cellule, la proliferazione antigene-specifica di T-linfociti helper e citotossici in seguito a stimolazione è fortemente dipendente dall espressione dell IL-2, dalla sua secrezione e dal suo legame con i recettori. A parte il suo ruolo principale di mediare la proliferazione dei linfociti T antigene-specifici, l IL-2 modula l espressione dell interferone e dei principali antigeni dell istocompatibilità, stimola la proliferazione e la differenziazione di cellule B attivate, aumenta l attività delle cellule natural killer ed inibisce la formazione di colonie di granulociti-macrofagi. In condizioni fisiologiche e patologiche si sono osservate alterazioni nella capacità delle cellule T di sintetizzare l IL-2. A causa del ruolo essenziale dell IL-2 nella risposta immune, l IL-2 si è dimostrato una molecola molto importante per le sue implicazioni diagnostiche e terapeutiche. L IL-2 viene usato nella terapia contro il cancro, in quando dimostra di avere effetti anti-tumorali. Il monitoraggio dell IL-2 nel siero fornisce una visione più dettagliata in molte situazioni patologiche come cancro, patologie infettive, rigetto di trapianti, sclerosi multipla, artrite reumatoide, lupus eritematoso sistemico e diabete di tipo I (27) 2/22

4 3. Principio del Test I micropozzetti vengono rivestiti con un anticorpo di rivestimento anti-il-2 umana. Figura 1 Micropozzetto Rivestito L IL-2 umana presente nel campione o nello standard si lega agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti. Vi si aggiunge un anticorpo IL-2 umana coniugato di biotina, che si lega con la IL-2 umana catturato dal primo anticorpo. Figura 2 Anticorpo di Rivestimento Prima Incubazione Standard o Campione Coniugato di Biotina Dopo l incubazione, gli anticorpi IL-2 umana coniugati alla biotina non legati vengono rimossi durante una fase di lavaggio. Si aggiunge la streptavidina-hrp che si lega all anticorpo IL-2 umana coniugato alla biotina. Figura 3 Seconda Incubazione Dopo l incubazione, la Streptavidina-HRP non legata viene rimossa con una fase di lavaggio e ai pozzetti viene aggiunta una soluzione reagente di amplificazione I (Tiramina- Biotina). Figura 4 Streptavidina-HRP - Terza Incubazione Biotinyl-Tyramide (27) 3/22

5 Dopo l incubazione il reagente di amplificazione I non legato viene rimosso durante una fase di lavaggio e si aggiunge il reagente di amplificazione II (Streptavidina-HRP). Figura 5 Quarta Incubazione Streptavidin-HRP Dopo l incubazione, il reagente di amplificazione II, non legato, viene rimosso durante una fase di lavaggio e si aggiunge la soluzione del substrato reattiva all HRP. Figura 4 Quinta Incubazione In proporzione alla quantità di IL-2 umana presente nel campione o nello standard si forma un prodotto colorato. La reazione viene terminata aggiungendo l acido e l assorbanza si misura a 450 nm. Si prepara una curva standard sulla base di 7 diluizioni standard di IL-2 umana e si determina la concentrazione del campione di IL-2 umana. Figura 5 Substrato Substrato Reattivo (27) 4/22

6 4. Principio di Reazione di Amplificazione La reazione di amplificazione si basa sulla tecnologia Perkin Elmer Life Sciences TSA (Tyramide Signal Amplification/Segnale di Amplificazione della Tiramina). Il reagente di amplificazione I contiene Tiramina-Biotina. Il HRP converte molecole multiple di Tiramina- Biotina in derivati altamente reattivi (radicali liberi). Questi radicali liberi creano un legame covalente con qualsiasi proteina nel pozzetto. Quindi la quantità di Tiramina-Biotina è proporzionale alla quantità di HRP nel pozzetto. La Tiramina-Biotina non legata dopo l incubazione viene rimossa durante una fase di lavaggio. Il reagente di amplificazione II contiene Streptavidina-HRP, che si lega ai siti della biotina creatisi durante la reazione Tiramina-Biotina, moltiplicando così le molecole di HRP disponibili in superficie per la reazione del substrato. 5. Reagenti Forniti 1 busta d alluminio con Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpi monoclonale anti-il-2 umana 1 flaconcino (70 µl) con Coniugato di Biotina (anticorpo policlonale anti-il-2 umana) 1 flaconcino (150 µl) con Streptavidina-HRP 2 flaconcini con Standard anti-il-2 umana liofilizzato, 2400 pg/ml dopo ricostituzione 1 flaconcino Controllo alto, liofilizzato 1 flaconcino Controllo basso, liofilizzato 1 flaconcino (50 ml) Diluente dei Campioni 1 flaconcino (5 ml) di Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata 20x (PBS con 1 % Tween 20 e 10 % BSA) 1 flaconcino (7 ml) di Diluente di Amplificazione Concentrato (2x) 2 flaconcini (75 µl) di Reagente di Amplificazione I* 2 flaconcini (15 µl) di Reagente di Amplificazione II 2 flaconcini (50 ml) di Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata 20x (PBS con 1 % Tween 20) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione di Substrato 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione Bloccante (Acido fosforico 1 M) 8 Copripiastra Adesivi * il reagente contiene alcool etilico (27) 5/22

7 6. Istruzioni di Conservazione Conservare i reagenti del kit a 2-8 C ecetto gli controlli. Conservare i controlli liofilizzatti a -20 C. Subito dopo l'uso riporre i reagenti nel luogo di conservazione a 2-8 C, gli controlli a -20 C rispettativamente. La scadenza del kit e dei reagenti è indicata sulle etichette. La data di scadenza dei componenti del kit può essere garantita solo se questi sono conservati correttamente e, in caso di uso ripetuto di un componente, il reagente non è stato contaminato durante la prima manipolazione. 7. Prelievo e conservazione dei Campioni Con questo dosaggio sono stati testati i supernatanti delle colture cellulari, il siero ed il plasma (EDTA, eparina e citrato). Altri materiali biologici potrebbero essere idonei all uso per questo dosaggio. Dopo la coagulazione e la separazione, rimuovere il siero o plasma dal coagulo o gli cellulas il più presto possibile. I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio. Non usare campioni emolizzati in maniera grossolana, o lipemici. I campioni devono essere aliquotati e conservati sotto zero a -20 C, per evitare la perdita di IL-2 umana bioattiva. Se i campioni devono essere usati entro 24 ore, possono essere conservati a una temperatura tra 2 C ed 8 C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto 14.5). Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelato dev essere portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela. 8. Materiali necessair ma no forniti Pipette graduate da 5 ml e 10 ml Micropipette adattabili da 5 µl a 1000 µl a canale singolo, con punte usa e getta Micropipette adattabili da 50 µl to 300 µl multicanale con punte usa e getta Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico. Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (lunghezza d onda di riferimento 620 nm) Acqua bidistillata o deionizzata Calcolatore statistico con programma che esegua l analisi di regressione (27) 6/22

8 9. Precauzioni per l Uso - Tutti i prodotti chimici vanno considerati come potenzialmente pericolosi. Raccomandiamo, perciò, l'utilizzo di questo prodotto solo da personale addestrato alle tecniche di laboratorio e che siano avvezze alle comuni pratiche di laboratorio. Indossare abbigliamento idoneo come camici, guanti ed occhiali. Attenzione ad evitare contatto con la pelle e gli occhi. Nel caso di contatto con pelle o occhi, immediatamente lavare con acqua. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per specifici consigli. - I reagenti sono per uso in vitro diagnostico e non sono per uso terapeutico. - Non mischiare tra loro reagenti di diversi lotti o provenienza. - Non usare i kit dopo la data di scadenza. - Non esporre i reagenti del kit, durante la conservazione e incubazione a forti fonti di luce. - Non pipettare utilizzando la bocca. - Non mangiare o fumare nell'area dove sono utilizzati i reagenti dei kit o i campioni. - Evitare il contatto dei reagenti o campioni con la pelle o le mucose. - Guanti di gomma o lattice dovrebbero essere sempre indossati quando si usano reagenti e campioni. - Evitare il contatto tra il substrato del kit e agenti ossidanti e metallo. - Evitare schizzi o produzione di aereosol. - Per evitare contaminazione microbica o cross-contaminazione dei reagenti o dei campioni che invaliderebbero il test, usare sempre pipette e puntali mono-uso. - Usare vaschette pulite e dedicate per la dispensare il reagente substrato. - L'esposizione agli acidi inattiva il coniugato. - Acqua distillata o de-ionizzata deve essere utilizzata per la preparazione dei reagenti. - La soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente prima dell'utilizzo. - Decontaminare ed eliminare i campioni e tutto il materiale potenzialmente contaminante perchè potrebbero contenere agenti infettanti. Il metodo preferito per la decontaminazione è l'autoclavaggio per minimo 1 ora a C. - Gli scarti liquidi, non contenenti acido e gli scarti neutralizzati possono essere mischiati con sodio ipoclorido in un volume finale di 1.0 %. Lasciare minimo 30 minuti per l'effettiva decontaminazione. Scarti liquidi contenenti acido devono essere neutralizzati prima dell'aggiunta di sodio ipoclorido (27) 7/22

