CIC-C3d ELISA. Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di CIC-C3d nel siero o plasma umani.
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- Carlo Romano
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1 Istruzioni per l Uso CIC-C3d ELISA Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di CIC-C3d nel siero o plasma umani. DM C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)
2 1. USO PREVISTO Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di CIC-C3d nel siero o plasma umani. 2. SOMMARIO E SPIEGAZIONI Gli immunocomplessi circolanti sono presenti in molti individui con Lupus Erythematoso Sistemico (SLE) ed Artrite Reumatoide (RE), specialmente se presentano complicanze legate a vascoliti. Si è riscontrato che i livelli di CICs hanno una correlazione con l attività di questa patologia, nella misura in cui se ne registrano livelli superiori durante le fasi attive della patologia. Per il rilevamento dei CICs sono stati sviluppati numerosi test, compresa la precipitazione in PEG e l immunodiffusione radiale e i dosaggi basati sulle cellule, come il dosaggio della cellula Raji. Non esiste una procedura singola che possa rilevare tutti I tipi di CICs; tuttavia, le procedure in grado di rilevare se i CICs contengano frammenti del complemento (ad es.: C1q e C3d) sembrano essere anche in grado di rilevare eventi clinicamente importanti. Il sistema di test C3d rileva immunocomplessi contenenti sia C3d sia IgG. 3. PRINCIPIO DEL TEST Il kit (CIC-C3d) è basato sul principio che gli immunocomplessi affini alla frazione C3d sono bloccati dall anti-c3d immobilizzato sulla micropiastra. Nella prima fase della procedura alla micropiastra coattata con anti-c3d si aggiungono i sieri e i campioni e quindi vengono messi a incubare. Durante questa fase gli immunocomplessi affini alla frazione C3d si legheranno all anti C3d coattata alla micropiastra. Il lavaggio della micropiastra rimuove le proteine del siero non legate. Nella seconda fase viene aggiunto il coniugato antihuman IgG-perossidasi il quale si legherà agli immunocomplessi ora fissati alla micropiastra. Il lavaggio rimuove il coniugato non legato. Nella terza fase si aggiunge il TMB-substrato il quale reagisce con il coniugato legato alla micropiastra. L intensità del colore misurata a 450 nm, è proporzionale ai livelli di CIC IgG. La concentrazione di immunocomplessi presenti nel campione è determinata mediante una curva standard. I risultati sono espressi come heat aggregate gamma globuline umane per ml (µgeq/ml) 4. AVVERTENZE E PRECAUZIONI 1. Solo per uso diagnostico in-vitro. Solo per uso professionale. 2. Leggere attentamente le istruzioni prima di iniziare il test. Utilizzare il manuale fornito nel kit. Assicurarsi di aver compreso tutte le indicazioni. Per ulteriori informazioni (fondo clinico, performance, protocolli di automazione, applicazioni alternative, letteratura, ecc.) consultare il sito d IBL. 3. In caso di danneggiamento del kit contattare IBL o il vostro fornitore entro 1 settimana dal ricevimento della merce. Non utilizzare i componenti danneggiati ma conservarli per fornire prove del danno assieme al reclamo che inoltrerete al produttore/fornitore. 4. Rispettare lotto e scadenze. Non scambiare o mescolare tra loro reagenti di lotti diversi. Non usare i reagenti scaduti. 5. Attenersi alle Buone Pratiche di Laboratorio e alle direttive di sicurezza. Indossare camici, guanti in lattice e occhiali protettivi se necessario. 6. Alcuni reagenti del kit contengono sostanze pericolose che potrebbero causare irritazioni a pelle ed occhi. Consultare la sezione MATERIALE FORNITO e le etichette per i dettagli precisi. Schede di sicurezza del prodotto sono disponibili sul sito web IBL o su richiesta specifica ad IBL/fornitore. 7. I reagenti preparati e usati e le sostanze chimiche del kit devono essere trattati come rifiuti pericolosi secondo le normative di sicurezza e la legislazione vigente nel Paese in cui il prodotto viene usato. 8. Evitare il contatto con la soluzione stop. Può causare irritazioni e ustioni della pelle. 9. Evitare l esposizione del reagente TMB/H 2 O 2 a luce solare diretta, metalli o ossidanti. 10. Alcuni reagenti contengono azido di sodio (NaN 3 ) o ProClin 300 come conservanti. In caso di contatto con occhi e pelle risciacquare subito abbondantemente. NaN 3 potrebbe reagire con piombo e rame piombato formando metalli azidici esplosivi. Quando si eliminano i reagenti provvedere a bagnarli con grandi quantità di acqua per evitare formazione di azidi. 11. Tutti i reagenti del kit contenenti siero umano o plasma sono risultati negativi rispetto a HIV I/II, HBsAg e HCV. Si raccomanda tuttavia di trattarli come potenzialmente pericolosi poiché non si può escludere in maniera assoluta la presenza di questi o di altri agenti infettivi. V1_2012_03 1/5
3 5. CONSERVAZIONE E STABILITA Il kit viene spedito e trasportato a temperatura ambiente e deve essere conservato a 2-8 C. Non esporre a luce solare diretta e ad alte temperature. Le informazioni relative a conservazione e stabilità di tutti i reagenti e dei campioni sono riportate nel capitolo corrispondente. Dopo aver aperto la busta per micropiastre rivestite, riporre le strip inutilizzate nell apposita busta di alluminio e chiuderla con nastro. La piastra microtitrata aperta è stabile fino a scadenza del kit se conservata nel suo involucro ben chiuso. 6. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI La determinazione dei CIC si effettua nel siero o plasma umani. I campioni che non sono testati nelle 24 ore devono essere conservati a -20 C. I campioni non devono essere scongelati per più di una volta. 7. MATERIALE FORNITO Quantità Simbolo Componente 1 x 12x8 MTP 1 x 0.5 ml ENZCONJ 1 x 20 ml ENZCONJDIL 1 x 3 x 1.5 ml CAL A-C 1 x 1.5 ml CONTROL + 1 x 1.5 ml CONTROL 50 ml SAMPLEDIL 2 x 50 ml WASHBUF CONC 1 x 15 ml TMB SUBS 1 x 15 ml TMB STOP 8. MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI Micropiastra Strisce separabili. Rivestiti con anticorpi anti-c3d. Coniugato Enzimatico Contiene: anti-umano-igg coniugato con Perossidasa di Rafano (HRP). Diluente Coniugato Enzimatico Pronto/a all uso. Contiene: 74 mm Tampone fosfato, ph 7.4; BSA 1 g/l. Standard A-C Pronto/a all uso. Concentrazioni 0; 16; 64 µgeq/ml Per le concentrazioni esatte vedere il certificato CQ. Controllo Positivo Pronto/a all uso. Per le concentrazioni esatte vedere il certificato CQ. Controllo Negativo Pronto/a all uso. Per le concentrazioni esatte vedere il certificato CQ. Diluente dei Campioni Pronto/a all uso. Contiene: 74 mm Tampone fosfato, ph 7.4, 1 g/l BSA. Tampone di Lavaggio, Concentrato (10 x) Contiene: NaCl 160 g/l; tween g/l - 0.2M Tampone fosfato, ph 7.4. Soluzione Substrato Pronto/a all uso. Contiene: H 2 O 2 -TMB 0.26 g/l Soluzione Stop Pronto/a all uso. Contiene: 0.15 mol/l H 2 SO Micropipette (Multipette Eppendorf o similari, < 3 % CV). Volumi: 10, 100, 300 e 500 µl 2. Carrello portaprovette per diluizione di campione 3. Provette per diluizione di campione 4. Incubatore, 37 C 5. Cilandro calibrato 1 L 6. Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti 7. Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico 8. Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (lunghezza d onda di riferimento nm) 9. Acqua bidistillata o deionizzata 10. Carta assorbente, puntali per pipette e timer V1_2012_03 2/5
4 9. NOTE PER LA PROCEDURA 1. Qualsiasi manipolazione impropria dei campioni o modifica alla procedura può compromettere i risultati. Rispettare rigorosamente i volumi, i tempi e le temperature di incubazione e i passaggi di pretrattamento dei campioni indicati in metodica. Utilizzare pipette calibrate. 2. Una volta iniziato il test completare tutti i passaggi senza interruzioni. Assicurarsi che tutti i reagenti siano stati precedentemente preparati in tempo utile. Far raggiungere la temperatura ambiente ai campioni e ai componenti del kit (18-25 C) e mescolare delicatamente ciascun reattivo liquido e campione prima dell uso. Non creare schiuma durante il mescolamento. 3. Evitare la contaminazione di reagenti, pipette, pozzetti o provette. Usare puntali di plastica nuovi per ogni reagente, standard e campione. Non scambiare i tappi tra loro. Tappare sempre i flaconi non utilizzati. Non riutilizzare pozzetti/provette o reagenti. 4. Si consiglia di saggiare i campioni in doppio per poter identificare eventuali errori di pipettamento. 5. Usare uno schema di pipettamento per realizzare un appropriata distribuzione sulla piastra. 6. Il tempo d incubazione influisce sui risultati. Tutti i pozzetti dovrebbero essere dispensati nello stesso ordine e sequenza temporale. Si raccomanda una pipetta multicanale a 8 canali per pipettare le soluzioni in tutti i pozzetti. 7. Il lavaggio della micropiastra è importante. Pozzetti lavati in modo inappropriato possono portare a risultati erronei. Si raccomanda una pipetta multicanale o un lavatore automatico per piastre. Non far asciugare i pozzetti tra le varie incubazioni. Non graffiare i pozzetti rivestiti durante risciacqui e aspirazioni. Risciacquare e versare i reagenti con cura. Durante i risciacqui assicurarsi che i pozzetti siano ben riempiti con la soluzione di lavaggio e che non ci siano residui nei pozzetti. 8. L umidità influisce sui pozzetti/tubi rivestiti. Non aprire l involucro finché non ha raggiunto la temperatura ambiente. Riporre immediatamente i tubi/pozzetti non utilizzati nell involucro con il disseccante. 10. ISTRUZIONI PRE-TEST Diluizione dei Campioni Preparare il campione pipettando in una provetta: Siero 10 µl Diluente dei Campioni 500 µl Miscelare gentilmente. Evitare l uso del vortex Diluizione di Tampone Lavaggio Prima dell uso, diluire il contenuto del flacone del Tampone di Lavaggio (10x) con acqua distillata fino al volume di 500 ml. Per preparare volumi minori rispettare il rapporto di diluizione di 1:10. Nella soluzione di lavaggio concentrata è possibile osservare la presenza di cristalli; in tal caso agitare a temperatura ambiente fino a completa dissoluzione dei cristalli; per una maggiore precisione diluire tutto il flacone della soluzione di lavaggio concentrata a 500 ml avendo cura di trasferire anche I cristalli, poi agitare fino a completa dissoluzione. Conservazione: 2-8 C Stabilità: 30 giorni Diluizione di Coniugato Diluire il Coniugato 1:100 con il Tampone di Coniugato. La quantità varia proporzionalmente secondo il numero di test da eseguire. Miscelare bene evitando la formazione di schiuma. Conservazione: C Stabilità: 3 ore V1_2012_03 3/5
5 11. PROCEDURA 1. Pipettare 100 µl di ogni Standard, Controllo o campione di paziente diluito nei rispettivo pozzetti della micropiastra. 2. Incubare 30 min a 37 C. 3. Lavare la piastra 3 x con 300 µl di Tampone di Lavaggio diluito. Rimuovere l eccesso di soluzione picchiettando la piastra capovolta su una salvietta di carta. 4. Pipettare 100 µl di Coniugato diluito in ogni pozzetto. 5. Incubare 30 min a 37 C. 6. Lavare la piastra 3 x con 300 µl di Tampone di Lavaggio diluito. Rimuovere l eccesso di soluzione picchiettando la piastra capovolta su una salvietta di carta. 7. Pipettare 100 µl di Soluzione Substrato TMB in ogni pozzetto. 8. Incubare 15 min a TA (18 25 C) al riparo dalla luce. 9. Fermare la reazione del substrato aggiungendo in ogni pozzetto 100 µl di Soluzione Stop TMB. Mescolare delicatamente il contenuto agitando leggermente la piastra. 10. Misurare la densità ottica con un fotometro a 450 nm (Lunghezza d onda di riferimento: nm) entro 15 min. 12. CONTROLLO DI QUALITA Ogni laboratorio dovrebbe analizzare i campioni nella gamma dei livelli elevati, normali e bassi di CIC C3d per il controllo delle prestazioni dell analisi. Questi campioni dovrebbero essere trattati come ignoti ed i valori determinati in ogni test effettuato. Le tabelle di controllo qualità dovrebbero essere effettuate per seguire le prestazioni dei reagenti forniti. Metodi statistici adeguati dovrebbero essere impiegati per accertare il trend. Il laboratorio dovrebbe fissare i limiti di accettabilità di prestazioni dell analisi. Altri parametri che dovrebbero essere controllati includono le intercette di 80, 50 e 20 % della curva standard per valutare la riproducibilità. In più, la capacità di assorbimento massima dovrebbe essere costante con l esperienza precedente. La deviazione significativa dalle prestazioni stabilite può indicare il cambiamento inosservato negli stati sperimentali o nella degradazione dei reagenti del kit. Reagenti freschi dovrebbero essere usati per determinare il motivo delle variazioni. 13. CALCOLO DEI RISULTATI La DO ottenute per gli standard (asse y, lineare) sono messe in grafico rispetto alla loro concentrazione (asse x, lineare) sia su carta per grafico che con metodo automatico. Per il calcolo della curva standard utilizzare ogni segnale degli standard (omettere ovviamente i valori dei duplicati molto al di fuori dei risultati attesi e impiegare il valore singolo più plausibile). La concentrazione dei campioni di siero e plasma può essere ricavata dalla curva standard. I campioni che mostrano conzentrazioni al di sopra dello standard più elevato devono essere diluiti come descritto nel paragrafo ISTRUZIONI PRE-TEST e ritestati. 14. INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Se la riduzione dei dati controllati dal computer viene utilizzato per calcolare I risultati del test, è imperativo che I valori previsti per il calibratori rientrano nel 10 % delle concentrazioni assegnate. µgeq/ml di IgG aggregate Campioni Negativi < 16 Campioni Dubbi tra 16 e 18 Campioni Positivi > 18 V1_2012_03 4/5
6 15. PARAMETRI CARATTERISTICI Precisione Variazione Intra-Dosaggio La variabilità all interno dello stesso kit è stata stabilita replicando (16x) la misura di due differenti sieri di controllo. La variabilità intra-assay è 6.1 % Variazione Inter-Dosaggio La variabilità tra kit differenti è stata stabilita replicando la misura di due differenti sieri di controllo con due kit appartenenti a lotti diversi. La variabilità inter-assay è 13.9 % Accuratezza La prova di recupero condotta su campioni arricchiti con µgeq/ml di CIC C3d, ha dato un valore medio (±SD) di % ± 5.07 % Sensibilità La concentrazione minima di CIC C3d misurabile che può essere distinta dallo Standard 0 è 0.60 µgeq/ml con un limite di confidenza del 95 %. 16. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO 1. Triolo G., et al J.Clin.Lab.Immunol 13, (1984) 2. Rong-jia Xu et al J.Immunol.Met. 135, (1990) 3. Menzel J.E., et al J.Immunol. Met. 138, 16 (1991) 4. Muso E, et al Nippon Jinzo Gakkai Shi.36(4): (1994) 5. Yoshinoya S, et al J Clin Lab Immunol. 38(4): (1992) V1_2012_03 5/5
7 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /
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