Interleukin-12p70 ELISA

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1 Istruzioni per l Uso Interleukin-12p70 ELISA Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di Interleuchina-12p70 (IL-12p70) umana nel siero, plasma e supernatanti delle colture cellulari umani. BE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 INFORMAZIONI SUL PRODOTTO E MANUALE 1. USO PREVISTO 2 2. SOMMARIO 2 3. PRINCIPIO DEL TEST 3 4. REAGENTI FORNITI 4 5. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE 4 6. PRELIEVO DEI CAMPIONI 5 7. MATERIAL NECESSARI MA NO FORNITI 5 8. PRECAUZIONI PER L USO 5 9. PREPARAZIONE DEI REAGENTI PROCEDURA DEL TEST CALCOLO DEI RISULTATI LIMITI DELLA PROCEDURA PERFORMANCE INFORMAZIONI PER GLI ORDINI SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO (23) 1/18

3 1. USO PREVISTO L IL-12p70 umana ELISA è un dosaggio immunoassorbente legato agli enzimi per il rilevamento quantitativo dell IL-12p70 umana. L IL-12p70 umana ELISA è per uso diagnostico in vitro. Non si usa per procedure terapeutiche. 2. SOMMARIO L interleuchina-12 (IL-12) è una citochina pleiotropica, precedentemente denominata fattore di maturazione dei linfociti citotossici (CLMF) o fattore di stimolazione dei linfociti natural killer (NKSF), prodotta principalmente dai macrofagi stimolati. È stata originariamente identificata come fattore prodotto da linee di linfociti B trasformati del virus umano di Epstein-Barr. IL-12 ha poi dimostrato di essere una citochina proinfiammatoria prodotta da cellule fagocitiche, linfociti B e altre cellule presentanti l antigene che modulano le risposte immunitarie adattative favorendo la generazione di linfociti T-helper di tipo 1. IL-12 esercita svariati effetti biologici sui linfociti T e sui linfociti natural killer umani. A parte la promozione dello sviluppo di Th1 e la sua capacità di promuovere l'attività citolitica, IL-12 media alcune delle sue attività fisiologiche agendo da potente induttore della produzione di interferone (IFN) gamma e stimolando la produzione di altre citochine nei linfociti T e NK del sangue periferico. IFN-γ, quindi, stimola la capacità delle cellule fagocitiche di produrre IL-12 e altre citochine proinfiammatorie. L IFN-g indotto da IL-12 agisce quindi con un sistema a feedback positivo che rappresenta un meccanismo importante di amplificazione nella risposta infiammatoria alle infezioni. Il suo ruolo nel dirigere lo sviluppo di una risposta immunitaria di tipo Th1 dai linfociti T naive dimostra che è fondamentale nella regolazione della risposta immunitaria e suggerisce fortemente la sua potenziale utilità nella terapia antitumorale. IL-12 è una citochina eterodimerica con ponte disolfuro, composta da una catena leggera da 35 kda (p35) e una catena pesante da 40 kda (p40) che determinano l unica forma biologicamente attiva di IL-12 da 70 kda (p70). La subunità p40 può anche formare un omodimero che è in grado di legarsi al recettore di IL-12 e quindi agisce da antagonista di IL-12. La subunità p40, inoltre, è espressa in forte eccesso rispetto a p70. È stato dimostrato il ruolo fondamentale di IL-12 in diverse patogenesi. Livelli plasmatici maggiori sono stati riscontrati in caso di disturbi neurologici. Aumenti significativi sono stati misurati in pazienti autistici e in pazienti affetti da sclerosi multipla. Livelli elevati di IL-12 sono stati riferiti anche in caso di malattie autoimmuni e reazioni infiammatorie croniche come nel liquido sinoviale di pazienti affetti da osteoartrite, artrite reumatoide e spondiloartropatie sieronegative, in pazienti affetti dalla sindrome di Sjögren e da aterosclerosi. Variazioni dei livelli di espressione di IL-12 sono riferite per un ampio numero di infezioni batteriche e virali come ittero ostruttivo, shock settico, infezione da Mycobacterium tuberculosis e infezione da HIV. L interleuchina-12 svolge anche un ruolo cruciale nel rigetto di autotrapianti e in determinate lesioni cutanee infiammatorie (23) 2/18

4 3. PRINCIPIO DEL TEST I micropozzetti vengono rivestiti con un anticorpo di rivestimento IL-12p70 anti-umana. Figura 1 Micropozzetto Rivestito Anticorpo di Rivestimento La IL-12p70 umana presente nel campione o nello standard si lega agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti. Vi si aggiunge un anticorpo anti-umano IL-12p70 biotina coniugato, che si lega con la IL-12p70 umana catturato dal primo anticorpo. Figura 2 Prima Incubazione Standard o Campione Coniugato di Biotina Dopo l incubazione, l anticorpo IL-12p70 anti-umana coniugato biotina non legato viene rimosso durante una fase di lavaggio. Si aggiunge la streptavidina-hrp che si lega all anticorpo IL-12p70 anti-umana biotina coniugato. Figura 3 Seconda Incubazione Streptavidina-HRP - Dopo l incubazione la Streptavidina-HRP non legata viene rimossa con una fase di lavaggio e ai pozzetti viene aggiunta una soluzione dei substrato reattiva all HRP. Figura 4 Terza Incubazione Substrato (23) 3/18

5 In proporzione alla quantità di IL-12p70 umana presente nel campione o nello standard si forma un prodotto colorato. La reazione viene terminata aggiungendo l acido e l assorbanza si misura a 450 nm. Si prepara una curva standard sulla base di 7 diluizioni standard di IL-12p70 umana e si determina la concentrazione del campione di IL-12p70 umana. Figura 5 Substrato post-reazione 4. REAGENTI FORNITI 1 busta d alluminio con una Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpo monoclonale IL-12p70 anti-umana 1 flaconcino (70 µl) di Coniugato di Biotina (anticorpo monoclonale IL-12p70 anti-umana) 1 flaconcino (150 µl) di Streptavidina-HRP 2 flaconcini di Standard di IL-12p70 umana, liofilizzato, 400 pg/ml previa ricostituzione 1 flaconcino di Controllo alto, liofilizzato 1 flaconcino di Controllo basso, liofilizzato 1 flaconcino (12 ml) con Diluente dei Campioni Attenzione: In alcuni rari casi un precipitato insolubile di stabilizzatore della proteina potrebbe essere visibile nella fiala. Questo precipitato non interferisce in alcun modo con il buon risultato dei test e può quindi essere ignorato. 1 flaconcino (5 ml) di Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata 20x (PBS con l 1 % di Tween 20 e 10 % di BSA) 1 bottiglia (50 ml) di Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata 20x (PBS con l 1 % di Tween 20) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione Substrato (Tetrametilbenzidina) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione Bloccante (Acido Fosforico 1M) 4 Copripiastra adesivi 5. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE KIT ELISA Conservare i reagenti del kit ad una temperatura tra 2 C ed 8 C, eccetto per i controlli. Conservare i controlli liofilizzati a -20 C. I reagenti rimanenti, immediatamente dopo l uso, devono essere riposti e conservati al freddo (tra 2 C ed 8 C), i controlli rispettivamente a -20 C. La data di scadenza del kit e dei reagenti è indicata sulle etichette. La scadenza delle componenti del kit può essere garantita solo se le componenti sono conservate in modo corretto e se, in caso di uso ripetuto di un componente, questo reagente non è stato contaminato nel corso delle manipolazioni precedenti (23) 4/18

6 6. RACCOLTA DEI CAMPIONI ED ISTRUZIONI PER LA CONSERVAZIONE Con questo dosaggio sono stati testati il supernatante delle colture cellulari, il siero ed il plasma (EDTA ed eparina). Altri campioni biologici potrebbero essere idonei all uso per questo dosaggio. Dopo la coagulazione, rimuovere il siero dal coagulo non appena possibile. I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio. Non usare campioni emolizzati in maniera grossolana, o lipemici. I campioni devono essere aliquotati e conservati sotto zero a -20 C, per evitare la perdita di IL-12p70 umana bioattiva. Se i campioni devono essere usati entro 24 ore, possono essere conservati a una temperatura tra 2 C ed 8 C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto 13.5). Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelato dev essere portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela. 7. MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI - Pipette graduate da 5 ml e 10 ml - Micropipette adattabili da 5 µl a 1000 µl a canale singolo, con punte usa e getta - Micropipette adattabili da 50 µl a 300 µl, multicanale con punte usa e getta - Serbatoio per micropipette multicanale - Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti - Dispositivo per dispensare la soluzione di lavaggio (bottiglia di lavaggio multicanale o sistema di lavaggio automatico) - Lettore di strisce per micropozzetti in grado di leggere a 450 nm (620 nm come lunghezza d onda riferimento opzionale) - Acqua distillala in vetro o deionizzata - Calcolatore statistico con programma che esegua l analisi di regressione 8. PRECAUZIONI PER L USO - Tutte le sostanze chimiche sono da considerarsi potenzialmente pericolose. Raccomandiamo quindi che il prodotto venga maneggiato esclusivamente da personale debitamente istruito alle tecniche di laboratorio e che venga usato secondo i principi della buona pratica di laboratorio. Indossare indumenti di protezione idonei, come camici da laboratorio, occhiali e guanti di protezione. Evitare il contatto con la pelle o gli occhi. In caso di contatto con pelle o occhi lavare immediatamente con acqua. Consultare lascheda di sicurezza o dichiarazioni di sicurezza del prodotto per indicazioni più specifiche. - L uso dei reagenti è inteso solo per uso diagnostico in vitro e non dev essere usato per procedure terapeutiche. - Non mescolare o sostituire i reagenti con quelli di altri lotti o di diversa provenienza. - Non usare i reagenti dei kit oltre la data di scadenza indicata sull etichetta. - Durante il magazzinaggio o l incubazione non esporre i reagenti del kit a luce intensa. - Non pipettare con la bocca. - Non mangiare o fumare nelle aree di manipolazione dei reagenti dei kit o dei campioni. - Evitare il contatto della pelle o delle membrane mucose con i reagenti dei kit o i campioni. - Durante la manipolazione dei reagenti dei kit o dei campioni indossare guanti di gomma o di lattice usa e getta. - Evitare il contatto della soluzione di substrato con agenti ossidanti e metalli. - Evitare schizzi o generazione di vapori (aerosol) (23) 5/18

7 - Usare punte di pipette e/o pipette usa e getta per evitare la contaminazione microbica o la contaminazione crociata dei reagenti o dei campioni, che potrebbero invalidare il test. - Usare vassoi puliti e dedicati per distribuire il coniugato ed il reagente del substrato. - L esposizione agli acidi inattiva il coniugato. - Per la preparazione del reagente deve essere usata acqua distillata in vetro o deionizzata. - Prima dell uso la soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente. - Decontaminare e eliminare i campioni e tutti i materiali potenzialmente contaminati in quanto potrebbero contenere agenti infettivi. Il metodo preferenziale per la decontaminazione è l autoclavaggio per minimo un ora a C. - I rifiuti liquidi che non contengono acidi e i rifiuti neutralizzati possono essere mescolati con ipoclorito di sodio in volumi tali che la miscela finale contenga l 1.0 % di ipoclorito di sodio. Per una reale decontaminazione sono necessari 30 minuti. I rifiuti liquidi contenenti acidi devono essere neutralizzati prima dell aggiunta d ipoclorito di sodio. 9. PREPARAZIONE DEI REAGENTI Gli Concentrati dei Tamponi di Reagenti devono essere portati a temperatura ambiente e diluiti prima di iniziare la procedura del test. Se si formano cristalli nei Concentrati dei Tamponi, riscaldarli gradualmente al punto che si dissolvano completamente Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Versare tutto il contenuto (50 ml) della Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (20x) in un cilindro graduato pulito da 1000 ml. Portare al volume complessivo di 1000 ml con acqua distillata in vetro o acqua deionizzata. Mescolare con cautela per evitare lo schiumaggio. Trasferire in una bottiglia di lavaggio pulita e conservare a temperatura tra 2 C e 25 C. Tenere in considerazione che il Tampone di Lavaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Il Tampone di Lavaggio (1x) può anche essere preparato al bisogno secondo la seguente tabella: Numero di Strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Versare tutto il contenuto (5 ml) del Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) in un cilindro pulito e graduato da 100 ml. Portare al volume complessivo di 100 ml con acqua distillata. Mescolare con cautela per evitare lo schiumaggio. Conservare a una temperatura tra 2 C e 8 C. Tenere in considerazione che la Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Il Tampone di Dosaggio (1x) può anche essere preparato al bisogno secondo la seguente tabella: Numero di Strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) (23) 6/18

8 9.3. Preparazione di Coniugato di Biotina Tenere in considerazione che il Coniugato di Biotina deve essere usato entro 30 minuti dalla sua diluizione. Fare una diluizione 1:100 della soluzione concentrata di Coniugato di Biotina con il Tampone di Dosaggio (1x) in un tubo di plastica pulito secondo la seguente tabella: Numero di Strisce Coniugato di Biotina (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Streptavidina-HRP Tenere in considerazione che la Streptavidina-HRP deve essere usata entro 30 minuti dalla sua diluizione. Fare una diluizione 1:200 della soluzione concentrata di Streptavidina-HRP con il Tampone di Dosaggio (1x) in un tubo di plastica pulito secondo la seguente tabella: Numero di Stisce Streptavidina-HRP (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Standard IL-12p70 Umana Ricostituire lo standard IL-12p70 umana aggiunendo acqua distillata. Il volume di ricostituzione è indicato sull'etichetta della flaconcino dello standard. Girare o mescolare gentilmente per garantire la completa ed omogenea solubilizzazione (concentrazione dello standard ricostituito = 400 pg/ml). Lasciare lo standard a ricostituire per minuti. Prima di fare le diluizione mescolare bene. Dopo l'uso, lo standard rimanente non può essere riutilizzato e deve essere buttato. La diluizione dello standard può essere fatto direttamente nella piastra (vedi 10.c.) oppure nei tubi (vedi 9.5.1) Diluizione Standard Esterna Etichettare 7 tubi, uno per ogni punto standard. S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7. Quindi preparare diluizioni seriali 1:2 per la curva standard come segue: Pipettare 225 µl di Diluente dei Campioni in ogni tubo. Pipettare 225 µl di standard ricostituito (concentrazione = 400 pg/ml) nel primo tubo, etichettato come S1, e mescolare (concentrazione dello Standard 1 = 200 pg/ml). Pipettare 225 µl di questa diluizione nel secondo tubo, etichettato S2 e mescolare accuratamente prima del trasferimento seguente. Ripetere le diluizioni seriali altre 5 volte creando così i punti della curva standard (vedi Figura 6). Il Diluente dei Campioni serve come bianco (23) 7/18

9 Figura 6 Transferire 225 µl S1 S2 S3 S4 - S7 IL-12p70 Umana Standard Ricostituito Diluente dei Campioni 225 µl Scartare 225 µl 9.6. Controlli Ricostituire aggiungendo 250 µl di acqua distillata ai controlli liofilizzati (10-30 minuti). Centrifugare o mescolare con cautela per garantire una solubilizzazione completa ed omogenea. Per il resto trattare i controlli come i vostri campioni nel dosaggio. Per il range di controllo fare riferimento al certificato di analisi o all etichetta del flaconcino. Conservare i controlli ricostituiti aliquotati a -20 C. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. 10. PROTOCOLLO DI TEST a. Determinare il numero di strisce micropozzetti necessario a testare il numero desiderato di campioni, oltre al numero idoneo di pozzetti necessari per eseguire i bianchi e gli standard. Ogni campione, standard, bianco e campione di controllo opzionale dev essere dosato in duplicato. Rimuovere dal supporto le strisce micropozzetti non usate e conservarle insieme all essiccante fornito nella bustina metallica, chiusa ermeticamente a una temperatura di 2-8 C. b. Lavare le strisce micropozzetti due volte con un Tampone di Lavaggio di circa 400 µl per ogni pozzetto; aspirare completamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l altro. Prima di aspirare, lasciare il tampone di lavaggio all interno dei pozzetti per circa secondi prima dell aspirazione. Fare attenzione a non scalfire la superficie dei pozzetti. Dopo l ultima fase di lavaggio, svuotare i pozzetti e picchiettare le strisce micropozzetti su carta assorbente o su una salvietta di carta per rimuovere il Tampone di Lavaggio in eccesso. Usare le strisce micropozzetti immediatamente dopo il lavaggio. In alternativa, le strisce micropozzetti possono essere collocate capovolte su una carta assorbente bagnata per non oltre 15 minuti. Non lasciar asciugare i pozzetti. c. Diluizione standard sulla piastra per micropozzetti (In alternativa, la diluzione standard si può preparare in tubi - vedi 9.5.1): Aggiungere 100 µl Diluente dei Campioni, in duplicato, a tutti i pozzetti degli standard. Pipettare 100 µl di standard preparato (vedi Preparazione dello Standard 9.5, concentrazione = 400 pg/ml), in duplicato, nei pozzetti A1 ed A2 (vedi Tavola 1). Mescolare il contenuto dei pozzetti A1 e A2 aspirando ed espellendo ripetutamente (concentrazione dello standard 1 S1 = 200 pg/ml) e trasferire 100 µl rispettivamente nei pozzetti B1 e B2 (vedi Figura 7). Fare attenzione a non scalfire la superficie interna dei pozzetti. Ripetere la procedura 5 volte creando due serie di diluizioni standard di IL-12p70 umana con un range da a 3.1 pg/ml. Scartare 100 µl del contenuto degli ultimi micropozzetti (G1, G2) usati. Figura (23) 8/18

10 Transferire 100 µl S1 S2 S3 S4 - S7 IL-12p70 Umana Standard Ricostituito Diluente dei Campioni 100 µl Scartare 100 µl Nel caso di una diluizione esterna dello standard (vedi 9.5.1), pipettare 100 µl di queste diluizioni dello standard (S1 to S7) nei pozzetti dello standard, come da Tavola 1. Tavola 1 La tavola descrive un esempio dell organizzazione dei bianchi, degli standard e dei campioni nelle strisce dei micropozzetti A Standard 1 (200.0 pg/ml) Standard 1 (200.0 pg/ml) Campione 1 Campione 1 B Standard 2 (100.0 pg/ml) Standard 2 (100.0 pg/ml) Campione 2 Campione 2 C Standard 3 (50.0 pg/ml) Standard 3 (50.0 pg/ml) Campione 3 Campione 3 D Standard 4 (25.0 pg/ml) Standard 4 (25.0 pg/ml) Campione 4 Campione 4 E Standard 5 (12.5 pg/ml) Standard 5 (12.5 pg/ml) Campione 5 Campione 5 F Standard 6 (6.3 pg/ml) Standard 6 (6.3 pg/ml) Campione 6 Campione 6 G Standard 7 (3.1 pg/ml) Standard 7 (3.1 pg/ml) Campione 7 Campione 7 H Bianco Bianco Campione 8 Campione (23) 9/18

11 d. Aggiungere 100 µl di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti del bianco. e. Aggiungere 50 µl di Diluente dei Campioni ai pozzetti del campione. f. Aggiungere 50 µl di ogni campione in duplicato ai pozzetti del campione. g. Preparare il Conjugato di Biotina (vedi 9.3 Preparazione del Coniugato di Biotina). h. Aggiungere 50 µl Conjugato di Biotina a tutti i pozzetti. i. Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 2 ore; se è disponibile un vortex per micropiastre, impostare su 400 rpm. j. Preparare la Streptavidina-HRP (fare riferimento alla preparazione della Streptavidina-HRP 9.4). k. Rimuovere il film adesivo e vuotare i pozzetti. Lavare le strisce dei micropozzetti 4 volte come da punto b. del protocollo del test. Procedere immediatamente alla fase seguente. l. Aggiungere 100 µl di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti, compresi i pozzetti del bianco. m. Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 1 ora; se è disponibile un vortex per micropiastre, impostare su 400 rpm. n. Rimuovere il film adesivo e vuotare i pozzetti. Lavare le strisce dei micropozzetti 4 volte come da punto b. del protocollo del test. Procedere immediatamente alla fase seguente. o. Pipettare 100 µl di Soluzione di Substrato TMB in tutti i pozzetti. p. Incubare le strisce dei micropozzetti a temperatura ambiente (18-25 C) per circa 10 minuti. Evitare l esposizione diretta a luce intensa. Lo sviluppo cromatico sulla piastra dev essere monitorato e la reazione del substrato dev essere bloccata (vedi prossimo punto di questo protocollo) prima che i valori dei pozzetti positivi non siano più correttamente registrabili. Il periodo ideale di tempo necessario per lo sviluppo del colore dev essere determinato individualmente per ogni dosaggio. q Si raccomanda di aggiungere la soluzione bloccante quando lo standard più alto ha raggiunto un colore blu scuro. In alternativa, lo sviluppo del colore può essere monitorato con il lettore ELISA a 620 nm. La reazione del substrato dev essere bloccata non appena lo Standard 1 ha raggiunto un DO di Bloccare la reazione dell enzima pipettando velocemente 100 µl di Soluzione Bloccante in ogni pozzetto. E importante che la Soluzione Bloccante venga distribuita velocemente ed uniformemente su tutti i pozzetti per inattivare completamente l enzima. I risultati devono essere letti immediatamente dopo l aggiunta della Soluzione Bloccante, o entro 1 ora se le strisce dei micropozzetti sono conservate al buio e ad una temperatura di 2-8 C. r. Leggere l assorbanza di ogni micropozzetto con uno spettrofotometro usando 450 nm. come lunghezza d onda primaria (in alternativa, 620 nm. come lunghezza d onda di riferimento; da 610 nm a 650 nm. il valore è accettabile). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del produttore e usando i pozzetti del bianco. Determinare l assorbanza sia dei campioni, sia degli standard. Nota: In caso di incubazione senza aver agitato le sostanze i valori della D.O. ottenuti possono essere inferiori a quelli indicati qui di seguito. Tuttavia i risultati sono ancora validi (23) 10/18

12 11. CALCOLO DEI RISULTATI - Calcolare i valori medi dell assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati devono rientrare nel 20 % del valore medio. - Creare una curva standard segnando l assorbanza media di ogni concentrazione standard sull ordinata contro la concentrazione di IL-12p70 umana sull ascissa. Disegnare una curva di best-fit congiungendo i punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri). - Per determinare la concentrazione di IL-12p70 umana circolante per ogni campione, trovare prima il valore medio di assorbanza sull ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva standard. Nel punto d intersezione estendere una linea verticale fino all ascissa e leggere il valore corrispondente della concentrazione di IL-12p70 umana. - Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni sono stati diluiti in proporzione di 1:2 (50 µl di campione + 50 µl Diluente dei Campioni), la concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (x 2). - Il calcolo dei campioni con una concentrazione superiore allo Standard 1 può dare per risultato livelli scorretti e bassi di IL-12p70 umana. Questi campioni richiedono un ulteriore pre-diluizione esterna secondo i valori stimati della IL-12p70 umana, con un Diluente dei Campioni in modo da quantificare con precisione i livelli reali di IL-12p70 umana. - Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione di IL-12p70 umana conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i valori ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non essere validi. - La Figura 8 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per dedurne risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di strisce per micropozzetti su cui si fa il dosaggio. Figura 8 Curva standard rappresentativa per l IL-12p70 umana ELISA. L IL-12p70 umana è stato diluito in 2 fasi seriali nel Diluente dei Campioni. Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva standard dev essere eseguita per ogni gruppo di strisce per micropozzetti su cui si fa il dosaggio Interleukin-12p70 ELISA DO (450 nm) (pg/ml) (23) 11/18

13 Tavola 2 Dati tipici relativi all uso dell IL-12p70 umana ELISA Lunghezza d onda: 450 nm Lunghezza d onda di riferimento: 620 nm Standard Concentrazione di D.O. IL-12p70 Umana (pg/ml) (450 nm) Bianco D.O. Media C.V. (%) I valori DO della curva standard possono variare a seconda delle condizioni di prestazione del dosaggio (ad es.: operatore, tecnica di pipettaggio o effetti della temperatura). Inoltre, il periodo di validità del kit può influenzare l attività enzimatica e quindi l intensità del colore. I valori misurati sono ancora validi. 12. LIMITI DELLA PROCEDURA - Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva standard per ogni esecuzione del test. - La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione crociata tra reagenti può casusare risultati erronei. - Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro riutilizzabili devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell uso. - Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o falsi negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la Soluzione di Lavaggio fresca, riempire con il Tampone di Lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti scoperti, o non permettere che si asciughino per periodi prolungati. - L uso della radioimmunoterapia ha aumentato significativamente il numero di pazienti con anticorpi umani IgG anti-topo (HAMA). HAMA può interferire con dosaggi che utilizzano anticorpi monoclonali murini, portando sia a risultati falsi positivi, sia falsi negativi. I campioni di siero contenenti anticorpi delle immunoglobuline murine possono essere ancora analizzati in questi dosaggi quando le immunoglobuline murine (siero, liquido ascitico o anticorpi monoclonali di specificità irrilevante) vengono aggiunti al campione (23) 12/18

14 13. CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE Sensibilità Il limite di rilevamento dell IL-12p70 umana definito come la concentrazione dell analita, risultante in un assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più 2 deviazioni standard), è stato determinato di 2.1 pg/ml (media di 6 dosaggi indipendenti) Riproducibilità Intra-dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 5 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di IL-12p70 umana. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di IL-12p70 umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 3). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 3.0 %. Tavola 3 La concentrazione media di IL-12p70 umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione Campione Esperimento Concentrazione Media IL-12p70 Umana (pg/ml) Coefficiente di Variazione (%) (23) 13/18

15 Inter-dosaggio La riproducibilità da dosaggio a dosaggio nell ambito di un laboratorio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di IL-12p70 umana. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di IL-12p70 umana ed il coefficiente di variazione calcolato su 18 determinazioni di ogni campione (vedi Tavola 4). Il coefficiente di variazione inter-dosaggio complessivo calcolato era del 4.8 %. Tavola 4 La concentrazione media di IL-12p70 umana ed il coefficiente di variazione di ogni campione: Campione Concentrazione Media di Coefficiente di IL-12p70 Umana (pg/ml) Variazione (%) Test di Recupero Il test di recupero è stato valutato addizionando 4 livelli di IL-12p70 umana al siero. I recuperi sono stati determinati nel corso di 3 esperimenti indipendenti, ognuno con 4 replicati. La quantità di IL-12p70 umana endogena umana in campioni non addizionati è stata sottratta dai valori addizionati. l recupero rientrava in un range dal 79 % al 118 % con un recupero medio complessivo dell 103 % Parallelismo della Diluizione 4 campioni di siero con diversi livelli di IL-12p70 umana sono stati analizzati in diluizioni seriali multiple di 2 e con 4 replicati l uno. Il recupero rientrava in un range dal 83 % al 122 % con un recupero medio complessivo del 102 % (vedi Tavola 5). Tavola 5 Campione Diluizione 1:2 1:4 1:8 1:16 1:2 1:4 1:8 1:16 1:2 1:4 1:8 1:16 1:2 1:4 1:8 1:16 Concentrazione Attesa di IL-12p70 Umana (pg/ml) Concentrazione Misurata di IL-12p70 Umana (pg/ml) Recupero di Concentrazione Attesa di IL-12p70 Umana (%) (23) 14/18

16 13.5. Stabilità del Campione Stabilità a Congelamento-Scongelamento Aliquote di campioni di siero (addizionati o non addizionati) sono state conservate a -20 C e scongelate 5 volte e sono stati determinati i livelli di IL-12p70 umana. Non è stata rilevata alcuna riduzione significativa dell immunoreattività di IL-12p70 umana in seguito a un massimo di tre cicli di congelamento/scongelamento. Una riduzione significativa (20 %) dell immunoreattività di IL-12p70 umana è stata rilevata in seguito a ulteriori cicli di congelamento/scongelamento Stabilità della Conservazione Aliquote di campioni di siero (addizionate o non addizionate) sono state conservate a -20 C, 2-8 C, a temperatura ambiente (TA) ed a 37 C e il livello di IL-10 umana ne è stato determinato dopo 24 ore. Durante la conservazione a -20 C, 2-8 C e temperatura ambiente (TA) non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività della IL-12p70 umana. Durante la conservazione a 37 C, dopo 24 h, si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività alla IL-12p70 umana (20 %) Comparazione tra Siero e Plasma Di alcuni individui sono stati valutati il siero e l EDTA, il citrato ed il plasma eparinato ottenuti nello stesso momento temporale. Le concentrazioni di IL-12p70 umana non erano significativamente diverse; quindi tutti questi fluidi corporei sono idonei al dosaggio. Tuttavia, è molto raccomandato di garantire l uniformità delle preparazioni del sangue Specificità L interferenza dei fattori circolanti del sistema immune è stata valutata aggiungendo queste proteine in concentrazioni fisiologicamentre rilevanti ad un siero IL-12p70 umana positivo. Non è stata rilevata alcuna cross-reattività Valori Attesi No c erano livelli rilevabili di IL-12p70 umana trovati. I livelli di IL-12p70 umana elevati dipendono del tipo di disturbi immunologici Calibrazione Il dosaggio immune è calibrato con IL-12p70 umana ricombinante altamente purificato che è stato valutato in base allo standard di riferimento internazionale NIBSC 95/544 ha dimostrato di essere il suo equivalente. L NIBSC 95/544 è quantificato in unità internazionali (IU); 1IU corrisponde a 100 pg di IL-12p70 umana. 14. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI Per gli ordini contattare: Per informazioni tecniche contattare: Vedi ultima pagina. IBL@IBL-International.com (23) 15/18

17 15. SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Lavaggio 20x (50 ml) a 950 ml di acqua distillata. Numero di Strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (ml) Acqua Distillata (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Dosaggio 20x (5 ml) a 95 ml di acqua distillata. Numero di Strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrato (ml) Coniugato di Biotina Acqua Distillata (ml) Fare una diluizione 1:100 di Coniugato di Biotina nel Tampone di Dosaggio (1x): Numero di Strisce Coniugato di Biotina (ml) Streptavidina-HRP Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Fare una diluizione 1:200 di Streptavidina-HRP nella Soluzione Tampone di Dosaggio (1x): Numero di Strisce Streptavidina-HRP (ml) Standard IL-12p70 Umana Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Reconstituire il standard IL-12p70 umana liofilizzato con acqua distillata. (Il volume di ricostituzione è dichiarato sull etichetta del flaconcino dello standard.) Controlli Aggiungere 250 µl di acqua distillata ai controlli liofilizzati (23) 16/18

18 16. SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST 1. Determinare il numero di strisce di micropozzetti richiesto. 2. Lavare le strisce di micropozzetti due volte con il Tampone di Lavaggio. 3. Diluizione standard sulla piastra di micropozzetti: Aggiungere 100 µl di Diluente dei Campioni, in duplicato, a tutti i pozzetti standard. Pipettare 100 µl di standard preparato nei primi pozzetti e creare diluizioni di standard trasferendo 100 µl da pozzetto a pozzetto. Scartare 100 µl dagli ultimi pozzetti. Alternativamente diluizione esterna dello standard in tubi (vedi ): Pipettare 100 µl di queste diluizioni dello standard nei micropozzetti. 4. Aggiungere 100 µl di Diluente dei Campioni, in duplicato, ai pozzetti del bianco. 5. Aggiungere 50 µl Diluente dei Campioni ai pozzetti dei campioni. 6. Aggiungere 50 µl di campioni in duplicato ai pozzetti per i campioni designati. 7. Preparare il Coniugato di Biotina. 8. Aggiungere 50 µl di Conjugato di Biotina a tutti i pozzetti. 9. Coprire le strisce dei micropozzetti ed incubare per due ore (18-25 C). 10. Preparare la Streptavidina-HRP. 11. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 4 volte con il Tampone di Lavaggio. 12. Aggiungere 100 µl di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti. 13. Coprire le strisce di micropozzetti ed incubare per 1 ora a temperatura ambiente (18-25 C). 14. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 4 volte con il Tampone di Lavaggio. 15. Aggiungere 100 µl di Soluzione di Substrato TMB a tutti i pozzetti. 16. Incubare le strisce di micropozzetti per circa 10 minuti a temperatura ambiente (18-25 C). 17. Aggiungere 100 µl di Soluzione Bloccante a tutti i pozzetti. 18. Azzerare il lettore di micropozzetti e misurare l intensità del colore a 450 nm. Annotazione: Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni sono stati diluiti in proporzione 1:2 (50 µl di campione + 50 µl Diluente dei Campioni), la concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (x2) (23) 17/18

19 17. Riferimenti Bibliografici Sul Prodotto 1. Gillessen, S.; Carvajal, D.; Ling, P.; Podlaski, F. J.; Stremlo, D. L.; Familletti, P. C.; Gubler, U.; Presky, D. H.; Stern, A. S.; Gately, M. K.. Mouse interleukin-12 (IL-12) p40 homodimer: a potent IL-12 antagonist. Eur.J.Immunol. 1995; 25: Chehimi, J.; Starr, S. E.; Frank, I.; D'Andrea, A.; Ma, X.; MacGregor, R. R.; Sennelier, J.; Trinchieri, G.. Impaired interleukin 12 production in human immunodeficiency virus-infected patients. J.Exp.Med. 1994; 179: Denis, M.; Ghadirian, E.. Dysregulation of interleukin 8, interleukin 10, and interleukin 12 release by alveolar macrophages from HIV type 1-infected subjects. AIDS Res.Hum.Retroviruses 1994; 10: Sieling, P. A.; Modlin, R. L.. Cytokine patterns at the site of mycobacterial infection. Immunobiology 1994; 191: Tahara, H.; Lotze, M. T.. Antitumor effects of interleukin-12 (IL-12): applications for the immunotherapy and gene therapy of cancer. Gene Ther. 1995; 2: Germann, T.; Rude, E.. Interleukin-12. Int.Arch.Allergy Immunol. 1995; 108: Sosroseno, W.; Herminajeng, E.; Goeno, S.. The interleukin network in the immunopathogenesis of oral diseases. Asian Pac.J.Allergy Immunol. 1994; 12: Ling, P.; Gately, M. K.; Gubler, U.; Stern, A. S.; Lin, P.; Hollfelder, K.; Su, C.; Pan, Y. C.; Hakimi, J.. Human IL-12 p40 homodimer binds to the IL-12 receptor but does not mediate biologic activity. J.Immunol. 1995; 154: Torre, D.; Zeroli, C.; Ferrario, G.; Bonetta, G.; Giola, M.; Speranza,F.; Fiori, G. P.. Serum levels of interleukin-12 in adult and paediatric patients with HIV-1 infection. AIDS 1995; 9: Chia, Y. W.; Carachi, R.; Armstrong, A. A.; McGarry, G. W.; Carrington, D.. Serum alpha interferon in children with right iliac fossa pain. J.R.Soc.Med. 1993; 86: Wolf, S. F.; Sieburth, D.; Sypek, J.. Interleukin 12: a key modulator of immune function. Stem Cells 1994; 12: Fulton, S. A.; Johnsen, J. M.; Wolf, S. F.; Sieburth, D. S.; Boom, W. H.. Interleukin-12 production by human monocytes infected with Mycobacterium tuberculosis: role of phagocytosis 42. Infect.Immun. 1996; 64: (23) 18/18

20 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /