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1 ELISA NF-Light (Neurofilament light) ITALIANO Istruzioni per l'uso ELISA NF-Light (Neurofilament light) Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa della proteina del neurofilamento leggero (NF-L) umano nel fluido cerebrospinale. Gli anticorpi sviluppano una reazione crociata con il neurofilamento leggero di origine murina, bovina e di macaco e possono essere utilizzati per scopi di ricerca sulle specie succitate. h X 12x8 i w l 2-8 C UE: V C Stati Uniti: solo a scopo di ricerca Non utilizzare in procedure diagnostiche M UmanDiagnostics AB Box 7996 Telefono: +46(0) info@umandiagnostics.com Umea, Svezia Sulla pagina iniziale dell azienda si possono scaricare direttamente le istruzioni per l'uso in altre lingue.
2 Uso previsto Dosaggio immunoenzimatico per le determinazioni quantitative della proteina del neurofilamento leggero (NF-L) umano nel fluido cerebrospinale. Gli anticorpi sviluppano una reazione crociata con il neurofilamento leggero di origine murina, bovina e di macaco e possono essere utilizzati per scopi di ricerca sulle specie succitate. Introduzione Il dosaggio NF-Light (neurofilamento leggero) di UmanDiagnostics è un dosaggio immunoenzimatico progettato per le determinazioni quantitative del NF leggero nel fluido cerebrospinale umano. Il test utilizza due anticorpi monoclonali non competitivi molto specifici (Norgren et al., 2002). I neurofilamenti sono i componenti citoscheletrici principali nelle cellule neuronali. Essi sono importanti per il mantenimento del calibro assonale e dell'integrità morfologica, che influenza la velocità e la fedeltà delle trasmissioni neuronali. Esistono tre diverse catene del neurofilamento, denominate in base alle loro dimensioni. Esse sono, rispettivamente, neurofilamento leggero, medio e pesante. Il neurofilamento leggero costituisce l ossatura su cui sono co-assemblate le catene più pesanti, formando la fibra del neurofilamento (Lee et al., 1993). Dopo lesioni delle cellule nervose causate da traumi diretti o da processi degenerativi lenti, il contenuto della cellula viene rilasciato nel comparto adiacente così da consentire le determinazioni quantitative delle proteine assonali. Livelli aumentati del neurofilamento leggero sono stati osservati in varie malattie degenerative come ad esempio sclerosi laterale amiotrofica, malattia di Alzheimer, sclerosi multipla e in modelli animali quali l encefalomielite autoimmune sperimentale cronica (Rosengren et al, 1996; Norgren et al., 2003, 2004, 2005). Il dosaggio è un test sandwich ELISA su fase solida a 2 siti. Uno specifico anticorpo monoclonale forma la copertura di una superficie solida e si lega al neurofilamento leggero. La rivelazione avviene mediante l'uso di un altro anticorpo monoclonale coniugato specifico. Le determinazioni quantitative sono eseguite mediante turnover enzimatico di un substrato incolore a formare un prodotto colorato, che corrisponde alla quantità di neurofilamento leggero nel campione. Intervallo di misurazione: da 100 pg/ml a pg/ml Limite di rilevazione: 32 pg/ml Precisione: CV % intra-dosaggio <5 CV % intra-dosaggio <9 Tempo di incubazione: 2,5 ore Dimensione del campione: 50 µl / replicato Temperatura di conservazione: 2-8 C. Tenere al riparo dal calore o dai raggi solari Periodo di validità: 18 mesi dalla data di produzione Una volta aperta, la piastra a strip NF-Light deve essere utilizzata entro 4 settimane. Assicurarsi che la piastra a strip aperta sia sigillata per evitare l ingresso di umidità. Avvertenze e precauzioni 1. Solo per uso diagnostico in vitro. Solo per uso professionale. 2. Prima di iniziare il dosaggio, leggere completamente e con attenzione le istruzioni per l'uso. Utilizzare la versione valida del foglio illustrativo fornita con il kit. Assicurarsi di aver compreso tutte le istruzioni. 3. In caso di danni gravi alla confezione del kit, contattare in forma scritta il proprio fornitore entro e non oltre una settimana dopo il ricevimento del kit. Non utilizzare i componenti danneggiati. Tenere da parte i componenti danneggiati per le questioni correlate al reclamo. 4. Non mescolare reagenti di lotti differenti. Non usare i reagenti scaduti. 5. Per la preparazione della soluzione di coniugato, utilizzare la provetta Sarstedt da 15 ml inclusa ( ). 1 (6)
3 6. Si consiglia di analizzare in duplicato i campioni, i controlli e gli standard. Ripetere il dosaggio in presenza di ampie deviazioni tra i campioni. 7. Seguire la buona prassi di laboratorio e le linee guida relative alla sicurezza. Indossare camici da laboratorio, guanti monouso e occhiali protettivi quando richiesto. 8. Evitare il contatto con il reagente di arresto. Esso può causare irritazioni e ustioni cutanee. Scheda di dati di sicurezza dei materiali La scheda relativa a questo prodotto è disponibile, su richiesta, direttamente presso UmanDiagnostics. 9. I prodotti chimici e i reagenti preparati o utilizzati devono essere trattati come rifiuti pericolosi secondo le linee guida o le normative nazionali relative al rischio biologico e alla sicurezza. 10. Utilizzare un agitatore da banco orbitale per ELISA a 800 giri/min. Contenuto del kit: Contenuto Componente del kit Quantità Copri-piastra 2 pezzi Tubetto da 15 ml per diluizione del coniugato 2 pezzi PLATE Piastra a strip anti-nf leggero, sigillata, sotto vuoto, prerivestita 12 x 8 pozzetti STOP Reagente di arresto 1 x 6 ml TMB Substrato TMB pronto per l'uso 1 x 12 ml SAMDIL Tampone di diluizione del campione 1 x 40 ml CONDIL Tampone di diluizione del coniugato 1 x 12 ml CONJ Coniugato streptavidina-hrp concentrato 1 x 260 µl 50xTRAC mab anti-nf-l concentrato (50x) marcato con biotina 1 x 260 µl STAND NF-L bovino concentrato, liofilizzato 2 flaconcini 10xWASH Tampone di lavaggio concentrato (10x) 2 x 40 ml Cromogeno e reagenti di arresto Enzima: perossidasi di rafano Substrato: tetrametilbenzidina, TMB Reagente di arresto: H 2 SO 4 8% v/v (attenzione: corrosivo) Dispositivi essenziali non inclusi: Lettore per piastre di microtitolazione da 450 nm (lunghezza d'onda di riferimento, nm) Micropipette da µl Miscelatore vortex Agitatore da banco orbitale per ELISA (800 giri/min) Acqua deionizzata Bottiglia di lavaggio, sistema di lavaggio automatico o semi-automatico per piastre di microtitolazione Carta assorbente, puntali per pipette e cronometro Provette in polistirene o polipropilene per la diluizione dello standard e del campione YImportanti informazioni: durante la preparazione della soluzione di coniugato, usare solo la provetta da 15 ml inclusa. Proprietà del test Tipi di campioni Il test ELISA NF-light è stato sviluppato per l'analisi di campioni di fluido cerebrospinale e non può essere utilizzato nella forma attuale per l'analisi di campioni di sangue. Dipendenza dalla temperatura Il dosaggio è stato sviluppato per la temperatura ambiente (20-25 C). Intervallo di misurazione La curva standard copre l'intervallo di pg/ml di NF-L (vedere la curva a pagina 5). Non è consentita l'estrapolazione oltre la curva e ciò implica che i campioni esterni alla curva devono essere ulteriormente diluiti e rianalizzati. 2 (6)
4 Preparazione del reagente Tampone di lavaggio Diluire il contenuto totale di una bottiglia di tampone di lavaggio concentrato 10x con acqua deionizzata fino a un volume finale di 400 ml. Il tampone di lavaggio non utilizzato diluito può essere conservato a temperatura ambiente e deve essere utilizzato entro due mesi. Il concentrato di lavaggio 10x può apparire opalescente a causa della concentrazione elevata di sale (nessun effetto sulle prestazioni del dosaggio). Standard La ricostituzione e la preparazione delle serie di diluizioni dello standard devono avvenire subito prima dell'uso. Il punto standard massimo ( pg/ml) si ottiene mediante ricostituzione di un flaconcino di standard liofilizzato con il volume di diluente del campione indicato sull'etichetta della bottiglia. Agitare brevemente mediante vortex e tenere a temperatura ambiente. Etichettare 6 micro-provette, una per ogni punto standard (cioè 5000 pg/ml, 2500 pg/ml, 1000 pg/ml, 500 pg/ml, 100 pg/ml e 0 pg/ml). Diluire lo standard secondo la tabella di diluizione seguente: Diluizione dello standard: Provetta n. Diluente del campione Standard dalla provetta n. Ricostituire con il diluente del campione (SAMDIL) secondo quanto indicato sull etichetta applicata al flaconcino dello standard µl 300 µl (flaconcino) µl 300 µl (1) µl 240 µl (2) µl 300 µl (3) µl 60 µl (4) µl 0 µl 0 Flaconcino Concentrazione pg/ml Lo standard ricostituito deve essere usato immediatamente e non può essere riutilizzato. Tracciante Direttamente prima dell'uso, diluire il tracciante concentrato (TRAC 50x; mab anti-nf-l biotina) 1:50 con il diluente del campione. Mescolare accuratamente invertendo la provetta o mediante vortex. Coniugato Direttamente prima dell'uso, diluire il coniugato concentrato (CONJ; coniugato streptavidina-hrp concentrato) con il diluente del coniugato nella provetta Sarstedts da 15 ml inclusa, secondo quanto indicato sull etichetta del flaconcino. Mescolare accuratamente invertendo la provetta o mediante vortex. 3 (6)
5 Istruzioni sul dosaggio Prima dell uso, tutti i reagenti del dosaggio devono essere portati a temperatura ambiente. Dopo ogni ciclo di lavaggio la piastra deve essere asciugata tamponandola con carta assorbente. È MOLTO IMPORTANTE che l agitazione della piastra avvenga a 800 giri/min. 1. Diluire i campioni di FCS con pari quantità (1+1) di diluente del campione a un volume minimo totale di 210 µl. Gli standard ricostituiti e diluiti secondo la tabella di diluizione dello standard sono pronti per l'uso (cioè, non vanno ulteriormente diluiti). 2. Lavare con tampone di lavaggio i pozzetti da utilizzare (3x300 µl). Il tampone di lavaggio aggiunto può essere aspirato oppure rimosso tamponando la piastra con materiale assorbente subito prima del ciclo di lavaggio successivo. 3. Aggiungere 100 µl di ogni standard e campione in duplicato. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente (20-25 C) e agitare (800 giri/min). 4. Lavare i pozzetti con il tampone di lavaggio (3x300 µl), vedere punto Aggiungere a ogni pozzetto 100 µl di anticorpo tracciante appena diluito. Incubare per 45 minuti a temperatura ambiente (20-25 C) e agitare (800 giri/min). 6. Lavare i pozzetti con tampone di lavaggio (3x300 µl), vedere punto Aggiungere a ogni pozzetto 100 µl di coniugato appena diluito (streptavidina-hrp). Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (20-25 C), e agitare (800 giri/min). 8. Lavare i pozzetti con tampone di lavaggio (3x300 µl), vedere punto Aggiungere a ogni pozzetto 100 µl di TMB. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (20-25 C) e agitare (800 giri/min). 10. Aggiungere a ogni pozzetto 50 µl di reagente di arresto e leggere l'assorbanza a 450 nm (lunghezza d'onda di riferimento nm). Y Il reagente di arresto contiene acido solforico diluito ed è corrosivo. Variazioni nelle prestazioni o nelle caratteristiche del dosaggio Eventuali variazioni ipotetiche nelle prestazioni e nelle caratteristiche del dosaggio saranno descritte nelle istruzioni per l'uso specifiche per ogni kit. Campioni Il FCS non deve essere contaminato con il sangue. Tutti i campioni dei pazienti devono essere considerati potenzialmente contagiosi. Dopo la puntura lombare, i campioni devono essere conservati a -80 C dentro provette di polipropilene. Evitare azioni di congelamento/scongelamento ripetute. Stabilità del campione La stabilità del campione è stata valutata in 5 diversi campioni clinici. La reattività del campione dopo diversi trattamenti è stata confrontata con quella dello stesso campione conservato a -80 C. % media del controllo a Intervallo medio % -80 C Congelamentoscongelamento 4 cicli Conservazione 5-8 C 1 settimana 99, ore a TA (22 C) C 1 mese 95, Risultati I risultati possono essere calcolati automaticamente usando un pacchetto software per immunodosaggio. La trasformazione di Marquardt a 4 parametri fornisce il miglior adattamento della curva (vedere di seguito una curva standard tipica). Se non è disponibile alcun software per immunodosaggio, la concentrazione di NF-L viene calcolata tracciando la DO media a (λ450 meno λ620) rispetto alle concentrazioni standard note. 4 (6)
6 Tutti i livelli del test sono ottenuti direttamente dal pacchetto software per immunodosaggio, o dalla curva tracciata manualmente. I campioni che mostrano concentrazioni superiori al massimo punto standard devono essere ulteriormente diluiti e rianalizzati. Quando si analizza un campione con livelli previsti superiori alla curva standard, il campione deve essere prima diluito con pari quantità di diluente del campione in base al punto 1 nelle istruzioni del dosaggio. A questo dovrebbe seguire una seconda diluizione impostata in modo tale che la concentrazione raggiunga i livelli coperti dalla curva standard. La concentrazione letta dalla curva deve essere moltiplicata per il fattore di diluizione applicato nella seconda fase. I risultati migliori si ottengono solitamente omettendo la misurazione nell intervallo standard molto basso e molto alto. YI valori ottenuti dalla curva standard corrispondono direttamente al livello di NF-L. Curva standard DO media trasformazione di Marquardt a 4 parametri Valori previsti È stato esaminato FCS da 50 soggetti apparentemente sani senza alcun segno noto di malattia neurologica. I valori normali misurati erano compresi fra 112 e 821 pg/ml. I soggetti sani sono stati suddivisi in tre gruppi di età, e i livelli di riferimento sono stati definiti come livello medio di NF-L + 2 DS. Età Livello di riferimento < 30 anni < 290 pg/ml (n=17) anni < 380 pg/ml (n=15) da 40 a < 60 anni < 830 pg/ml (n=18) I risultati sono validi solo se il test è stato eseguito secondo le istruzioni per l uso, e devono essere correlati ad altre osservazioni cliniche e test diagnostici. L utilizzatore deve attenersi strettamente alle regole della BPL (Buona Prassi di Laboratorio) o ad altri standard/regolamenti applicabili. È raccomandabile che ogni laboratorio stabilisca il proprio intervallo di valori normali, e usi come controlli interni campioni con livelli noti di neurofilamento leggero. Prestazioni Sensibilità analitica (Limite di rilevazione) Precisione Intra-dosaggio Inter-dosaggio Recupero (dopo i picchi) Linearità 32 pg/ml LOB+1,645x DS (standard 100 pg/ml) Bassa (250 pg/ml) Alta (5000 pg/ml) CV 4,8% CV 3% CV 9,1% CV 3% 250 pg/ml 500 pg/ml 2500 pg/ml 88,4% Intervallo pg/ml 91% Diluizione seriale 1:128 98,7% Intervallo 93,4 109% Precisione media CV 4% CV 6% Recupero medio 93% Recupero medio 99,8% 5 (6)
7 Garanzia I dati relativi alle prestazioni qui presentati sono stati ottenuti utilizzando la procedura indicata. Qualsiasi cambiamento o modifica della procedura che non segua le raccomandazioni di UmanDiagnostics AB potrebbe influire sui risultati, e in questo caso UmanDiagnostics AB non riconosce alcuna altra garanzia espressa, implicita o conforme alla legge, compresa la garanzia implicita di commerciabilità e idoneità all'uso. In tal caso, UmanDiagnostics AB e i suoi distributori autorizzati, non saranno da ritenere responsabili per eventuali danni, diretti, indiretti o consequenziali. Bibliografia: Lee MK, Xu Z, Wong PC, Cleveland DW. Neurofilaments are obligate heteropolymers in vivo. J Cell Biol Sep;122(6): Norgren N, Karlsson JE, Rosengren L, Stigbrand T. Monoclonal antibodies selective for low molecular weight neurofilaments. Hybrid Hybridomics Feb; 21(1): 53-9 Norgren N, Rosengren L, Stigbrand T. Elevated neurofilament levels in neurological diseases. Brain Res Oct 10;987(1): Norgren N, Sundstrom P, Svenningsson A, Rosengren L, Stigbrand T, Gunnarsson M. Neurofilament and glial fibrillary acidic protein in multiple sclerosis. Neurology Nov 9;63(9): Norgren N, Edelstam A, Stigbrand T. Cerebrospinal fluid levels of neurofilament light in chronic experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain Res Bull Oct 30;67(4): Rosengren LE, Karlsson JE, Karlsson JO, Persson LI, Wikkelso C. Patients with amyotrophic lateral sclerosis and other neurodegenerative diseases have increased levels of neurofilament protein in CSF. J Neurochem Nov;67(5): Symbols / Symbole / Symboles / Simboli / Simbolos / Σύµβολα h H g X V i w l M Y Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N. o Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Use by: / Verwendbar bis: / Utilisé à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N. o : / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N. o de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! 6 (6)
NF-light ELISA è destinato esclusivamente all uso diagnostico in vitro e non deve essere impiegato per uso interno nei soggetti umani o animali.
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