Interleukin-22 ELISA

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1 Istruzioni per l Uso Interleukin-22 ELISA Saggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di IL-22 umana. BE x8 2-8 C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 INFORMAZIONI SUL PRODOTTO E MANUALE 1. USO PREVISTO 2 2. SOMMARIO 2 3. PRINCIPIO DEL TEST 3 4. REAGENTI FORNITI 4 5. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE 5 6. PRELIEVO DEI CAMPIONI 5 7. MATERIAL NECESSARI MA NO FORNITI 5 8. PRECAUZIONI PER L USO 6 9. PREPARAZIONE DEI REAGENTI PROCEDURA DEL TEST CALCOLO DEI RISULTATI LIMITI DELLA PROCEDURA PERFORMANCE INFORMAZIONI PER GLI ORDINI SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST (23) 1/18

3 1. USO PREVISTO Saggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di IL-22 umana. IL-22 ELISA umano è solo per ricerca. Non per procedure diagnostiche o terapeutiche. 2. SOMMARIO IL-22 / TIF (IL-10-correlato fattore indotta da cellule T) è una nuova citochina originariamente identificata come un gene indotto da IL-9 nei linfociti T murini e mostrano la somiglianza del 22% con gli aminoacidi di IL-10. Nel topo, il gene IL-22 si trova sul cromosoma 10, nella stessa regione del gene gamma IFN. Sebbene sia un gene singolo in BALB / c e DBA / 2 topi, il gene IL-22 viene duplicato in altri ceppi come C57B1 / 6, FVB e 129. Le due copie, che mostrano identità nucleotidica del 98% nella regione di codifica, sono stati chiamati IL-TIF alfa e IL-TIF beta con il gene beta-il-tif beta sia regolato in modo differenziato o non espresso affatto. IL-22 è prodotto da cellule Th1 e NK attivate che agiscono principalmente sulle cellule epiteliali ed è coinvolto nelle risposte infiammatorie. Né le cellule immunitarie riposanti né quelle attivate esprimono il recettore IL-22 e IL-22 non ha effetti su queste cellule in vitro e in vivo. Al contrario, le cellule della pelle e dei sistemi digestivi e respiratori rappresentano obiettivi preposti di questa citochina. Così IL-22 non serve alla comunicazione tra le cellule immunitarie ma è un mediatore di cellule T che promuove direttamente l'immunità innata e non specifica dei tessuti. IL-22 serve come molecola protettiva per contrastare la natura distruttiva della risposta immunitaria per limitare i danni tissutali. Interleukin-22 (IL-22) è una citochina che regola la produzione di proteine di fase acuta della risposta immunologica. Insieme al suo recettore (IL-22R1), associato al recettore 2 dell'interleuchina-10 (IL-10R2), IL-22 promuove l'attivazione del trasduttore di segnali e dell'attivatore della trascrizione (STAT) e di molte altre risposte cellulari. Un recettore solubile chiamato proteina legante interleuchina-22 (IL-22BP) è anche in grado di legare l'il-22 come un antagonista proteico naturale e probabilmente prevede una regolazione sistemica dell'attività di IL-22. IL-22, in contrasto con il suo relativo IFN-gamma, regola l'espressione di pochi geni in cheratinociti. Ciò è dovuto a vari segnali di trasduzione. Gli effetti di IL-22 sono trascrizionali e indipendenti dalla sintesi e secrezione proteica, o mediate da una proteina secreta. Le condizioni infiammatorie, ma non la differenziazione della cheratinociti, amplificano gli effetti dell'il-22. L'applicazione di IL-22 nei topi aumenta l'espressione cutanea S100A9 e MMP1. Pazienti psoriasici presentano livelli elevati di IL-22, correlati alla gravità della malattia. IL-22 svolge un ruolo protettivo in epatite mediata da cellule T indotta da Concanavalin A (Con A), agendo da fattore di sopravvivenza per gli epatociti. IL-22 è presente in quantità elevate nel sangue dei pazienti affetti da Crohn in contrasto con IFN-gamma e IL (23) 2/18

4 3. PRINCIPIO DEL TEST I micropozzetti vengono rivestiti con un anticorpo di rivestimento IL-22 anti-umano. Figura 1 Micropozzetto Rivestito Anticorpo di Rivestimento Figura 2 Il IL-22 umano presente nel campione o nello standard si lega agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti. Prima Incubazione Standard o Campione Vi si aggiunge un anticorpo anti-umano IL-22 coniugato alla biotina, che si lega con il VEGF-A umano catturato dal primo anticorpo. Figura 3 Seconda Incubazione Dopo l incubazione l anticorpo IL-22 coniugato alla biotina non legato viene rimosso durante una fase di lavaggio. Si aggiunge la streptavidina-hrp che si lega all anticorpo IL-22 coniugato alla biotina. Figura 4 Standard o Campione Coniugato di Biotina Terza Incubazione Streptavidina-HRP (23) 3/18

5 Figura 5 Dopo l incubazione la Streptavidina-HRP non legata viene rimossa con una fase di lavaggio e ai pozzetti viene aggiunta una soluzione dei substrato reattiva all HRP Quarta Incubazione Substrato In proporzione alla quantità di IL-22 umano presente nel campione o nello standard si forma un prodotto colorato. La reazione viene terminata aggiungendo l acido e l assorbanza si misura a 450 nm. Si prepara una curva standard sulla base di 7 diluizioni standard di IL-22 umano e si determina la concentrazione del campione di VEGF-A umano. Figura 6 Substrato post-reazione 4. REAGENTI FORNITI 1 busta d alluminio con una Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpo monoclonale IL-22 anti-umano 1 flaconcino (140 μl) di Coniugato di Biotina (anticorpo monoclonale IL-22 anti-umano) 1 flaconcino (150 μl) di Streptavidina-HRP 2 flaconcini di Standard di IL-22 umano, liofilizzato, 4 ng/ml dopo ricostituzione 1 flaconcino (12 ml) Diluente dei Campioni 1 flaconcino (5 ml) di Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata 20x (PBS con l 1 % di Tween 20 e 10 % di BSA) 1 bottiglia (50 ml) di Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata 20x (PBS con l 1 % di Tween 20) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione Substrato (Tetrametilbenzidina) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione Bloccante (Acido Fosforico 1M) 6 Copripiastra adesivi (23) 4/18

6 5. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE KIT ELISA Conservare i reagenti del kit ad una temperatura tra 2 C ed 8 C, eccetto per i controlli. Conservare i controlli liofilizzati a -20 C. I reagenti rimanenti, immediatamente dopo l uso, devono essere riposti e conservati al freddo (tra 2 C ed 8 C). La data di scadenza del kit e dei reagenti è indicata sulle etichette. La scadenza delle componenti del kit può essere garantita solo se le componenti sono conservate in modo corretto e se, in caso di uso ripetuto di un componente, questo reagente non è stato contaminato nel corso delle manipolazioni precedenti. 6. RACCOLTA DEI CAMPIONI ED ISTRUZIONI PER LA CONSERVAZIONE Con questo dosaggio sono stati testati il supernatante delle colture cellulari, il siero, il plasma (EDTA ed eparina) ed il liquido amniotico. Altri campioni biologici potrebbero essere idonei all uso per questo dosaggio. Dopo la coagulazione, rimuovere il siero dal coagulo non appena possibile. I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio. Non usare campioni emolizzati in maniera grossolana, o lipemici. I campioni devono essere aliquotati e conservati sotto zero a -20 C, per evitare la perdita di IL-22 umano bioattivo. Se i campioni devono essere usati entro 24 ore, possono essere conservati a una temperatura tra 2 C ed 8 C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto 13.5). Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelato dev essere portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela. 7. MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI - Pipette graduate da 5 ml e 10 ml - Micropipette adattabili da 5 μl a 1000 μl a canale singolo, con punte usa e getta - Micropipette adattabili da 50 μl a 300 μl, multicanale con punte usa e getta - Serbatoio per micropipette multicanale - Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti - Dispositivo per dispensare la soluzione di lavaggio (bottiglia di lavaggio multicanale o sistema di lavaggio automatico) - Lettore di strisce per micropozzetti in grado di leggere a 450 nm (620 nm come lunghezza d onda riferimento opzionale) - Acqua distillala in vetro o deionizzata - Calcolatore statistico con programma che esegua l analisi di regressione (23) 5/18

7 8. PRECAUZIONI PER L USO - Tutte le sostanze chimiche sono da considerarsi potenzialmente pericolose. Raccomandiamo quindi che il prodotto venga maneggiato esclusivamente da personale debitamente istruito alle tecniche di laboratorio e che venga usato secondo i principi della buona pratica di laboratorio. Indossare indumenti di protezione idonei, come camici da laboratorio, occhiali e guanti di protezione. Evitare il contatto con la pelle o gli occhi. In caso di contatto con pelle o occhi lavare immediatamente con acqua. Consultare lascheda di sicurezza o dichiarazioni di sicurezza del prodotto per indicazioni più specifiche. - L uso dei reagenti è inteso solo per uso diagnostico in vitro e non dev essere usato per procedure terapeutiche. - Non mescolare o sostituire i reagenti con quelli di altri lotti o di diversa provenienza. - Non usare i reagenti dei kit oltre la data di scadenza indicata sull etichetta. - Durante il magazzinaggio o l incubazione non esporre i reagenti del kit a luce intensa. - Non pipettare con la bocca. - Non mangiare o fumare nelle aree di manipolazione dei reagenti dei kit o dei campioni. - Evitare il contatto della pelle o delle membrane mucose con i reagenti dei kit o i campioni. - Durante la manipolazione dei reagenti dei kit o dei campioni indossare guanti di gomma o di lattice usa e getta. - Evitare il contatto della soluzione di substrato con agenti ossidanti e metalli. - Evitare schizzi o generazione di vapori (aerosol). - Usare punte di pipette e/o pipette usa e getta per evitare la contaminazione microbica o la contaminazione crociata dei reagenti o dei campioni, che potrebbero invalidare il test. - Usare vassoi puliti e dedicati per distribuire il coniugato ed il reagente del substrato. - L esposizione agli acidi inattiva il coniugato. - Per la preparazione del reagente deve essere usata acqua distillata in vetro o deionizzata. - Prima dell uso la soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente. - Decontaminare e eliminare i campioni e tutti i materiali potenzialmente contaminati in quanto potrebbero contenere agenti infettivi. Il metodo preferenziale per la decontaminazione è l autoclavaggio per minimo un ora a C. - I rifiuti liquidi che non contengono acidi e i rifiuti neutralizzati possono essere mescolati con ipoclorito di sodio in volumi tali che la miscela finale contenga l 1.0 % di ipoclorito di sodio. Per una reale decontaminazione sono necessari 30 minuti. I rifiuti liquidi contenenti acidi devono essere neutralizzati prima dell aggiunta d ipoclorito di sodio (23) 6/18

8 9. PREPARAZIONE DEI REAGENTI Gli Concentrati dei Tamponi di Reagenti devono essere portati a temperatura ambiente e diluiti prima di iniziare la procedura del test. Se si formano cristalli nei Concentrati dei Tamponi, riscaldarli gradualmente al punto che si dissolvano completamente Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Versare tutto il contenuto (50 ml) della Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (20x) in un cilindro graduato pulito da 1000 ml. Portare al volume complessivo di 1000 ml con acqua distillata in vetro o acqua deionizzata. Mescolare con cautela per evitare lo schiumaggio. Trasferire in una bottiglia di lavaggio pulita e conservare a temperatura tra 2 C e 25 C. Tenere in considerazione che il Tampone di Lavaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Il Tampone di Lavaggio (1x) può anche essere preparato al bisogno secondo la seguente tabella: Numero di Strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Versare tutto il contenuto (5 ml) del Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) in un cilindro pulito e graduato da 100 ml. Portare al volume complessivo di 100 ml con acqua distillata. Mescolare con cautela per evitare lo schiumaggio. Conservare a una temperatura tra 2 C e 8 C. Tenere in considerazione che la Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Il Tampone di Dosaggio (1x) può anche essere preparato al bisogno secondo la seguente tabella: Numero di Strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) Coniugato di Biotina Tenere in considerazione che il Coniugato di Biotina deve essere usato entro 30 minuti dalla sua diluizione. Fare una diluizione 1:100 della soluzione concentrata di Coniugato di Biotina con il Tampone di Dosaggio (1x) in un tubo di plastica pulito secondo la seguente tabella: Numero di Strisce Coniugato di Biotina (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) (23) 7/18

9 9.4. Streptavidina-HRP Tenere in considerazione che la Streptavidina-HRP deve essere usata entro 30 minuti dalla sua diluizione. Fare una diluizione 1:2000 della soluzione concentrata di Streptavidina-HRP con il Tampone di Dosaggio (1x) in un tubo di plastica pulito secondo la seguente tabella: Numero di Stisce Streptavidina-HRP (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Standard IL-22 Umano Ricostituire lo standard IL-22 umano aggiunendo acqua distillata. Il volume di ricostituzione è indicato sull'etichetta del flaconcino dello standard. Girare o mescolare gentilmente per garantire la completa ed omogenea solubilizzazione (concentrazione dello standard ricostituito = 4000 pg/ml). Lasciare lo standard a ricostituire per minuti. Prima di fare le diluizione mescolare bene. Dopo l'uso, lo standard rimanente non può essere riutilizzato e deve essere buttato. La diluizione dello standard può essere fatto direttamente nella piastra (vedi 10.c.) oppure nei tubi (vedi 9.5.1) Diluizione Standard Esterna Etichettare 7 tubi, uno per ogni punto standard. S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7. Quindi preparare diluizioni seriali 1:2 per la curva standard come segue: Pipettare 225 μl di Diluente dei Campioni in ogni tubo. Pipettare 225 μl di standard ricostituito (concentrazione = 4 ng/ml) nel primo tubo, etichettato come S1, e mescolare (concentrazione dello Standard 1 = 2 ng/ml). Pipettare 225 μl di questa diluizione nel secondo tubo, etichettato S2 e mescolare accuratamente prima del trasferimento seguente. Ripetere le diluizioni seriali altre 5 volte creando così i punti della curva standard (vedi Figura 7). Il Diluente dei Campioni serve come bianco. Figura 7 Transferire 225 µl S1 S2 S3 S4 - S7 IL-22 Umano Standard Ricostituito Diluente dei Campioni 225 µl Scartare 225 µl (23) 8/18

10 10. Protocollo di Test a. Determinare il numero di strisce micropozzetti necessario a testare il numero desiderato di campioni, oltre al numero idoneo di pozzetti necessari per eseguire i bianchi e gli standard. Ogni campione, standard, bianco e campione di controllo opzionale dev essere dosato in duplicato. Rimuovere dal supporto le strisce micropozzetti non usate e conservarle insieme all essiccante fornito nella bustina metallica, chiusa ermeticamente a una temperatura di 2-8 C. b. Lavare le strisce micropozzetti due volte con un Tampone di Lavaggio di circa 400 μl per ogni pozzetto; aspirare completamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l altro. Prima di aspirare, lasciare il tampone di lavaggio all interno dei pozzetti per circa secondi prima dell aspirazione. Fare attenzione a non scalfire la superficie dei pozzetti. Dopo l ultima fase di lavaggio, svuotare i pozzetti e picchiettare le strisce micropozzetti su carta assorbente o su una salvietta di carta per rimuovere il Tampone di Lavaggio in eccesso. Usare le strisce micropozzetti immediatamente dopo il lavaggio. In alternativa, le strisce micropozzetti possono essere collocate capovolte su una carta assorbente bagnata per non oltre 15 minuti. Non lasciar asciugare i pozzetti. c. Diluizione standard sulla piastra per micropozzetti (In alternativa, la diluzione standard si può preparare in tubi - vedi 9.5.1): Aggiungere 100 μl Diluente dei Campioni, in duplicato, a tutti i pozzetti degli standard. Pipettare 100 μl di standard preparato (vedi Preparazione dello Standard 9.5, concentrazione = 4000 pg/ml), in duplicato, nei pozzetti A1 ed A2 (vedi Tavola 1). Mescolare il contenuto dei pozzetti A1 e A2 aspirando ed espellendo ripetutamente (concentrazione dello standard 1, S1 = 1000 pg/ml) e trasferire 100 μl rispettivamente nei pozzetti B1 e B2 (vedi Figura 8). Fare attenzione a non scalfire la superficie interna dei pozzetti. Ripetere la procedura 5 volte creando due serie di diluizioni standard di IL-22 umano con un range da a 31.3 pg/ml. Scartare 100 μl del contenuto degli ultimi micropozzetti (G1, G2) usati. Figura 8 Transferire 100 µl S1 S2 S3 S4 - S7 IL-22 Umano Standard Ricostituito Diluente dei Campioni 100 µl Scartare 100 µl (23) 9/18

11 Nel caso di una diluizione esterna dello standard (vedi 9.5.1), pipettare 100 μl di queste diluizioni dello standard (S1 to S7) nei pozzetti dello standard, come da Tavola 1. Tavola 1 La tavola descrive un esempio dell organizzazione dei bianchi, degli standard e dei campioni nelle strisce dei micropozzetti A B C D E F G Standard 1 ( pg/ml) Standard 2 ( pg/ml) Standard 3 (500.0 pg/ml) Standard 4 (250.0 pg/ml) Standard 5 (125.0 pg/ml) Standard 6 (62.5 pg/ml) Standard 7 (31.3 pg/ml) Standard 1 ( pg/ml) Standard 2 ( pg/ml) Standard 3 (500.0 pg/ml) Standard 4 (250.0 pg/ml) Standard 5 (125.0 pg/ml) Standard 6 (62.5 pg/ml) Standard 7 (31.3 pg/ml) Campione 1 Campione 1 Campione 2 Campione 2 Campione 3 Campione 3 Campione 4 Campione 4 Campione 5 Campione 5 Campione 6 Campione 6 Campione 7 Campione 7 H Bianco Bianco Campione 8 Campione 8 d. Aggiungere 100 μl di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti del bianco. e. Aggiungere 50 μl di Diluente dei Campioni ai pozzetti del campione. f. Aggiungere 50 μl di ogni campione in duplicato ai pozzetti del campione. g. Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 2 ore; se è disponibile un vortex per micropiastre, impostare su 400 rpm. (Agitazione è assolutamente necessario per una performance ottimale del test.) h. Preparare il Conjugato di Biotina (vedi 9.3 Preparazione del Coniugato di Biotina). i. Rimuovere il film adesivo e vuotare i pozzetti. Lavare le strip dei micropozzetti 3 volte come da punto b. del protocollo del test. Procedere immediatamente alla fase seguente. j. Aggiungere 100 μl Conjugato di Biotina a tutti i pozzetti. k. Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 1 ora; se è disponibile un vortex per micropiastre, impostare su 400 rpm. (Agitazione è assolutamente necessario per una performance ottimale del test.) l. Preparare la Streptavidina-HRP (fare riferimento alla preparazione della Streptavidina-HRP 9.4). m. Rimuovere il film adesivo e vuotare i pozzetti. Lavare le strip dei micropozzetti 3 volte come da punto b. del protocollo del test. Procedere immediatamente alla fase seguente. n. Aggiungere 100 μl di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti, compresi i pozzetti del bianco. o. Coprire con film adesivo e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 1 ora; se è disponibile un vortex per micropiastre, impostare su 400 rpm. (Agitazione è assolutamente necessario per una performance ottimale del test.) p. Rimuovere il film adesivo e vuotare i pozzetti. Lavare le strisce dei micropozzetti 6 volte come da punto b. del protocollo del test. Procedere immediatamente alla fase seguente. q. Pipettare 100 μl di Soluzione di Substrato TMB in tutti i pozzetti (23) 10/18

12 r. Incubare le strisce dei micropozzetti a temperatura ambiente (18-25 C) per circa 10 minuti. Evitare l esposizione diretta a luce intensa. Lo sviluppo cromatico sulla piastra dev essere monitorato e la reazione del substrato dev essere bloccata (vedi prossimo punto di questo protocollo) prima che i valori dei pozzetti positivi non siano più correttamente registrabili. Il periodo ideale di tempo necessario per lo sviluppo del colore dev essere determinato individualmente per ogni dosaggio. Si raccomanda di aggiungere la soluzione bloccante quando lo standard più alto ha raggiunto un colore blu scuro. In alternativa, lo sviluppo del colore può essere monitorato con il lettore ELISA a 620 nm. La reazione del substrato dev essere bloccata non appena lo Standard 1 ha raggiunto un DO di s. Bloccare la reazione dell enzima pipettando velocemente 100 μl di Soluzione Bloccante in ogni pozzetto. E importante che la Soluzione Bloccante venga distribuita velocemente ed uniformemente su tutti i pozzetti per inattivare completamente l enzima. I risultati devono essere letti immediatamente dopo l aggiunta della Soluzione Bloccante, o entro 1 ora se le strisce dei micropozzetti sono conservate al buio e ad una temperatura di 2-8 C. t. Leggere l assorbanza di ogni micropozzetto con uno spettrofotometro usando 450 nm. come lunghezza d onda primaria (in alternativa, 620 nm. come lunghezza d onda di riferimento; da 610 nm a 650 nm. il valore è accettabile). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del produttore e usando i pozzetti del bianco. Determinare l assorbanza sia dei campioni, sia degli standard. 11. CALCOLO DEI RISULTATI - Calcolare i valori medi dell assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati devono rientrare nel 20 % del valore medio. - Creare una curva standard segnando l assorbanza media di ogni concentrazione standard sull ordinata contro la concentrazione di IL-22 umano sull ascissa. Disegnare una curva di best-fit congiungendo i punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri). - Per determinare la concentrazione di IL-22 umano circolante per ogni campione, trovare prima il valore medio di assorbanza sull ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva standard. Nel punto d intersezione estendere una linea verticale fino all ascissa e leggere il valore corrispondente della concentrazione di IL-22 umano. - Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni sono stati diluiti in proporzione di 1:2 (50 μl di campione + 50 μl Diluente dei Campioni), la concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (x 2). - Il calcolo dei campioni con una concentrazione superiore allo Standard 1 può dare per risultato livelli scorretti e bassi di IL-22 umano. Questi campioni richiedono un ulteriore pre-diluizione esterna secondo i valori stimati del IL-22 umano, con un Diluente dei Campioni in modo da quantificare con precisione i livelli reali di IL-22 umano. - Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione di IL-22 umano conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i valori ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non essere validi. - La Figura 9 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per dedurne risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di strisce per micropozzetti su cui si fa il dosaggio. Figura 9 Curva standard rappresentativa per il IL-22 umano ELISA. Il IL-22 umano è stato diluito in 2 fasi seriali nel Diluente dei Campioni. Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva standard dev essere eseguita per ogni gruppo di strisce per micropozzetti su cui si fa il dosaggio (23) 11/18

13 10 Absorption 450 nm Concentration (pg/ml) Tavola 2 Dati tipici relativi all uso del VEGF-A umano ELISA Lunghezza d onda: 450 nm Lunghezza d onda di riferimento: 620 nm Standard Concentrazione di D.O. D.O. C.V. IL-22 Umano (pg/ml) (450 nm) Media (%) Bianco (23) 12/18

14 I valori DO della curva standard possono variare a seconda delle condizioni di prestazione del dosaggio (ad es.: operatore, tecnica di pipettaggio o effetti della temperatura). Inoltre, il periodo di validità del kit può influenzare l attività enzimatica e quindi l intensità del colore. I valori misurati sono ancora validi. 12. LIMITI DELLA PROCEDURA - Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva standard per ogni esecuzione del test. - La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione crociata tra reagenti può casusare risultati erronei. - Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro riutilizzabili devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell uso. - Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o falsi negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la Soluzione di Lavaggio fresca, riempire con il Tampone di Lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti scoperti, o non permettere che si asciughino per periodi prolungati. - L uso della radioimmunoterapia ha aumentato significativamente il numero di pazienti con anticorpi umani IgG anti-topo (HAMA). HAMA può interferire con dosaggi che utilizzano anticorpi monoclonali murini, portando sia a risultati falsi positivi, sia falsi negativi. I campioni di siero contenenti anticorpi delle immunoglobuline murine possono essere ancora analizzati in questi dosaggi quando le immunoglobuline murine (siero, liquido ascitico o anticorpi monoclonali di specificità irrilevante) vengono aggiunti al campione (23) 13/18

15 13. CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE Sensibilità Il limite di rilevamento del IL-22 umano definito come la concentrazione dell analita, risultante in un assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più 2 deviazioni standard), è stato determinato di 5.0 pg/ml (media di 6 dosaggi indipendenti) Riproducibilità Intra-dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di IL-22 umano. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di IL-22 umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 3). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 6.7 %. Tavola 3 La concentrazione media di IL-22 umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione Campione Esperimento Concentrazione Media IL-22 Umano (pg/ml) Coefficiente di Variazione (%) (23) 14/18

16 Inter-dosaggio La riproducibilità da dosaggio a dosaggio nell ambito di un laboratorio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di IL-22 umano. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di IL-22 umano ed il coefficiente di variazione calcolato su 18 determinazioni di ogni campione (vedi Tavola 4). Il coefficiente di variazione inter-dosaggio complessivo calcolato era del 4.5 %. Tavola 4 La concentrazione media di IL-22 umano ed il coefficiente di variazione di ogni campione: Test di Recupero Campione Concentrazione Media di Coefficiente di IL-22 Umano (pg/ml) Variazione (%) Il test di recupero è stato valutato addizionando 3 livelli di IL-22 umano al siero, plasma e supernatanti di colture cellulari. I recuperi sono stati determinati nel corso ognuno con 4 replicati. La quantità di IL-22 umano endogeno in campioni non addizionati è stata sottratta dai valori del test. Vedi Tavola 5 per i dati di recupero. Tavola 5 Matrice del Campione* Ripresa media (%) Siero 92 Plasma (EDTA) 60 Plasma (Citrato) 72 Plasma (Heparina) 124 Supernatanti di colture cellulari Parallelismo della Diluizione 4 campioni di siero con diversi livelli di IL-22 umano sono stati analizzati in diluizioni seriali multiple di 2 e con 4 replicati l uno. Vedi Tavola 6 per i dati di recupero. Tavola 6 Matrice di Campione* Recupero di Valore atteso Siero 107 Plasma (EDTA) 105 Plasma (Citrato) 93 Plasma (Heparina) 76 Supernatanti di colture cellulari (23) 15/18

17 La tavola 7 mostra dati dettagliati di recupero di 2 siero (1, 2) e 2 citrato Campioni di plasma (3, 4). Tavola 7 Campione Diluizione 1:2 1:4 1:8 1:16 1:2 1:4 1:8 1:16 1:2 1:4 1:8 1:16 1:2 1:4 1:8 1:16 Concentrazione Attesa di IL-22 umana (pg/ml) Concentrazione Misurata di IL-22 umana (pg/ml) Recupero di Concentrazione Attesa di IL-22 umana (%) Stabilità del Campione Stabilità a Congelamento-Scongelamento Aliquote di campioni di siero (addizionati o non addizionati) sono state conservate a -20 C e scongelate 3 volte e sono stati determinati i livelli di IL-22 umano. È stata individuata una diminuzione significativa di immunoreattività IL-22 umana. Per questo motivo i campioni devono essere conservati in parti a -20 C e scongelati solo una volta Stabilità della Conservazione Aliquote di campioni di siero (addizionati o non addizionati) sono state conservate a -20 C, 2-8 C, a temperatura ambiente (TA) ed a 37 C e il livello di IL-22 umano ne è stato determinato dopo 24 ore. Durante la conservazione a -20 C ed a 2-8 C non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività dello IL-22 umano. Una significativa perdita di immunoreattività IL-22 umana è stata individuata durante l immagazzinamento a temperatura ambiente e a 37 C dopo 24 ore Specificità L interferenza dei fattori circolanti del sistema immune è stata valutata aggiungendo queste proteine in concentrazioni fisiologicamentre rilevanti ad un siero IL-22 umana positivo. Non si è constatata alcuna reattività crociata Valori Attesi Per la IL-22 umana è stato testato un pannello di 40 campioni di siero di donatori apparentemente sani (maschi e femmine) selezionati casualmente (random). I livelli misurati possono variare con la raccolta di campioni usata. Per i livelli di sil-2r umana misurati vedi la Tavola (23) 16/18

18 Tavola 7 Matrice di Campione Numero di Campioni Valutati Intervallo (pg/ml) Media (pg/ml) Siero 40 nd* Plasma (EDTA) 40 nd* Plasma (Citrato) 40 nd* Plasma (Eparina) 40 nd* *nd = non-detectable (non rilevabile), i campioni misurati sotto il punto standard più basso sono stati considerati non rilevabili. 14. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI Per gli ordini contattare: Vedi ultima pagina. Per informazioni tecniche contattare: IBL@IBL-International.com / SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Lavaggio 20x (50 ml) a 950 ml di acqua distillata. Numero di Strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Acqua Distillata (ml) Aggiungere Concentrato di Tampone di Dosaggio 20x (5 ml) a 95 ml di acqua distillata. Numero di Strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrato (ml) Coniugato di Biotina Acqua Distillata (ml) Fare una diluizione 1:100 di Coniugato di Biotina nel Tampone di Dosaggio (1x): Numero di Strisce Coniugato di Biotina (ml) Streptavidina-HRP Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Fare una diluizione 1:100 di Streptavidina-HRP nella Soluzione Tampone di Dosaggio (1x): Numero di Strisce Streptavidina-HRP (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) (23) 17/18

19 Standard IL-22 Umano Reconstituire il standard IL-22 umano liofilizzato con acqua distillata. (Il volume di ricostituzione è dichiarato sull etichetta del flaconcino dello standard.) 16. SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST 1. Determinare il numero di strisce di micropozzetti richiesto. 2. Lavare le strisce di micropozzetti due volte con il Tampone di Lavaggio. 3. Diluizione standard sulla piastra di micropozzetti: Aggiungere 100 μl di Diluente dei Campioni, in duplicato, a tutti i pozzetti standard. Pipettare 100 μl di standard preparato nei primi pozzetti e creare diluizioni di standard trasferendo 100 μl da pozzetto a pozzetto. Scartare 100 μl dagli ultimi pozzetti. Alternativamente diluizione esterna dello standard in tubi (vedi ): Pipettare 100 μl di queste diluizioni dello standard nei micropozzetti. 4. Aggiungere 100 μl di Diluente dei Campioni, in duplicato, ai pozzetti del bianco. 5. Aggiungere 50 μl Diluente dei Campioni ai pozzetti dei campioni. 6. Aggiungere 50 μl di campioni in duplicato ai pozzetti per i campioni designati. 7. Coprire le strisce dei micropozzetti ed incubare per due ore (18-25 C). (Agitazione è assolutamente necessario per una performance ottimale del test.) 8. Preparare il Coniugato di Biotina. 9. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 3 volte con il Tampone di Lavaggio. 10. Aggiungere 100 μl di Coniugato di Biotina a tutti i pozzetti. 11. Coprire le strisce dei micropozzetti ed incubare per 1 ora (18-25 C). (Agitazione è assolutamente necessario per una performance ottimale del test.) 12. Preparare la Streptavidina-HRP. 13. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 3 volte con il Tampone di Lavaggio. 14. Aggiungere 100 μl di Streptavidina-HRP diluta a tutti i pozzetti. 15. Coprire le strisce dei micropozzetti ed incubare per 1 ora (18-25 C). (Agitazione è assolutamente necessario per una performance ottimale del test.) 16. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 3 volte con il Tampone di Lavaggio. 17. Aggiungere 100 μl di Soluzione di Substrato TMB a tutti i pozzetti. 18. Incubare le strisce di micropozzetti per circa 10 minuti a temperatura ambiente (18-25 C). 19. Aggiungere 100 μl di Soluzione Bloccante a tutti i pozzetti. 20. Azzerare il lettore di micropozzetti e misurare l intensità del colore a 450 nm. Annotazione: Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni sono stati diluiti in proporzione 1:2 (50 μl di campione + 50 μl Diluente dei Campioni), la concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (x2) (23) 18/18

20 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. CONTENUTI: I reclami possono essere presentati inizialmente scritti o vocali. Successivamente devono essere completati in modo scritto includendo le prestazioni del test ed i risultati se si riferiscono a reclami per ragioni analitiche. GARANZIA: Il prodotto è garantito per essere esente da difetti dei materiali entro la specifica data di conservazione ed in modo conforme alle specifiche fornite con il prodotto. Il prodotto deve essere utilizzato secondo l'uso previsto, tutte le istruzioni riportate nelle istruzioni per l'uso e entro la data di scadenza del prodotto. Qualsiasi modifica della procedura di prova o lo scambio o la miscelazione di componenti di diversi lotti potrebbero avere effetti negativi sui risultati. Questi casi invalidano qualsiasi richiesta di sostituzione. LIMITAZIONE DI RESPONSABILITÀ: IN TUTTE LE CIRCOSTANZE, LA RESPONSABILITÀ DEL FABBRICANTE È LIMITATA AL PREZZO D'ACQUISTO DEL/DEI KIT IN QUESTIONE. IN NESSUN CASO IL PRODUTTORE SARÀ RESPONSABILE PER QUALSIASI DANNO INCIDENTALE O CONSEQUENZIALE, COMPRESI I DANNI PER PERDITA DI PROFITTO, SALUTE, DANNI PER PERSONE O PROPRIETÀ O ALCUNA ALTRA PERDITA INCIDENTALE O CONSEQUENZIALE. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Symbols Version 4.5 (it) /