sp-selectin ELISA BE C Istruzioni per l Uso

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1 Istruzioni per l Uso sp-selectin ELISA Saggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di sp-selectin umana. BE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 INFORMAZIONI SUL PRODOTTO E MANUALE 1. USO PREVISTO 2 2. SOMMARIO 2 3. PRINCIPIO DEL TEST 3 4. REAGENTI FORNITI 4 5. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE 4 6. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI 4 7. MATERIALI NECESSARI MA NO FORNITI 5 8. PRECAUZIONI PER L USO 5 9. PREPARAZIONE DEI REAGENTI PROCEDURA DEL TEST CALCOLO DEI RISULTATI LIMITI DELLA PROCEDURA CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE INFORMAZIONI PER GLI ORDINI SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO (25) 1 / 18

3 1. Uso Previsto Saggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di sp-selectin umana. sp-selectin umana ELISA è per uso diagnostico in vitro. Non si usa per procedure terapeutiche. 2. Sommario P-selectina (CD62, GMP-140, PADGEM) appartiene alle molecole di adesione della famiglia selectina. P- selectina agisce come un recettore che supporta il legame dei leucociti a piastrine attivate del endotelio. Le interazioni adesive mediate da P-selectina funzionano in combinazione con le interazioni tra cellule dirette da molecole correlate e sono probabilmente importanti in entrambi i processi emostatici e infiammatori. La P-selectina si trova in membrane di granuli in piastrine non stimolate e ridistribuita alla superficie cellulare dopo l'attivazione delle piastrine. P-selectina è presente anche nelle cellule endoteliali in membrane di Weibel-Palade body e mega cariociti. L'incremento di P-selectin è molto rapido, ma transitorio e scende al livello basale entro breve tempo dopo la stimolazione. La P-selectina è una proteina da 140 kda altamente glicosilata. La sequenza di aminoacidi derivata da cdna prevede una molecola con una serie di domini ricchi di cisteina. Come le altre selettive, la P-selectina contiene un dominio a Lectin dipendente Ca2 + e un pattern EGF simile, seguito da nove ripetizioni di consenso, un dominio transmembrana e una breve coda citoplasmatica. Il gene umano per la P-selectina si trova sul cromosoma 1q P-selectina è un recettore per neutrofili e monociti, riconoscendo strutture oligosaccharide sulle cellule bersaglio. Il ruolo fisiologico di P-selectin potrebbe essere la mediazione dell'adesione iniziale di leucociti all'endotelio attivato durante l'infiammazione acuta. Può funzionare in concerto con E-selectin per indirizzare precocemente l aderenza a regioni specifiche di neutrofili e monociti nei siti di infiammazione acuta. È stata descritta una forma solubile di P-selectina presente nel siero e nel plasma che potrebbe rappresentare un frammento proteolitico o più probabilmente una variante splice solubile priva del dominio di transmembrana. P-selectina solubile è una molecola potenzialmente importante per fornire una visione più dettagliata sulle situazioni patologiche. L'accumulo eccessivo di neutrofili sulla superficie endoteliale accompagnato da un'elevata esposizione di P- selectina è stato implicato in numerosi disturbi infiammatori, tra cui sindrome da stress respiratorio nell adulto, lesioni polmonari acute, lesioni ischemia-reperfusione, shock settico Gram-negativo, malattie trombotiche e artrite reumatoide. E stato dimostrato che le cellule maligne sono in grado di esprimere recettori per la P-selectina, suggerendo un ruolo importante per la P-selectina nella formazione e nella metastasi del tumore. Anche le piastrine hanno dimostrato di promuovere la metastasi tumorale (25) 2 / 18

4 3. Principio del Test I micropozzetti vengono rivestiti con un anticorpo di rivestimento anti- sp-selectin umano. Figura 1 Micropozzetto Rivestito Il sp-selectin umano presente nel campione o nello standard si lega agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti e vi viene aggiunto l anticorpo MCP-1 anti-umano coniugato con l HRP, che si lega all sp-selectin umano catturata dal primo anticorpo. Figura 2 Anticorpo di Rivestimento Prima Incubazione Standard o Campione Coniugato HRP Dopo l incubazione, il sp-selectin anti-umano coniugato all HRP e non legato viene rimosso con una fase di lavaggio e ai pozzetti viene aggiunta una soluzione di substrato reattiva all HRP. Figura 3 Seconda Incubazione In proporzione alla quantità di sp-selectin umano presente nel campione o nello standard si forma un prodotto colorato. La reazione viene terminata aggiungendo l acido e l assorbanza si misura a 450 nm. Si prepara una curva standard sulla base di 7 diluizioni standard di sp-selectin umano e si determina la concentrazione della sp-selectin umano. Figura 4 Substrato Substrato post-reazione (25) 3 / 18

5 4. Reagenti Forniti 1 busta d alluminio con Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpi monoclonali anti- sp-selectin umano 1 flaconcino (70 µl) con Coniugato-HRP (anticorpi monoclonale anti- sp-selectin umano) 2 flaconcini con Standard sp-selectin umano liofilizzato, 80 ng/ml dopo ricostituzione 1 flaconcino di Controllo alto, liofilizzato 1 flaconcino di Controllo basso, liofilizzato 1 flaconcino (5 ml) di Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata 20x (PBS con 1 %Tween 20 e 10 % BSA) 1 flaconcino (50 ml) di Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata 20x (PBS con 1 %Tween 20) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione di Substrato (tetrametil-benzidina) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione Bloccante (Acido fosforico 1 M) 2 Copripiastra adesivi 5. Istruzioni di Conservazione Conservare i reagenti del kit a 2-8 C eccetto i controlli. Conservare i controlli liofilizatti a -20 C. Subito dopo l'uso riporre i reagenti nel luogo di conservazione a 2-8 C e i controlli a -20 C. La scadenza del kit e dei reagenti è indicata sulle etichette. La data di scadenza dei componenti del kit può essere garantita solo se questi sono conservati correttamente e, in caso di uso ripetuto di un componente, il reagente non è stato contaminato durante la prima manipolazione. 6. Prelievo e conservazione dei Campioni Con questo dosaggio sono stati testati i supernatanti delle colture cellulari, il siero, il plasma (EDTA, citrato, eparina) ed il liquido amniotico. Altri campioni biologici potrebbero essere idonei all uso per questo dosaggio. Dopo la coagulazione e la separazione, rimuovere il siero o plasma dal coagulo o gli cellulas il più presto possibile. I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio. Non usare campioni emolizzati in maniera grossolana, o lipemici. I campioni devono essere aliquotati e conservati sotto zero a -20 C, per evitare la perdita di MCP-1 umano bioattivo. Se i campioni devono essere usati entro 24 ore, possono essere conservati a una temperatura tra 2 C ed 8 C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto 13.5). Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelato dev essere portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela (25) 4 / 18

6 7. Materiali necessari ma no forniti Pipette graduate da 5 ml e 10 ml Micropipette adattabili da 5 µl a 1000 µl a canale singolo, con punte usa e getta Micropipette adattabili da 50 µl to 300 µl multicanale con punte usa e getta Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico. Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (lunghezza d onda di riferimento 620 nm) Acqua bidistillata o deionizzata Calcolatore statistico con programma che esegua l analisi di regressione 8. Precauzioni per l Uso - Tutti i prodotti chimici vanno considerati come potenzialmente pericolosi. Raccomandiamo, perciò, l'utilizzo di questo prodotto solo da personale addestrato alle tecniche di laboratorio e che siano avvezze alle comuni pratiche di laboratorio. Indossare abbigliamento idoneo come camici, guanti ed occhiali. Attenzione ad evitare contatto con la pelle e gli occhi. Nel caso di contatto con pelle o occhi, immediatamente lavare con acqua. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per specifici consigli. - I reagenti sono per uso in vitro diagnostico e non sono per uso terapeutico. - Non mischiare tra loro reagenti di diversi lotti o provenienza. - Non usare i kit dopo la data di scadenza. - Non esporre i reagenti del kit, durante la conservazione e incubazione a forti fonti di luce. - Non pipettare utilizzando la bocca. - Non mangiare o fumare nell'area dove sono utilizzati i reagenti dei kit o i campioni. - Evitare il contatto dei reagenti o campioni con la pelle o le mucose. - Guanti di gomma o lattice dovrebbero essere sempre indossati quando si usano reagenti e campioni. - Evitare il contatto tra il substrato del kit e agenti ossidanti e metallo. - Evitare schizzi o produzione di aereosol. - Per evitare contaminazione microbica o cross-contaminazione dei reagenti o dei campioni che invaliderebbero il test, usare sempre pipette e puntali mono-uso. - Usare vaschette pulite e dedicate per la dispensare il reagente substrato. - L'esposizione agli acidi inattiva il coniugato. - Acqua distillata o de-ionizzata deve essere utilizzata per la preparazione dei reagenti. - La soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente prima dell'utilizzo. - Decontaminare ed eliminare i campioni e tutto il materiale potenzialmente contaminante perchè potrebbero contenere agenti infettanti. Il metodo preferito per la decontaminazione è l'autoclavaggio per minimo 1 ora a C. - Gli scarti liquidi, non contenenti acido e gli scarti neutralizzati possono essere mischiati con sodio ipoclorido in un volume finale di 1.0 %. Lasciare minimo 30 minuti per l'effettiva decontaminazione. Scarti liquidi contenenti acido devono essere neutralizzati prima dell'aggiunta di sodio ipoclorido (25) 5 / 18

7 9. Preparazione dei Reagenti Prima di cominciare con le procedure del test i concentrati dei tamponi devono essere portati a temperatura ambientale e diluiti alle concentrazioni adeguate. Se i concentrati dei tampone presenta cristalli in sospensione, riscaldare lievemente i tamponi fino a ottenere la completa dissoluzione dei cristalli Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Versare l'intero contenuto (50 ml) del Tampone di Lavaggio concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 1000 ml. Portare il volume finale a 1000 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Trasferire il prodotto in una bottiglia pulita e conservare a temperature comprese fra 2 C e 25 C. Il Tampone di Lavaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Lavaggio (1x) secondo la tabella seguente: Numero di Strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrato (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Versare l'intero contenuto (5 ml) del Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 100 ml. Portare il volume finale a 100 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Conservare a temperature comprese fra 2 C e 8 C. Il Tampone di Dosaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Dosaggio (1x) secondo la tabella seguente; Numero di Strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) Preparazione di Coniugato-HRP Il Coniugato-HRP deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione. La Soluzione Coniugato-HRP concentrato deve essere diluito 1:100 con Tampone di Dosaggio (1x) in una provetta di plastica pulita secondo la tabella seguente: Numero di Strisce Coniugato-HRP (ml) Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Standard MCP-1 Umano Ricostituire lo Standard sp-selectin umano aggiunendo acqua distillata. Il volume di ricostituzione è indicato sull'etichetta della flaconcino dello standard. Girare o mescolare gentilmente per garantire la completa ed omogenea solubilizzazione (concentrazione dello standard ricostituito = 80 ng/ml). Lasciare lo standard a ricostituire per minuti. Prima di fare le diluizione mescolare bene. La diluizione dello standard può essere fatto direttamente nella piastra (vedi 10.c.) oppure nei tubi (vedi 9.4.1) (25) 6 / 18

8 Diluzione Standard Esterna Etichettare 7 tubi, uno per ogni punto dello standard. S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7. Preparare diluizioni seriali 1:2 per lo standard nel seguente modo: Pipettare 225 ul di Tampone di Dosaggio (1x) a tutti tubi. Pipettare 225 µl di standard ricostituito (concentrazione dello standard = 80 ng/ml) nel primo tubo, etichettato S1, e mescolare (concentrazione dello standard 1 = 40 ng/ml). Pipettare 225 µl di questa diluizione nel secondo tubo, etichettato S2 e mischiare accuratamente prima del successivo transferimento. Ripetere le 5 diluizioni seriali in modo da creare i punti della curva di calibrazione (vedere figura 5). Il Tampone di Dosaggio (1x) serve come bianco. Figura 5 Transferire 225 µl S1 S2 S3 S4 - S7 Standard sp-selectin Umano ricostituito Tampone di Dosaggio (1x) 225 µl Buttare 225 µl 9.5. Controlli Ricostituire aggiungendo 100 μl di acqua distillata ai controlli liofilizzati (10-30 minuti). Centrifugare o mescolare con cautela per garantire una solubilizzazione completa ed omogenea. Per il resto trattare i controlli come i vostri campioni nel dosaggio. Per il range di controllo fare riferimento al certificato di analisi o all etichetta del flaconcino. Conservare i controlli ricostituiti aliquotati a -20 C. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento (25) 7 / 18

9 10. Procedura del Test a. Stabilire il numero di strip dei micropozzetti necessarie per analizzare la quantità desiderata di campioni più le strip per i bianchi e gli standard. Tutti i campioni, gli standardi, il bianco e il devono essere processati in duplicato. Rimuovere dal supporto le strip micropozzetti non utilizzate e conservarle nella bustina metallica contenente la polvere essiccante, mantenendole a 2-8 C e perfettamente sigillate. b. Lavare due volte le strip micropozzetti utilizzando circa 400 µl di Tampone di Lavaggio per pozzetto, aspirando accuratamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l'altro. Permettere al tampone di lavaggio di rimanere, nei pozzetti, circa secondi prima dell'aspirazione. Evitare di scalfire la superficie dei micropozzetti. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare le strip micropozzetti con un tampone o carta assorbente per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso. Utilizzare le strip subito dopo il lavaggio o sistemarle capovolte su carta assorbente umida per non più di 15 min. Non lasciar asciugare i pozzetti. c. Diluizione dello standard in micropozetti (alternativamente la diluizione dello standard può avvenire in tubi vedi 9.4.1) Aggiungere 100 µl di Tampone di Dosaggio (1x) in duplicato a tutti i pozzetti dello standard. Pipettare 100 µl standard preparato (vedi 9.4 Preparazione dello Standard, concentrazione = ng/ml) in duplicato nei pozzetti A1 e A2 (vedi Tavola 1). Mescolare il contenuto dei pozzetti A1 e A2 attraverso ripetute aspirazione ed iniezioni (concentrazione dello standard 1, S1 = ng/ml) e trasferire 100 µl, rispettivamente, ai pozzetti B1 e B2 (vedere Figura 6). Fare attenzione a non graffiare la parte interna dei pozzetti. Continuare questa procedura per 5 volte, creando due colonne di standard in diluizione con concentrazione da a 0.63 ng/ml. Buttare 100 µl del contenuto degli ultimi pozzetti (G1 e G2). Figura 6 Transferire 100 µl S1 S2 S3 S4 - S7 Standard sp-selectin Umano Ricostituito Tampone di Dosaggio (1x) 100 µl Buttare 100 µl (25) 8 / 18

10 In caso di diluizione esterna dello standard (vedi 9.4.1) pipettare 100 µl di queste diluizioni standard (S1 S7) nei pozzetti degli standard come da Tavola 1. Tavola 1 Tavola rappresenta un esempio dell'organizzazione dei bianchi, standardi e campioni nei pozzetti: A B C D E F G Standard 1 (40.00 ng/ml) Standard 2 (20.00 ng/ml) Standard 3 (10.00 ng/ml) Standard 4 (5.00 ng/ml) Standard 5 (2.50 ng/ml) Standard 6 (1.25 ng/ml) Standard 7 (0.63 ng/ml) Standard 1 (40.00 ng/ml) Standard 2 (20.00 ng/ml) Standard 3 (10.00 ng/ml) Standard 4 (5.00 ng/ml) Standard 5 (2.50 ng/ml) Standard 6 (1.25 ng/ml) Standard 7 (0.63 ng/ml) Campione 1 Campione 1 Campione 2 Campione 2 Campione 3 Campione 3 Campione 4 Campione 4 Campione 5 Campione 5 Campione 6 Campione 6 Campione 7 Campione 7 H Bianco Bianco Campione 8 Campione 8 d. Dispensare 100 µl di Tampone di Dosaggio (1x) in duplicato ai pozzetti de bianco. e. Dispensare 90 µl di Tampone di Dosaggio (1x) in duplicato ai pozzetti dei campioni. f. Dispensare 10 µl di ogni campione in duplicato ai pozzetti dei campioni. g. Preparare il Coniugato-HRP (vedere la preparazione del Coniugato-HRP 9.3) h. Dispensare 50 µl di Coniugato-HRP a ciascun pozzetto. i. Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 2 ore utilizzando, se disponibile, su un agitatore mecanico a 400 rpm. j. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 3 volte come descritto in punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo. k. Pipettare 100 µl di Soluzione di Substrato TMB in tutti i pozzetti. l. Incubare le strisce a temperatura ambiente (18-25 C) per circa 30 minuti. Evitare l'esposizione diretta a luci intense. È necessario monitorare i valori D.O. a livello della piastra e interrompere la reazione del substrato (vedi il punto prossimo del protocollo) prima che i pozzetti positivi cessino di essere appropriatamente registrabili. La determinazione del tempo necessario per lo sviluppo del colore dev'essere fatto per ogni singolo parametro. Si raccomanda di aggiungere la soluzione di stop quando lo standard più elevato ha sviluppato un colore blu scuro. Alternativamente lo sviluppo del colore può essere monitorato con un lettore ELISA a 620 nm. La reazione del substrato deve essere bloccata non appena viene misurato un valore della DO di m. Interrompere la reazione enzimatica pipettando rapidamente 100 µl di Soluzione Stopp in ciascun pozzetto, inclusi i pozzetti del bianco. È importante che la soluzione bloccante si diffonda rapidamente e uniformemente attraverso i micropozzetti per inattivare completamente l'enzima. I risultati devono essere letti immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione bloccante o entro 1 ora se le strip sono conservate in un luogo buio a 2-8 C. n. Leggere l'assorbanza di ciascun micropozzetto su uno spettrofotometro che utilizza 450 nm come lunghezza d'onda primaria (620 nm come lunghezza d'onda di riferimento alternativa; valori da 610 nm a 650 nm sono accettabili). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del (25) 9 / 18

11 produttore e utilizzando i pozzetti del bianco. Determinare l'assorbanza sia dei campioni, sia degli standard. Note: In caso di incubazione senza agitazione i valori di densità ottica (D.O.) potranno essere più bassi di quanto indicato sotto. Tuttavia i risultati saranno da ritenersi validi. 11. CALCOLO DEI RISULTATI - Calcolare i valori medi dell assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati devono rientrare nel 20 % del valore medio. - Creare una curva standard segnando l assorbanza media di ogni concentrazione standard sull ordinata contro la concentrazione di sp-selectin umano sull ascissa. Disegnare una curva di best-fit congiungendo i punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri). - Per determinare la concentrazione di sp-selectin umano circolante per ogni campione, trovare prima il valore medio di assorbanza sull ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva standard. Nel punto d intersezione estendere una linea verticale fino all ascissa e leggere il valore corrispondente della concentrazione di sp-selectin umano. - Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni di colture celulai sono stati diluiti 1:10 (10 µl campione + 90 µl Tampone di Dosaggio (1x)). La concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (5x). - Il calcolo dei campioni con una concentrazione superiore allo Standard 1 può dare per risultato livelli scorretti e bassi di sp-selectin umano. Questi campioni richiedono un ulteriore pre-diluizione esterna secondo i valori stimati dell sp-selectin umano, con Tampone di Dosaggio (1x) in modo da quantificare con precisione i livelli reali di sp-selectin umano. - Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione di sp-selectin umano conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i valori ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non essere validi. - La Figura 7 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per dedurne risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di strisce per micropozzetti su cui si fa il dosaggio. Figura 7 Curva standard rappresentativa per l sp-selectin umano ELISA. Il sp-selectin umano è stato diluito in 2 fasi seriali nel Tampone di Dosaggio (1x). Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva standard dev essere eseguita per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio (25) 10 / 18

12 Tavola 2 Dati tipici relativi all uso dell sp-selectin umano ELISA Lunghezza d onda: 450 nm Lunghezza d onda di riferimento: 620 nm Standard Concentrazione sp-selectin Umano (pg/ml) D.O. (450 nm) Bianco D.O. Media (450 nm) C.V. (%) I valori DO della curva standard possono variare a seconda delle condizioni di prestazione del dosaggio (ad es.: operatore, tecnica di pipettaggio o effetti della temperatura). Inoltre, il periodo di validità del kit può influenzare l attività enzimatica e quindi l intensità del colore. I valori misurati sono ancora validi. 12. LIMITI DELLA PROCEDURA - Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva standard per ogni esecuzione del test. - La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione crociata tra reagenti può casusare risultati erronei. - Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro riutilizzabili devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell uso. - Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o falsi negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la Soluzione di Lavaggio fresca, riempire con il Tampone di Lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti scoperti, o non permettere che si asciughino per periodi prolungati. - L uso della radioimmunoterapia ha aumentato significativamente il numero di pazienti con anticorpi umani IgG anti-topo (HAMA). HAMA può interferire con dosaggi che utilizzano anticorpi monoclonali murini, portando sia a risultati falsi positivi, sia falsi negativi. I campioni di siero contenenti anticorpi delle immunoglobuline murine possono essere ancora analizzati in questi dosaggi quando le immunoglobuline murine (siero, liquido ascitico o anticorpi monoclonali di specificità irrilevante) vengono aggiunti al campione (25) 11 / 18

13 13. Caratteristiche di Prestazione Sensibilità Il limite di rilevamento della sp-selectin umano definito come la concentrazione dell analita, risultante in un assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più 2 deviazioni standard), è stato determinato di 0.20 ng/ml (media di 6 dosaggi indipendenti) Riproducibilità Intra-Dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di sp-selectin umano. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di sp-selectin umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 3). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 7.8 %. Tavola 3 La concentrazione media di sp-selectin umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione Campione Esperimento Concentrazione media di spselectin umano (pg/ml) Coefficiente di Variazione (%) (25) 12 / 18

14 Inter-Dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di sp-selectin umano. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di sp-selectin umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 4). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 5.4 %. Tavola 4 La concentrazione media di sp-selectin umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione: Campione Concentrazione media di Coefficiente di sp-selectin Umano (pg/ml) Variazione (%) Test di Recupero Il test di recupero è stato valutato addizionando 3 livelli di sp-selectin umano al siero, plasma e supernatanti di colture cellulari. Le ricompense sono state determinate in 3 esperimenti indipendenti con 6 repliche ciascuna. La quantità di sp-selectin umano endogeno in campioni non addizionati è stata sottratta dai valori del test. Vedi Tavola 5 per i dati di recupero. Tavola 5 Matrice del Campione* Spike alto (%) Spike médium (%) Siero Plasma (EDTA) Plasma (Citrato) Plasma (Heparina) Spike basso (%) Parallelismo della Diluizione 4 campioni di siero con diversi livelli di sp-selecitin umano sono stati analizzati in diluizioni seriali multiple di 2 e con 4 replicati l uno. Il recupero rientrava in un range dal 81.3% al % con un recupero medio complessivo del 91.6% (vedere Tavola 5) (25) 13 / 18

15 Tavola 5 Campione Diluizione 1:10 1:20 1:40 1:80 1:10 1:20 1:40 1:80 1:10 1:20 1:40 1:80 1:10 1:20 1:40 1:80 Concentrazione Attesa di sp-selectin Umano (pg/ml) Concentrazione Misurata di sp-selectin Umano (pg/ml) Recupero di Concentrazione Attesa di sp-selectin Umano (%) Stabilità dei Campioni Stabilità a Congelamento - Scongelamento Aliquote di campioni di siero (non addizionati o addizionati) sono stati conservati a -20 C e scongelati 5 volte e sono stati determinati i livelli di sp-selectin umano. Con il congelamento e lo scongelamento non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività del sp-selectin umano Stabilità della Conservazione Aliquote di campioni di siero (addizionati o non addizionati) sono state conservate a -20 C, 2-8 C, a temperatura ambiente (TA) ed a 37 C e il livello di sp-selectin umano ne è stato determinato dopo 24 ore. Durante la conservazione alle condizioni sopraindicate non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività del sp-selectin umano Confronto tra siero e plasma Da 2 individui ciascuno, il siero e EDTA, il citrato e il plasma dell'eparina sono stati ottenuti allo stesso tempo e sono stati testati per la selezione selettiva di sp. Le concentrazioni non erano significativamente diverse e quindi tutte queste riparazioni di sangue sono adatte per l'uso nel dosaggio. È tuttavia altamente raccomandato assicurare l'uniformità dei preparati di sangue Specificità Il saggio rileva sia la sp-selectin naturale che quella ricombinante umana. La reattività crociata e l interferenza di fattori circolanti del sistema immunitario sono state valutate addizionando queste proteine in concentrazioni fisiologicamente rilevanti ad un siero positivo di sp-selectin Umano. Non è stata rilevata alcuna reattività reattiva o interferenza, in particolare non con se-selectina umana e slselectina umana (25) 14 / 18

16 13.8. Valori Attesi Per la IL-22 umana è stato testato un pannello di 40 campioni di siero di donatori apparentemente sani (maschi e femmine) selezionati casualmente (random). I livelli misurati possono variare con la raccolta di campioni usata. Per i livelli di sil-2r umana misurati vedi la Tavola 7. Tavola 7 Matrice di Campione Numero di Campioni Valutati Intervallo (pg/ml) Media (pg/ml) Siero Plasma (EDTA) Plasma (Citrato) Plasma (Eparina) INFORMAZIONI PER GLI ORDINI Per gli ordini contattare: Per informazioni tecniche contattare: Vedi ultima pagina. IBL@IBL-International.com (25) 15 / 18

17 15. Sommario: Preparazione dei Reagenti Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Lavaggio 20x (50 ml) a 950 ml di acqua distillata. Numero di strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Acqua Distillata (ml) Aggiungere Concentrato di Tampone di Dosaggio 20x (5 ml) a 95 ml di acqua distillata. Numero di strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata (ml) Acqua Distillata (ml) Coniugato-HRP Fare una diluizione 1:100 di Coniugato-HRP nel Tampone di Dosaggio (1x): Numero di strisce Coniugato-HRP (ml) Standard sp-selectin Umano Reconstituire il Standard liofilizzato di sp-selectin umano con acqua distillata. (Il volume di ricostituzione è dichiarato sull etichetta del flaconcino dello standard.) Controlli Agguingere 100 μl di acqua distillata al controlli liofilizzati. Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) (25) 16 / 18

18 16. Sommario di Procedura del Test 1. Determinare il numero di strisce di micropozzetti richiesto. 2. Lavare le strisce di micropozzetti due volte con il Tampone di Lavaggio. 3. Diluizione standard sulla piastra di micropozzetti: Aggiungere 100 μl di Tampone di Dosaggio (1x), in duplicato, a tutti i pozzetti standard. Pipettare 100 μl di standard preparato nei primi pozzetti e creare diluizioni di standard trasferendo 100 μl da pozzetto a pozzetto. Scartare 100 μl dagli ultimi pozzetti. Alternativamente diluizione esterna dello standard in tubi (vedi ): Pipettare 100 μl di queste diluizioni dello standard nei micropozzetti. 4. Aggiungere 100 μl di Tampone di Dosaggio (1x), in duplicati, ai pozzetti del bianco. 5. Aggiungere 90 μl di Tampone di Dosaggio (1x)a tutti i pozzetti. 6. Aggiungere 10 μl di campione in duplicato a tutti i pozzetti. 7. Preparare il Coniugato-HRP. 8. Aggiungere 50 μl di Coniugato-HRP a tutti i pozzetti. 9. Coprire le strisce e incubare 2 ore a temperatura ambiente (18-25 C). 10. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 3 volte con il Tampone di Lavaggio 11. Aggiungere 100 μl di Soluzione di Substrato TMB a tutti i pozzetti. 12. Incubare le strisce di micropozzetti per circa 30 minuti a temperatura ambiente (18-25 C). 13. Aggiungere 100 μl di Soluzione Bloccante a tutti i pozzetti. 14. Azzerare il lettore di micropozzetti e misurare l intensità del colore a 450 nm. Nota bene: Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni di supernatanti di colture cellulari sono stati diluiti 1:5 (20 µl di campione + 80 µl Tampone di Dosaggio (1x)). La concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (5x) (25) 17 / 18

19 17. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO 1. Dunlop, L. C.; Skinner, M. P.; Bendall, L. J.; Favaloro, E. J.; Castaldi, P. A.; Gorman, J. J.; Gamble,J.R.; Vadas, M. A.; Berndt, M. C.. Characterization of GMP-140 (P-selectin) as a circulating plasma protein. J.Exp.Med. 1992; 175: Stenberg, P. E.; McEver, R. P.; Shuman, M. A.; Jacques, Y. V.; Bainton, D. F.. A platelet alphagranule membrane protein (GMP-140) is expressed on the plasma membrane after activation. J.Cell Biol. 1985; 101: Johnston, G. I.; Kurosky, A.; McEver, R. P.. Structural and biosynthetic studies of the granule membrane protein, GMP-140, from human platelets and endothelial cells. J.Biol.Chem. 1989; 264: Mulligan, M. S.; Polley, M. J.; Bayer, R. J.; Nunn, M. F.; Paulson, J. C.; Ward, P. A.. Neutrophildependent acute lung injury. Requirement for P-selectin (GMP-140). J.Clin.Invest 1992; 90: Watson, M. L.; Kingsmore, S. F.; Johnston, G. I.; Siegelman, M. H.; Le Beau, M. M.; Lemons, R. S.; Bora, N. S.; Howard, T. A.; Weissman, I. L.; McEver, R. P.;.. Genomic organization of the selectin family of leukocyte adhesion molecules on human and mouse chromosome 1. J.Exp.Med. 1990; 172: Geng, J. G.; Bevilacqua, M. P.; Moore, K. L.; McIntyre, T. M.; Prescott, S. M.; Kim, J. M.; Bliss, G. A.; Zimmerman, G. A.; McEver, R. P.. Rapid neutrophil adhesion to activated endothelium mediated by GMP-140. Nature 1990; 343: Johnston, G. I.; Cook, R. G.; McEver, R. P.. Cloning of GMP-140, a granule membrane protein of platelets and endothelium: sequence similarity to proteins involved in cell adhesion and inflammation. Cell 1989; 56: Hogg, N.. Roll, roll, roll your leucocyte gently down the vein. Immunol.Today 1992; 13: Malech, H. L.; Gallin, J. I.. Current concepts: immunology. Neutrophils in human diseases. N Engl.J.Med. 1987; 317: Hamburger, S. A.; McEver, R. P.. GMP-140 mediates adhesion of stimulated platelets to neutrophils. Blood 1990; 75: Hattori, R.; Hamilton, K. K.; Fugate, R. D.; McEver, R. P.; Sims, P. J.. Stimulated secretion of endothelial von Willebrand factor is accompanied by rapid redistribution to the cell surface of the intracellular granule membrane protein GMP-140. J.Biol.Chem. 1989; 264: Ushiyama, S.; Laue, T. M.; Moore, K. L.; Erickson, H. P.; McEver, R. P.. Structural and functional characterization of monomeric soluble P-selectin and comparison with membrane P- selectin. J.Biol.Chem. 1993; 268: Johnston, G. I.; Bliss, G. A.; Newman, P. J.; McEver, R. P.. Structure of the human gene encoding granule membrane protein-140, a member of the selectin family of adhesion receptors for leukocytes. J.Biol.Chem. 1990; 265: Moore, K. L.; Varki, A.; McEver, R. P.. GMP-140 binds to a glycoprotein receptor on human neutrophils: evidence for a lectin-like interaction. J.Cell Biol. 1991; 112: Berman, C. L.; Yeo, E. L.; Wencel-Drake, J. D.; Furie, B. C.; Ginsberg, M. H.; Furie, B.. A platelet alpha granule membrane protein that is associated with the plasma membrane after activation. Characterization and subcellular localization of platelet activation-dependent granuleexternal membrane protein. J.Clin.Invest 1986; 78: Lotan, R.; Raz, A.. Endogenous lectins as mediators of tumor cell adhesion. J.Cell Biochem. 1988; 37: Lotan, R.; Raz, A.. Endogenous lectins as mediators of tumor cell adhesion. J.Cell Biochem. 1988; 37: Larsen, E.; Celi, A.; Gilbert, G. E.; Furie, B. C.; Erban, J. K.; Bonfanti, R.; Wagner, D. D.; Furie, B.. PADGEM protein: a receptor that mediates the interaction of activated platelets with neutrophils and monocytes. Cell 1989; 59: George, J. N.; Pickett, E. B.; Saucerman, S.; McEver, R. P.; Kunicki, T. J.; Kieffer, N.; Newman, P. J.. Platelet surface glycoproteins. Studies on resting and activated platelets and platelet membrane microparticles in normal subjects, and observations in patients during adult respiratory distress syndrome and cardiac surgery. J.Clin.Invest 1986; 78: Boukerche, H.; Berthier-Vergnes, O.; Tabone, E.; Dore, J. F.; Leung, L. L.; McGregor, J. L.. Platelet-melanoma cell interaction is mediated by the glycoprotein IIb-IIIa complex. Blood 1989; 74: (25) 18 / 18

20 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. CONTENUTI: I reclami possono essere presentati inizialmente scritti o vocali. Successivamente devono essere completati in modo scritto includendo le prestazioni del test ed i risultati se si riferiscono a reclami per ragioni analitiche. GARANZIA: Il prodotto è garantito per essere esente da difetti dei materiali entro la specifica data di conservazione ed in modo conforme alle specifiche fornite con il prodotto. Il prodotto deve essere utilizzato secondo l'uso previsto, tutte le istruzioni riportate nelle istruzioni per l'uso e entro la data di scadenza del prodotto. Qualsiasi modifica della procedura di prova o lo scambio o la miscelazione di componenti di diversi lotti potrebbero avere effetti negativi sui risultati. Questi casi invalidano qualsiasi richiesta di sostituzione. LIMITAZIONE DI RESPONSABILITÀ: IN TUTTE LE CIRCOSTANZE, LA RESPONSABILITÀ DEL FABBRICANTE È LIMITATA AL PREZZO D'ACQUISTO DEL/DEI KIT IN QUESTIONE. IN NESSUN CASO IL PRODUTTORE SARÀ RESPONSABILE PER QUALSIASI DANNO INCIDENTALE O CONSEQUENZIALE, COMPRESI I DANNI PER PERDITA DI PROFITTO, SALUTE, DANNI PER PERSONE O PROPRIETÀ O ALCUNA ALTRA PERDITA INCIDENTALE O CONSEQUENZIALE. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Symbols Version 4.5 (it) /