9 10. Preparazione dei Reagenti Prima di cominciare con le procedure del test i Concentrati dei Tamponi devono essere portati a temperatura ambientale e diluiti alle concentrazioni adeguate. Se i Concentrati dei Tampone presenta cristalli in sospensione, riscaldare lievemente i tamponi fino a ottenere la completa dissoluzione dei cristalli Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Versare l'intero contenuto (50 ml) del Tampone di Lavaggio Concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 1000 ml. Portare il volume finale a 1000 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Trasferire il prodotto in una bottiglia pulita e conservare a temperature comprese fra 2 C e 25 C. Il Tampone di Lavaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Lavaggio (1x) secondo la tabella seguente: Numero di Strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrato (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Versare l'intero contenuto (5 ml) del Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 100 ml. Portare il volume finale a 100 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Trasferire il prodotto in una bottiglia pulita e conservare a temperature comprese fra 2 C e 8 C. Il Tampone di Dosaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Dosaggio (1x) secondo la tabella seguente: Numero di Strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) Preparazione di Coniugato di Biotina Il Coniugato di Biotina deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione. La Soluzione Coniugato di Biotina concentrata deve essere diluito 1:100 con Diluente dei Campioni in una provetta di plastica pulita secondo la tabella seguente: Numero di Strisce Coniugato di Biotiona (ml) Diluente dei Campioni (ml) (27) 8/22

10 10.4. Streptavidina-HRP La Streptavidina-HRP deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione. La Streptavidina-HRP concentrata deve essere diluita 1:200 con Tampone di Dosaggio (1x) in una provetta di plastica pulita secondo la tabella seguente: Numero di Strisce Streptavidina-HRP (ml) Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Standard IL-2 Umana Ricostituire lo standard IL-2 umana aggiunendo acqua distillata. Il volume di ricostituzione è indicato sull'etichetta della flaconcino dello standard. Girare o mescolare gentilmente per garantire la completa ed omogenea solubilizzazione (concentrazione dello standard ricostituito = 2400 pg/ml). Far ricostituire lo standard per minuti. Prima di fare le diluizione mescolare bene. Dopo l'uso, lo standard rimanente non può essere riutilizzato e deve essere buttato. Lo standard IL-2 umana concentrato dev essere diluito 1:20 con Diluente dei Campioni, subito prima di essere usato, in un tubo di plastica per test pulito, secondo il seguente schema di diluizione: 50 μl di standard IL-2 umana concentrato μl di Diluente dei Campioni. Agitare dolcemente per miscelare. (concentrazione dello standard = 120 pg/ml). La diluizione dello standard può essere fatto direttamente nella piastra (vedi 11.d) oppure nei tubi (vedi ) Diluzione Standard Esterna Etichettare 7 tubi, uno per ogni punto dello standard. S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7. Preparare diluizioni seriali 1:2 per lo standard nel seguente modo: Pipettare 225 ul di Diluente dei Campioni a tutti tubi. Pipettare 225 µl di standard ricostituito (concentrazione dello standard = 120 pg/ml) nel primo tubo, etichettato S1, e mescolare (concentrazione dello standard 1 = 60 pg/ml). Pipettare 225 µl di questa diluizione nel secondo tubo, etichettato S2 e mischiare accuratamente prima del successivo transferimento. Ripetere le 5 diluizioni seriali in modo da creare i punti della curva di calibrazione (vedere figura 8). Il Diluente dei Campioni serve come bianco. Figura 8 Transferire 225 µl S1 S2 S3 S4 - S7 Standard 1:20 diluito IL-2 Umana Diluente dei Campioni 225 µl Buttare 225 µl (27) 9/22

11 10.6. Controlli Ricostituire aggiungendo 1200 μl di acqua distillata ai controlli liofilizzati (10-30 minuti). Centrifugare o mescolare con cautela per garantire una solubilizzazione completa ed omogenea. Pre-diluire il controllo solubilizzato nel Diluente dei Campioni in rapporto 1:10: 100 μl di controllo μl di Diluente dei Campioni. Per il resto trattare i controlli come i vostri campioni nel dosaggio. Per il range di controllo fare riferimento al certificato di analisi o all etichetta del flaconcino. Conservare il controllo ricostituito aliquotato a -20 C. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento Diluente di Amplificazione (1x) La preparazione del Diluente per Amplificazione (1x) è da farsi immediatamente prima dell uso. Fare una diluizione 1:2 del Diluente per Amplificazione (2x) concentrato, secondo le esigenze e secondo la seguente tabella: Numero di Strisce Diluente di Amplificazione (2x) (ml) Acqua Distillata (ml) Soluzione per Amplificazione I La preparazione della Soluzione per Amplificazione I dev essere fatta immediatamente prima dell applicazione sulla piastra. Centrifugare la fiala per alcuni secondi in una microcentrifuga prima di aprirla per raccogliere il liquido che rimane intrappolato nel coperchio. Fare una diluizione 1:200 del Reagente I per Amplificazione nel Diluente per Amplificazione (1x), come necessario, secondo la seguente tabella: Numero di Strisce Reagente di Amplificazione I (ml) Diluente di Amplificazione (1x) (ml) Eliminare immediatamente tutte le Soluzioni per Amplificazione I pre-diluite dopo l uso Soluzione per Amplificazione II La preparazione della Soluzione per Amplificazione II dev essere fatta immediatamente prima dell applicazione sulla piastra. Centrifugare la fiala per alcuni secondi in una microcentrifuga prima di aprirla per raccogliere il liquido che rimane intrappolato nel coperchio. Preparare una diluizione 1:400 del Reagente per Amplificazione II nel Tampone di Dosaggio (1x) come necessario, secondo lo schema seguente: Numero di Strisce Reagente di Amplificazione II (ml) Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Eliminare immediatamente tutte le Soluzioni per Amplificazione II pre-diluite dopo l uso (27) 10/22

12 11. Procedura del Test Poiché questo test ELISA è un sistema estremamente sensibile, per ottenere risultati ottimali del test è assolutamente necessario attenersi con la massima precisione alle istruzioni del manuale (procedura di lavaggio; cronologia delle / e preparazione delle soluzioni; tempi d incubazione)! Nota bene: Le Soluzioni per Amplificazione devono essere preparate immediatamente prima dell applicazione sulla piastra! Per ottenere dal test prestazioni ottimali è estremamente importante lavare i pozzetti in modo adeguato! a. Prediluizione dei campioni: I campioni di siero o plasma si applicano non diluiti. I livelli di IL-2 umana nei supernatanti delle colture cellulari possono variare considerevolmente. Per ogni singolo campione si deve determinare la diluizione ottimale. Per campioni di colture cellulari sconosciuti è utile analizzare campioni sia non diluiti, sia pre-diluiti (ad es.: 1:20-1:50 nel Diluente dei Campioni) in parallelo, coprendo in questo modo, con un dosaggio, un range più ampio. Per essere misurati correttamente, supernatanti delle colture cellulari con concentrazioni molto alte di IL-2 umana richiedono diluizioni alte (ad es. fino ad 1:2000). Questi campioni devono essere pre-diluiti nel rispettivo mezzo di coltura cellulare. La diluizione finale dev essere eseguita nel Diluente dei Campioni secondo lo protocollo. b. Stabilire il numero di strip dei micropozzetti necessarie per analizzare la quantità desiderata di campioni più le strip per i bianchi e gli standard. Tutti i campioni, gli standardi, il bianco e il devono ssere processati in duplicato. Rimuovere dal supporto le strip micropozzetti non utilizzate e conservarle nella bustina metallica contenente la polvere essiccante, mantenendole a 2-8 C e perfettamente sigillate. c. Lavare due volte le strip micropozzetti utilizzando esattamente 400 µl di Tampone di Lavaggio per pozzetto, aspirando accuratamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l'altro. Permettere al tampone di lavaggio di rimanere, nei pozzetti, circa secondi prima dell'aspirazione. Evitare di scalfire la superficie dei micropozzetti. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare le strip micropozzetti con un tampone o carta assorbente per rimuovere il Tampone di Lavaggio in eccesso. Utilizzare le strip subito dopo il lavaggio. Non lasciar asciugare i pozzetti. d. Diluizione dello standard in micropozetti (alternativamente la diluizione dello standard può avvenire in tubi vedi ) Aggiungere 100 µl di Diluente dei Campioni in duplicato a tutti i pozzetti dello standard. Pipettare 100 µl standard preparato (vedi 10.5 Preparazione dello Standard, concentrazione = 120 pg/ml) in duplicato nei pozzetti A1 e A2 (vedi Tavola 1). Mescolare il contenuto dei pozzetti A1 e A2 attraverso ripetute aspirazione ed iniezioni (concentrazione dello standard 1, S1 = pg/ml) e trasferire 100 µl, rispettivamente, ai pozzetti B1 e B2 (vedere Figura 9). Fare attenzione a non graffiare la parte interna dei pozzetti. Continuare questa procedura per 5 volte, creando due colonne di standard in diluizione con concentrazione da a 0.94 pg/ml. Buttare 100 µl del contenuto degli ultimi pozzetti (G1 e G2) (27) 11/22

13 Figura 9 Transferire 100 µl S1 S2 S3 S4 - S7 Standard 1:20 diluito IL-2 Umana Diluente dei Campioni 100 µl Buttare 100 µl In caso di diluizione esterna dello standard (vedi ) pipettare 100 µl di queste diluizioni standard (S1 S7) nei pozzetti degli standard come da Tavola 1. Tavola 1 Tavola rappresenta un esempio dell'organizzazione dei bianchi, standardi e campioni nei pozzetti: A B C D E F G Standard 1 (60.00 pg/ml) Standard 2 (30.00 pg/ml) Standard 3 (15.00 pg/ml) Standard 4 (7.50 pg/ml) Standard 5 (3.75 pg/ml) Standard 6 (1.88 pg/ml) Standard 7 (0.94 pg/ml) Standard 1 (60.00 pg/ml) Standard 2 (30.00 pg/ml) Standard 3 (15.00 pg/ml) Standard 4 (7.50 pg/ml) Standard 5 (3.75 pg/ml) Standard 6 (1.88 pg/ml) Standard 7 (0.94 pg/ml) Campione 1 Campione 1 Campione 2 Campione 2 Campione 3 Campione 3 Campione 4 Campione 4 Campione 5 Campione 5 Campione 6 Campione 6 Campione 7 Campione 7 H Bianco Bianco Campione 8 Campione (27) 12/22

14 e. Dispensare 100 µl di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti de bianco. f. Dispensare 50 µl di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti dei campioni. g. Dispensare 50 µl di ogni muestra in duplicato ai pozzetti dei campioni. h. Preparare il Coniugato di Biotina (vedere 10.3 la preparazione del Coniugato di Biotina) i. Dispensare 50 µl di Coniugato di Biotina a ciascun pozzetto. j. Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 2 ore utilizzando, se disponibile, su un agitatore mecanico a 400 rpm. (Agitare è assolutamente necessario per ottenere prestazioni ottimali del test.) k. Preparare la Streptavidina-HRP (vedere 10.4 la Preparazione di Streptavidina-HRP). l. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 6 volte come descrittoin punto c. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo. m. Dispensare 100 µl di Streptavidina-HRP a tutti i pozzetti, inclusi quelli di bianco. n. Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 1 ora utilizzando, se disponibile, su un agitatore mecanico a 400 rpm. (Agitare è assolutamente necessario per ottenere prestazioni ottimali del test.) o. Preparare la Soluzione per Amplificazione I diluita nel Diluente per Amplificazione (1x) (vedi 10.8 Preparazione della Soluzione per Amplificazione I) immediatamente prima dell uso. p. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 6 volte come descritto in punto c. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo. q. Aggiungere 100 μl di Soluzione per Amplificazione I a tutti i pozzetti, compresi i pozzetti del bianco. r. Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per essattamente 15 minuti utilizzando, se disponibile, su un agitatore mecanico a 400 rpm. s. Preparare la Soluzione per Amplificazione II diluita nel Tampone di Dosaggio (vedi 10.9 Preparazione della Soluzione per Amplificazione II) immediatamente prima dell uso. t. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 6 volte come descritto in punto c. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo. u. Aggiungere 100 μl di Soluzione per Amplificazione II a tutti i pozzetti, compresi i pozzetti del bianco. v. Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per essattamente 30 minuti utilizzando, se disponibile, su un agitatore mecanico a 400 rpm. (Agitare è assolutamente necessario per ottenere prestazioni ottimali del test.) w. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 6 volte come descritto in punto c. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo. x. Pipettare 100 µl di Soluzione di Substrato TMB in tutti i pozzetti. y. Incubare le strisce a temperatura ambiente (18-25 C) per minuti. Evitare l'esposizione diretta a luci intense. È necessario monitorare i valori D.O. a livello della piastra e interrompere la reazione del substrato (vedi il punto prossimo del protocollo) prima che i pozzetti positivi cessino di essere appropriatamente registrabili. La determinazione del tempo necessario per lo sviluppo del colore dev'essere fatto per ogni singolo parametro. Si raccomanda di aggiungere la soluzione di stop quando lo standard più elevato ha sviluppato un colore blu scuro. Alternativamente lo sviluppo del colore può essere monitorato con un lettore ELISA a 620 nm. La reazione del substrato deve essere bloccata non appena viene misurato un valore della DO di (27) 13/22

15 z. Interrompere la reazione enzimatica pipettando rapidamente 100 µl di Soluzione Stopp in ciascun pozzetto, inclusi i pozzetti del bianco. È importante che la soluzione bloccante si diffonda rapidamente e uniformemente attraverso i micropozzetti per inattivare completamente l'enzima. I risultati devono essere letti immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione bloccante o entro 1 ora se le strip sono conservate in un luogo buio a 2-8 C. aa. Leggere l'assorbanza di ciascun micropozzetto su uno spettrofotometro che utilizza 450 nm come lunghezza d'onda primaria (620 nm come lunghezza d'onda di riferimento alternativa; valori da 610 nm a 650 nm sono accettabili). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del produttore e utilizzando i pozzetti del bianco. Determinare l'assorbanza sia dei campioni, sia degli standard. Note: In caso d incubazione senza agitazione i valori di densità ottica (D.O.) potranno essere più bassi di quanto indicato sotto. Tuttavia i risultati saranno da ritenersi validi. 12. CALCOLO DEI RISULTATI - Calcolare i valori medi dell assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati devono rientrare nel 20 % del valore medio. - Creare una curva standard segnando l assorbanza media di ogni concentrazione standard sull ordinata contro la concentrazione di IL-2 umana sull ascissa. Disegnare una curva di best-fit congiungendo i punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri). - Per determinare la concentrazione di IL-2 umana circolante per ogni campione, trovare prima il valore medio di assorbanza sull ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva standard. Nel punto d intersezione estendere una linea verticale fino all ascissa e leggere il valore corrispondente della concentrazione di IL-2 umana. - Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni di colture celulari sono stati diluiti 1:2 (50 µl campione + 50 µl Diluente dei Campioni) ed i controlli 1:20 (50 µl di controllo prediluito 1: µl Diluente dei Campioni). La concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (2x per gli campioni, 20x per gli controlli). - Il calcolo dei campioni con una concentrazione superiore allo Standard 1 può dare per risultato livelli scorretti e bassi di IL-2 umana. Questi campioni richiedono un ulteriore pre-diluizione esterna secondo i valori stimati della IL-2 umana, con un Diluente dei Campioni in modo da quantificare con precisione i livelli reali di IL-2 umana. - Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione di IL-2 umana conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i valori ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non essere validi. - La Figura 10 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per dedurne risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di strisce per micropozzetti su cui si fa il dosaggio (27) 14/22

16 Figura 10 Curva standard rappresentativa per il IL-2 umana ELISA. L IL-2 umana è stata diluita in due fasi seriali nel Diluente dei Campioni. Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva standard dev essere eseguita per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio. Tavola 2 Dati tipici relativi all uso dell IL-2 umana ELISA Lunghezza d onda: 450 nm Lunghezza d onda di riferimento: 620 nm Standard Concentrazione IL-2 umana (pg/ml) D.O. (450 nm) Bianco D.O. Media (450 nm) C.V. (%) I valori DO della curva standard possono variare a seconda delle condizioni di prestazione del dosaggio (ad es.: operatore, tecnica di pipettaggio o effetti della temperatura). Inoltre, il periodo di validità del kit può influenzare l attività enzimatica e quindi l intensità del colore. I valori misurati sono ancora validi (27) 15/22

17 13. LIMITI DELLA PROCEDURA - Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva standard per ogni esecuzione del test. - La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione crociata tra reagenti può casusare risultati erronei. - Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro riutilizzabili devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell uso. - Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o falsi negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la Soluzione di Lavaggio fresca, riempire con il Tampone di Lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti scoperti, o non permettere che si asciughino per periodi prolungati. - L uso della radioimmunoterapia ha aumentato significativamente il numero di pazienti con anticorpi umani IgG anti-topo (HAMA). HAMA può interferire con dosaggi che utilizzano anticorpi monoclonali murini, portando sia a risultati falsi positivi, sia falsi negativi. I campioni di siero contenenti anticorpi delle immunoglobuline murine possono essere ancora analizzati in questi dosaggi quando le immunoglobuline murine (siero, liquido ascitico o anticorpi monoclonali di specificità irrilevante) vengono aggiunti al campione (27) 16/22

18 14. Caratteristiche di Prestazione Sensibilità Il limite di rilevamento dell IL-2 umano definito come la concentrazione dell analita, risultante in un assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più 2 deviazioni standard), è stato determinato di 0.40 pg/ml (media di 6 dosaggi indipendenti) Riproducibilità Intra-Dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 4 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di IL-2 umana. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di IL-2 umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 3). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 5.7 %. Tavola 3 La concentrazione media di IL-2 umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione: Campione Esperimento Concentrazione media di IL-2 Umana (pg/ml) Coefficiente di Variazione (%) (27) 17/22

19 Inter-Dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 4 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di IL-2 umana. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di IL-2 umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 4). Il coefficiente complessivo di variazione inter-dosaggio calcolato è 6.2 %. Tavola 4 La concentrazione media di IL-2 umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione: Campione Concentrazione media di Coefficiente di IL-2 Umana (pg/ml) Variazione (%) Test di Recupero Il test di recupero è stato valutato aggiungendo livelli di IL-2 umana in un pool di siero umano normale e campioni di plasma citrato rispettivamente. I recuperi sono stati determinati nel corso di 2 esperimenti indipendenti, ognuno con 4 replicati. l recupero rientrava in un range dal 76 % al 102 % con un recupero medio complessivo del 92 % Parallelismo della Diluizione 4 campioni di siero con diversi livelli di IL-2 umana sono stati analizzati in diluizioni seriali multiple di 2 e con 4 replicati l uno. Il recupero rientrava in un range dal 88 % al 118 % con un recupero medio complessivo del 101 % (vedi Tavola 5). Tavola 5 Campione Diluizione 1:2 1:4 1:8 1:16 1:2 1:4 1:8 1:16 1:2 1:4 1:8 1:16 1:2 1:4 1:8 1:16 Concentrazione Attesa di IL-2 Umana (pg/ml) Concentrazione Misurata di IL-2 Umana (pg/ml) Recupero di Concentrazione Attesa di IL-2 Umana (%) (27) 18/22

20 14.5. Stabilità dei Campioni Stabilità a Congelamento - Scongelamento Aliquote di campioni di siero e supernatanti di colture cellulari (non addizionati o addizionati) sono stati conservati a -20 C e scongelati 5 volte e sono stati determinati i livelli di IL-2 umana. Non è stata rilevata alcuna riduzione significativa dell immunoreattività di IL-2 umana in seguito a un massimo di tre cicli di congelamento/scongelamento. Una riduzione significativa (20 %) dell immunoreattività di IL-2 umana è stata rilevata in seguito a ulteriori cicli di congelamento/scongelamento Stabilità della Conservazione Aliquote di campioni di siero e di supernatanti di colture cellulari (aggiunti o non aggiunti) sono state conservate a -20 C, 2-8 C, a temperatura ambiente (TA) ed a 37 C e il livello di IL-2 umana ne è stato determinato dopo 24 ore. Durante la conservazione a -20 C, 2-8 C ed a temperatura ambiente (TA) non si è rilevata una perdita significativa d immunoreattività della IL-2 umana. Si è rilevata una perdita significativa (20 %) d immunoreattività della IL-2 umana durante la conservazione a 37 C dopo 24 ore Comparazione di Siero e Plasma Di vari individui sono stati valutati il siero e l EDTA, il citrato ed il plasma eparinato ottenuti nello stesso momento temporale. Le concentrazioni di IL-2 umana non erano significativamente diverse; quindi tutti questi fluidi corporei sono idonei al dosaggio. Tuttavia, è altamente raccomandato di garantire l uniformità delle preparazioni del sangue Specificità L interferenza dei fattori circolanti del sistema immune è stata valutata aggiungendo queste proteine in concentrazioni fisiologicamentre rilevanti ad un siero IL-2 umana positivo. Non è stata rilevata alcuna crossreattività Valori Attesi In donatori sani non si sono trovati livelli rilevabili di IL-2 umana. Livelli elevati di IL-2 umana dipendono dal tipo di malattia immunologica Calibrazione Questo dosaggio immune è calibrato con IL-2 umana ricombinante altamente purificato, valutato in base allo standard di riferimento internazionale NIBSC 86/504 ha dimostrato di essere il suo equivalente. Il NIBSC 86/504 è quantificato in unità internazionali (IU); 1IU corrisponde a 76 pg di IL-2 umana. 15. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI Per gli ordini contattare: Vedi ultima pagina. Per informazioni tecniche contattare: IBL@IBL-International.com (27) 19/22

21 16. Sommario: Preparazione dei Reagenti Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Lavaggio 20x (50 ml) a 950 ml di acqua distillata. Numero di strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (20x ) (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Acqua Distillata (ml) Aggiungere Concentrato di Tampone di Dosaggio 20x (5 ml) a 95 ml di acqua distillata. Numero di strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata (20x ) (ml) Coniugato di Biotina Fare una diluizione 1:100 di Coniugato di Biotina nel Diluente dei Campioni: Numero di strisce Acqua Distillata (ml) Coniugato de Biotina (ml) Streptavidina-HRP Fare una diluizione 1:200 di Streptavidina-HRP nel Tampone di Dosaggio (1x): Numero di strisce Diluente dei Campioni (ml) Streptavidina-HRP (ml) Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Standard IL-2 Umana Reconstituire il standard liofilizzato di Il-2 umana con acqua distillata. (Il volume di ricostituzione è dichiarato sull etichetta del flaconcino dello standard.) Lo standard IL-2 umana concentrato dev essere diluito in proporzione 1:20 con Diluente dei Campioni Diluente per Amplificazione (1x) La preparazione del Diluente per Amplificazione (1x) è da farsi immediatamente prima dell uso. Numero di Strisce Diluente per Amplificazione (2x) (ml) Acqua Distillata (ml) (27) 20/22

22 16.7. Soluzione per Amplificazione I Centrifugare la fiala per alcuni secondi in una microcentrifuga prima di aprirla per raccogliere il liquido che rimane intrappolato nel coperchio. La preparazione della Soluzione per Amplificazione I diluita nel Diluente per Amplificazione (1x) dev essere fatta immediatamente prima dell applicazione sulla piastra. Numero di Strisce Reagente per Amplificazione I (ml) Diluente per Amplificazione (1x) (ml) Soluzione per Amplificazione II Centrifugare la fiala per alcuni secondi in una microcentrifuga prima di aprirla per raccogliere il liquido che rimane intrappolato nel coperchio. La preparazione della Soluzione per Amplificazione II diluita nel Tampone di Dosaggio dev essere fatta immediatamente prima dell applicazione sulla piastra. Numero di Strisce Reagente per Amplificazione II (ml) Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Controlli Aggiungere 1200 μl di acqua distillata ai controlli liofilizzati. Prediluire il controllo ricostituito 1:10 con Diluente dei Campioni (27) 21/22

23 17. Sommario di Procedura del Test Nota bene: Le Soluzioni per Amplificazione devono essere preparate immediatamente prima dell applicazione sulla piastra! Per ottenere dal test prestazioni ottimali è estremamente importante lavare i pozzetti in modo adeguato! 1. Determinare il numero di strisce di micropozzetti richiesto. 2. Lavare le strisce di micropozzetti due volte con il Tampone di Lavaggio. 3. Diluizione standard sulla piastra di micropozzetti: Aggiungere 100 μl di Diluente dei Campioni, in duplicato, a tutti i pozzetti standard. Pipettare 100 μl di standard preparato nei primi pozzetti e creare diluizioni di standard trasferendo 100 μl da pozzetto a pozzetto. Scartare 100 μl dagli ultimi pozzetti. Alternativamente diluizione esterna dello standard in tubi (vedi ): Pipettare 100 μl di queste diluizioni dello standard nei micropozzetti. 4. Aggiungere 100 μl di Diluente dei Campioni, in duplicato, ai pozzetti del bianco. 5. Aggiungere 50 μl di Diluente dei Campioni ai pozzetti di campione. 6. Aggiungere 50 μl di campione in duplicato ai pozzetti di campione. 7. Preparare il Coniugato di Biotina. 8. Aggiungere 50 μl di Coniugato di Biotina a tutti i pozzetti. 9. Coprire le strisce e incubare 2 ore a temperatura ambiente (18-25 C). (Agitare è assolutamente necessario per ottenere prestazioni ottimali del test.) 10. Preparare la Streptavidina-HRP. 11. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 6 volte con Soluzione Tampone di Lavaggio. 12. Aggiungere 100 μl di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti. 13. Coprire le strisce e incubare 1 ora a temperatura ambiente (18-25 C). (Agitare è assolutamente necessario per ottenere prestazioni ottimali del test.) 14. Preparare la Soluzione per Amplificazione I diluita nel Diluente per Amplificazione (1x) immediatemente prima dell applicazione sulla piastra. 15. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 6 volte con Soluzione Tampone di Lavaggio. 16. Aggiungere 100 μl di Soluzione per Amplificazione I a tutti i pozzetti. 17. Coprire le strisce e incubare per esattamente 15 minuti a temperatura ambiente (18-25 C). (Agitare è assolutamente necessario per ottenere prestazioni ottimali del test.) 18. Preparare Soluzione per Amplificazione II diluita nel Tampone di Dosaggio (1x) immediatemente prima dell applicazione sulla piastra. 19. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 6 volte con Soluzione Tampone di Lavaggio. 20. Aggiungere 100 μl di Soluzione per Amplificazione II a tutti i pozzetti. 21. Coprire le strisce e incubare per esattamente 30 minuti a temperatura ambiente (18-25 C). 22. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 6 volte con Soluzione Tampone di Lavaggio. 23. Aggiungere 100 μl di Soluzione di Substrato TMB a tutti i pozzetti. 24. Incubare le strisce di micropozzetti per circa minuti a temperatura ambiente (18-25 C). 25. Aggiungere 100 μl di Soluzione Bloccante a tutti i pozzetti. 26. Azzerare il lettore di micropozzetti e misurare l intensità del colore a 450 nm. Nota bene: Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni sono stati diluiti 1:2 (50 µl campione + 50 µl Diluente dei Campioni) e i controlli 1:20 (50 µl di controllo prediluito 1: µl Diluente dei Campioni). La concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (2x per gli campioni, 20x per gli controlli) (27) 22/22

24 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /