Interleukin-1alpha ELISA

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1 Istruzioni per l Uso Interleukin-1alpha ELISA Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa e qualitativa di Interleuchina-1 alpha (IL-1 α) nei supernatanti di colture cellulari, plasma, urina e siero umani. BE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 INFORMAZIONI SUL PRODOTTO E MANUALE 1. USO PREVISTO 2 2. SOMMARIO 2 3. PRINCIPIO DEL TEST 3 4. REAGENTI FORNITI 4 5. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE 5 6. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI 5 7. MATERIALI NECESSARI MA NO FORNITI 5 8. PRECAUZIONI PER L USO 6 9. PREPARAZIONE DEI REAGENTI PROCEDURA DEL TEST CALCOLO DEI RISULTATI LIMITI DELLA PROCEDURA CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE INFORMAZIONI PER GLI ORDINI SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO (24) 1/18

3 1. Uso Previsto L Interleukin-1alpha ELISA è un dosaggio immunoassorbente legato agli enzimi per il rilevamento quantitativo della IL-1 alpha umana. L Interleukin-1alpha ELISA è per uso diagnostico in vitro. Non si usa per procedure terapeutiche. 2. Sommario Le interleuchine-1 (IL-1) rappresentano un importante famiglia di proteine derivate da cellule mononucleate biologicamente attive, coinvolte nelle reazioni infiammatorie e nelle risposte immunitarie. Sono state identificate due specie distinte di IL-1 umane, IL-1 alpha e IL-1 bata. Esse presentano lo stesso peso molecolare, effetti biologici simili e gli stessi recettori sulle cellule bersaglio. Le proteine IL-1 sono prodotte da macrofagi, monociti e vari altri tipi di cellule tra cui leucemie a cellule T degli adulti, fibroblasti, cellule epiteliali o endoteliali, neutrofili ed astrociti. Le loro proprietà biologiche includono pirogenicità, riassorbimento osseo, presentazione dell antigene ai linfociti T e stimolazione delle proliferazione di linfociti B e T. IL-1a è un peptide extracellulare di 17 kda; la sua attività è stata dimostrata in vari liquidi biologici tra cui siero, liquido sinoviale, liquido gengivale, liquido amniotico, espettorato, liquido cerebrospinale, urina e liquido di lavaggio broncoalveolare (BAL). Livelli sierici o ematici elevati di IL-1 alpha sono stati riscontrati in pazienti sottoposti a sostituzione totale dell anca/artroplastica, in pazienti con IDDM diagnosticato di recente, in caso di vari carcinomi come il carcinoma della testa e del collo, il carcinoma pancreatico e quello tiroideo, in caso di pielonefrite sperimentale acuta, di epatite virale acuta e di shock settico. In caso di artrite reumatoide sono rilevati aumenti sia dei livelli sierici che di quelli nei liquidi articolari (liquidi sinoviali). L aumento di IL-1 alpha è un marcatore di malattie dentali come infiammazione della polpa e infezioni dei canali radicolari. I disturbi polmonari sono accompagnati da aumenti di IL-1 alph nel plasma e nel BAL, ad esempio fibrosi cistica e sclerosi sistemica. In pazienti affetti da schizofrenia sono riscontrati livelli elevati nel plasma e nel LCS. I livelli ematici dei neonati con infezioni sistemiche nel periodo neonatale sono significativamente più elevati che nei controlli. Concentrazioni elevate di IL-1 alpha nel muco cervicale di donne incinte sono correlate al meccanismo di difesa contro le infezioni ascendenti. Concentrazioni significativamente elevate nel liquido crevicolare gengivale sono rilevate in soggetti affetti da periodontite. Nel tumore alla vescica, i livelli urinari di IL-1 alpha corrispondono alla risposta alla malattia e alla terapia (24) 2/18

4 3. Principio del Test I micropozzetti vengono rivestiti con un anticorpo di rivestimento anti-il-1 alpha umana. Figura 1 Micropozzetto Rivestito L IL-1 alpha umana presente nel campione o nello standard si lega agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti. Vi si aggiunge un anticorpo anti-il-1 alpha umana coniugato di biotina, che si lega con l IL-1 alpha umana catturata dal primo anticorpo. Anticorpo di Rivestimento Figura 2 Prima Incubazione Standard o Campione Coniugato di Biotina Dopo l incubazione degli anticorpi di anti-il-1 alpha umana coniugati alla biotina non legati vengono rimossi durante una fase di lavaggio. Si aggiunge la streptavidina-hrp che si lega all anticorpo anti-il-1 alpha umana coniugato alla biotina. Figura 3 Seconda Incubazione Dopo l incubazione la Streptavidina-HRP non legata viene rimossa con una fase di lavaggio e ai pozzetti viene aggiunta una soluzione di substrato reattiva all HRP. Figura 4 Streptavidina-HRP - Terza Incubazione Substrato In proporzione alla quantità di IL-1 alpha umana presente nel campione o nello standard si forma un prodotto colorato. La reazione viene terminata aggiungendo l acido e l assorbanza si misura a 450 nm. Si prepara una curva standard sulla base di 7 diluizioni standard di IL-1 alpha umana e si determina la concentrazione del campione di IL-1 alpha umana. Figura 5 Substrato post-reazione (24) 3/18

5 4. Reagenti Forniti 1 busta d alluminio con Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpi policlonali anti-il-1 alpha umana 1 flaconcino (70 µl) con Coniugato di Biotina (anticorpi policlonali anti-il-1 alpha umana) 1 flaconcino (150 µl) con Streptavidina-HRP 2 flaconcini con Standard IL-1 alpha umana liofilizzato, 200 pg/ml dopo ricostituzione 1 flaconcino (12 ml) Diluente dei Campioni Nota Bene: In alcuni, rarissimi, casi, è stato osservato un precipitato insolubile di proteine stabilizzanti nel flacone del Diluente dei Campione. Questo precipitato non interferisce in alcun modo nelle prestazioni del test e può quindi essere ignorato. 1 flaconcino (5 ml) di Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata 20x (PBS con 1 %Tween 20 e 10% BSA) 1 flaconcino (50 ml) di Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata 20x (PBS con 1 %Tween 20) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione di Substrato (tetrametil-benzidina) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione Bloccante (Acido fosforico 1 M) 4 Copripiastra adesivi (24) 4/18

6 5. Istruzioni di Conservazione Conservare i reagenti del kit a 2-8 C. Subito dopo l'uso riporre i reagenti nel luogo di conservazione a 2-8 C. La scadenza del kit e dei reagenti è indicata sulle etichette. La data di scadenza dei componenti del kit può essere garantita solo se questi sono conservati correttamente e, in caso di uso ripetuto di un componente, il reagente non è stato contaminato durante la prima manipolazione. 6. Prelievo e conservazione dei Campioni Con questo dosaggio sono stati testati i supernatanti delle colture cellulari, il siero, il plasma (EDTA, citrato, eparina) e la urina. Altri campioni biologici potrebbero essere idonei all uso per questo dosaggio. Dopo la coagulazione e la separazione, rimuovere il siero o plasma dal coagulo o gli cellulas il più presto possibile. Prestare attenzione a un possibile "Effeto Gancio" a causa di alti concentrazioni di campioni (vedi capitolo 11). I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio. Non usare campioni emolizzati in maniera grossolana, o lipemici. I campioni devono essere aliquotati e conservati sotto zero a -20 C, per evitare la perdita di IL-1 alpha umana bioattiva. Se i campioni devono essere usati entro 24 ore, possono essere conservati a una temperatura tra 2 C ed 8 C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto 13.5). Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelato dev essere portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela. 7. Materiali necessari ma no forniti Pipette graduate da 5 ml e 1000 ml Micropipette adattabili da 5 µl a 1000 µl a canale singolo, con punte usa e getta Micropipette adattabili da 50 µl to 300 µl multicanale con punte usa e getta Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico. Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (lunghezza d onda di riferimento 620 nm) Acqua bidistillata o deionizzata Calcolatore statistico con programma che esegua l analisi di regressione (24) 5/18

7 8. Precauzioni per l Uso - Tutti i prodotti chimici vanno considerati come potenzialmente pericolosi. Raccomandiamo, perciò, l'utilizzo di questo prodotto solo da personale addestrato alle tecniche di laboratorio e che siano avvezze alle comuni pratiche di laboratorio. Indossare abbigliamento idoneo come camici, guanti ed occhiali. Attenzione ad evitare contatto con la pelle e gli occhi. Nel caso di contatto con pelle o occhi, immediatamente lavare con acqua. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per specifici consigli. - I reagenti sono per uso in vitro diagnostico e non sono per uso terapeutico. - Non mischiare tra loro reagenti di diversi lotti o provenienza. - Non usare i kit dopo la data di scadenza. - Non esporre i reagenti del kit, durante la conservazione e incubazione a forti fonti di luce. - Non pipettare utilizzando la bocca. - Non mangiare o fumare nell'area dove sono utilizzati i reagenti dei kit o i campioni. - Evitare il contatto dei reagenti o campioni con la pelle o le mucose. - Guanti di gomma o lattice dovrebbero essere sempre indossati quando si usano reagenti e campioni. - Evitare il contatto tra il substrato del kit e agenti ossidanti e metallo. - Evitare schizzi o produzione di aereosol. - Per evitare contaminazione microbica o cross-contaminazione dei reagenti o dei campioni che invaliderebbero il test, usare sempre pipette e puntali mono-uso. - Usare vaschette pulite e dedicate per la dispensare il reagente substrato. - L'esposizione agli acidi inattiva il coniugato. - Acqua distillata o de-ionizzata deve essere utilizzata per la preparazione dei reagenti. - La soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente prima dell'utilizzo. - Decontaminare ed eliminare i campioni e tutto il materiale potenzialmente contaminante perchè potrebbero contenere agenti infettanti. Il metodo preferito per la decontaminazione è l'autoclavaggio per minimo 1 ora a C. - Gli scarti liquidi, non contenenti acido e gli scarti neutralizzati possono essere mischiati con sodio ipoclorido in un volume finale di 1.0 %. Lasciare minimo 30 minuti per l'effettiva decontaminazione. Scarti liquidi contenenti acido devono essere neutralizzati prima dell'aggiunta di sodio ipoclorido (24) 6/18

8 9. Preparazione dei Reagenti Prima di cominciare con le procedure del test i Concentrati dei Tamponi devono essere portati a temperatura ambientale e diluiti alle concentrazioni adeguate. Se i Concentrati dei Tamponi presenta cristalli in sospensione, riscaldare lievemente i tamponi fino a ottenere la completa dissoluzione dei cristalli Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Versare l'intero contenuto (50 ml) del Tampone di Lavaggio Concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 1000 ml. Portare il volume finale a 1000 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Trasferire il prodotto in una bottiglia pulita e conservare a temperature comprese fra 2 C e 25 C. Il Tampone di Lavaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Lavaggio (1x) secondo la tabella seguente; Numero di Strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrato (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Versare l'intero contenuto (5 ml) del Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 100 ml. Portare il volume finale a 100 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Conservare a temperature comprese fra 2 C e 25 C. Il Tampone di Dosaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Dosaggio (1x) secondo la tabella seguente; Numero di Strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) Preparazione di Coniugato di Biotina Il Coniugato di Biotina deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione. La Soluzione Coniugato di Biotina concentrata deve essere diluito 1:100 con Tampone di Dosaggio (1x) in una provetta di plastica pulita secondo la tabella seguente: Numero di Strisce Coniugato di Biotiona (ml) Tampone di Dosaggio (1x) (ml) (24) 7/18

9 9.4. Streptavidina-HRP La Streptavidina-HRP deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione. La Streptavidina-HRP concentrata deve essere diluita 1:200 con Tampone di Dosaggio (1x) in una provetta di plastica pulita secondo la tabella seguente: Numero di Strisce Streptavidina-HRP (ml) Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Standard Interleukin-1alpha ELISA Ricostituire lo Standard Interleukin-1alpha ELISA aggiunendo acqua distillata. Il volume di ricostituzione è indicato sull'etichetta della flaconcino dello standard. Girare o mescolare gentilmente per garantire la completa ed omogenea solubilizzazione (concentrazione dello standard ricostituito = 200 pg/ml). Lasciare lo standard a ricostituire per minuti. Prima di fare le diluizione mescolare bene. Dopo l'uso, lo standard rimanente non può essere riutilizzato e deve essere buttato. La diluizione dello standard può essere fatto direttamente nella piastra (vedi 10.c.) oppure nei tubi (vedi 9.5.1) Diluzione Standard Esterna Etichettare 7 tubi, uno per ogni punto dello standard. S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7. Preparare diluizioni seriali 1:2 per lo standard nel seguente modo: Pipettare 225 ul di Diluente dei Campioni a tutti tubi. Pipettare 225 µl di standard ricostituito (concentrazione dello standard = 200 pg/ml) nel primo tubo, etichettato S1, e mescolare (concentrazione dello standard 1 = 100 pg/ml). Pipettare 225 µl di questa diluizione nel secondo tubo, etichettato S2 e mischiare accuratamente prima del successivo transferimento. Ripetere le 5 diluizioni seriali in modo da creare i punti della curva di calibrazione (vedere figura 6). Il Diluente dei Campioni serve come bianco. Figura 6 Transferire 225 µl S1 S2 S3 S4 - S7 IL-1 alpha umana Standard Ricostituito Diluente dei Campioni 225 µl Buttare 225 µl (24) 8/18

10 10. Procedura del Test a. Stabilire il numero di strip dei micropozzetti necessarie per analizzare la quantità desiderata di campioni più le strip per i bianchi e gli standard. Tutti i campioni, gli standardi, il bianco e il devono essere processati in duplicato. Rimuovere dal supporto le strip micropozzetti non utilizzate e conservarle nella bustina metallica contenente la polvere essiccante, mantenendole a 2-8 C e perfettamente sigillate. b. Lavare due volte le strip micropozzetti utilizzando circa 400 µl di Tampone di Lavaggio per pozzetto, aspirando accuratamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l'altro. Permettere al tampone di lavaggio di rimanere, nei pozzetti, circa secondi prima dell'aspirazione. Evitare di scalfire la superficie dei micropozzetti. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare le strip micropozzetti con un tampone o carta assorbente per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso. Utilizzare le strip subito dopo il lavaggio o sistemarle capovolte su carta assorbente umida per non più di 15 min. Non lasciar asciugare i pozzetti. c. Diluizione dello standard in micropozetti (alternativamente la diluizione dello standard può avvenire in tubi vedi 9.5.1) Aggiungere 100 µl di Diluente dei Campioni in duplicato a tutti i pozzetti dello standard. Pipettare 100 µl standard preparato (vedi 9.5 Preparazione dello Standard, concentrazione = 200 pg/ml) in duplicato nei pozzetti A1 e A2 (vedi Tavola 1). Mescolare il contenuto dei pozzetti A1 e A2 attraverso ripetute aspirazione ed iniezioni (concentrazione dello standard 1, S1 = pg/ml) e trasferire 100 µl, rispettivamente, ai pozzetti B1 e B2 (vedere Figura 7). Fare attenzione a non graffiare la parte interna dei pozzetti. Continuare questa procedura per 5 volte, creando due colonne di standard in diluizione con concentrazione da a 1.6 pg/ml. Buttare 100 µl del contenuto degli ultimi pozzetti (G1 e G2) (24) 9/18

11 Figura 7 Transferire 100 µl S1 S2 S3 S4 - S7 IL-1 alpha Umana Standard Ricostituito Diluente dei Campioni 100 µl Buttare 100 µl In caso di diluizione esterna dello standard (vedi 9.5.1) pipettare 100 µl di queste diluizioni standard (S1 S7) nei pozzetti degli standard come da Tavola 1. Tavola 1 Tavola rappresenta un esempio dell'organizzazione dei bianchi, standardi e campioni nei pozzetti: A B C D E F G Standard 1 (100.0 pg/ml) Standard 2 (50.0 pg/ml) Standard 3 (25.0 pg/ml) Standard 4 (12.5 pg/ml) Standard 5 (6.3 pg/ml) Standard 6 (3.1 pg/ml) Standard 7 (1.6 pg/ml) Standard 1 (100.0 pg/ml) Standard 2 (50.0 pg/ml) Standard 3 (25.0 pg/ml) Standard 4 (12.5 pg/ml) Standard 5 (6.3 pg/ml) Standard 6 (3.1 pg/ml) Standard 7 (1.6 pg/ml) Campione 1 Campione 1 Campione 2 Campione 2 Campione 3 Campione 3 Campione 4 Campione 4 Campione 5 Campione 5 Campione 6 Campione 6 Campione 7 Campione 7 H Bianco Bianco Campione 8 Campione (24) 10/18

12 d. Dispensare 100 µl di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti de bianco. e. Dispensare 50 µl di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti dei campioni. f. Dispensare 50 µl di ogni campione in duplicato ai pozzetti dei campioni. g. Preparare il Coniugato di Biotina (vedere la preparazione del Coniugato di Biotina 9.3) h. Dispensare 50 µl di Coniugato di Biotina a ciascun pozzetto. i. Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 2 ore utilizzando, se disponibile, su un agitatore mecanico a 400 rpm. j. Preparare la Streptavidina-HRP diluita (vedere la Preparazione di Streptavidina-HRP 9.4). k. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 4 volte come descritto in punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo. l. Dispensare 100 µl di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti, inclusi quelli di bianco. m. Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 1 ora utilizzando, se disponibile, su un agitatore mecanico a 400 rpm. n Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 4 volte come descritto in punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo. o. Pipettare 100 µl di Soluzione di Substrato TMB in tutti i pozzetti. p. Incubare le strisce a temperatura ambiente (18-25 C) per circa 10 minuti. Evitare l'esposizione diretta a luci intense. È necessario monitorare i valori D.O. a livello della piastra e interrompere la reazione del substrato (vedi il punto prossimo del protocollo) prima che i pozzetti positivi cessino di essere appropriatamente registrabili. La determinazione del tempo necessario per lo sviluppo del colore dev'essere fatto per ogni singolo parametro. Si raccomanda di aggiungere la soluzione di stop quando lo standard più elevato ha sviluppato un colore blu scuro. Alternativamente lo sviluppo del colore può essere monitorato con un lettore ELISA a 620 nm. La reazione del substrato deve essere bloccata non appena viene misurato un valore della DO di q. Interrompere la reazione enzimatica pipettando rapidamente 100 µl di Soluzione Stopp in ciascun pozzetto, inclusi i pozzetti del bianco. È importante che la soluzione bloccante si diffonda rapidamente e uniformemente attraverso i micropozzetti per inattivare completamente l'enzima. I risultati devono essere letti immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione bloccante o entro 1 ora se le strip sono conservate in un luogo buio a 2-8 C. r. Leggere l'assorbanza di ciascun micropozzetto su uno spettrofotometro che utilizza 450 nm come lunghezza d'onda primaria (620 nm come lunghezza d'onda di riferimento alternativa; valori da 610 nm a 650 nm sono accettabili). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del produttore e utilizzando i pozzetti del bianco. Determinare l'assorbanza sia dei campioni, sia degli standard. Note: In caso d incubazione senza agitazione i valori di densità ottica (D.O.) potranno essere più bassi di quanto indicato sotto. Tuttavia i risultati saranno da ritenersi validi (24) 11/18

13 11. CALCOLO DEI RISULTATI - Calcolare i valori medi dell assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati devono rientrare nel 20 % del valore medio. - Creare una curva standard segnando l assorbanza media di ogni concentrazione standard sull ordinata contro la concentrazione di IL-1 alpha umana sull ascissa. Disegnare una curva di bestfit congiungendo i punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri). - Per determinare la concentrazione di IL-1 alph umana circolante per ogni campione, trovare prima il valore medio di assorbanza sull ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva standard. Nel punto d intersezione estendere una linea verticale fino all ascissa e leggere il valore corrispondente della concentrazione di IL-1 alph umana. - Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni di colture celulai sono stati diluiti 1:2 (50 µl campione + 50 µl Diluente dei Campioni). La concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (2x). - Il calcolo dei campioni con una concentrazione superiore allo Standard 1 può dare per risultato livelli scorretti e bassi di IL-1 alpha umana (Effetto Gancio). Questi campioni richiedono un ulteriore pre-diluizione esterna secondo i valori stimati dell IL-1 alpha umana, con un Diluente dei Campioni in modo da quantificare con precisione i livelli reali di IL-1 alpha umana. - Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione di IL-1 alph umana conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i valori ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non essere validi. - La Figura 8 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per dedurne risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di strisce per micropozzetti su cui si fa il dosaggio. Figura 8 Curva standard rappresentativa per l IL-1 alpha umana ELISA. L IL-1 alpha umana è stato diluito in 2 fasi seriali nel Diluente dei Campioni. Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva standard dev essere eseguita per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio Interleukin-1alpha ELISA DO (450 nm) (pg/ml) (24) 12/18

14 Tavola 2 Dati tipici relativi all uso dell Interleukin-1alpha ELISA Lunghezza d onda: 450 nm Lunghezza d onda di riferimento: 620 nm Standard Concentrazione IL-1 alpha Umana (pg/ml) D.O. (450 nm) Bianco D.O. Media (450 nm) C.V. (%) I valori DO della curva standard possono variare a seconda delle condizioni di prestazione del dosaggio (ad es.: operatore, tecnica di pipettaggio o effetti della temperatura). Inoltre, il periodo di validità del kit può influenzare l attività enzimatica e quindi l intensità del colore. I valori misurati sono ancora validi. 12. LIMITI DELLA PROCEDURA - Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva standard per ogni esecuzione del test. - La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione crociata tra reagenti può casusare risultati erronei. - Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro riutilizzabili devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell uso. - Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o falsi negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la Soluzione di Lavaggio fresca, riempire con il Tampone di Lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti scoperti, o non permettere che si asciughino per periodi prolungati (24) 13/18

15 13. Caratteristiche di Prestazione Sensibilità Il limite di rilevamento dell IL-1alpha umana definito come la concentrazione dell analita, risultante in un assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più 2 deviazioni standard), è stato determinato di 1.1 pg/ml (media di 6 dosaggi indipendenti) Riproducibilità Intra-Dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 6 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di IL-1alpha umana. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. Il coefficiente complessivo di variazione intradosaggio calcolato è < 5.4 % Inter-Dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 6 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di IL-1alpha umana. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. Il coefficiente complessivo di variazione intradosaggio calcolato è < 10 % Test di Recupero Il test di recupero è stato valutato aggiungendo 4 livelli di IL-1alpha umana in un pool di siero umano normale e campioni di plasma citrato. I recuperi sono stati determinati nel corso di 3 esperimenti indipendenti, ognuno con 4 replicati. La quantità di IL-1alpha umana endogena in campioni non addizionati è stata sottratta dai valori del test. Il medio complessivo è 92 % Parallelismo della Diluizione Campioni di siero con diversi livelli di IL-1 alpha umana sono stati analizzati in diluizioni seriali multiple di 2 e con 4 replicati l uno. Il recupero medio complessivo è 99 % Stabilità dei Campioni Stabilità a Congelamento - Scongelamento Aliquote di campioni di siero (non addizionati o addizionati) sono stati conservati a -20 C e scongelati 5 volte e sono stati determinati i livelli di IL-1alpha umana. Con il congelamento e lo scongelamento non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività del IL-alpha umana Stabilità della Conservazione Aliquote di campioni di siero (addizionati o non addizionati) sono state conservate a -20 C, 2-8 C, a temperatura ambiente (TA) ed a 37 C e il livello di IL-1alpha umana ne è stato determinato dopo 24 ore. Durante la conservazione alle condizioni sopraindicate non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività dello IL-1alpha umana. Si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività della IL-1 alpha umana (50 %) durante la conservazione a TA e 37 C dopo 24 ore Specificità La reattività crociata e l interferenza di fattori circolanti del sistema immunitario sono state valutate addizionando queste proteine in concentrazioni fisiologicamente rilevanti ad un siero positivo di IL-1 alpha umana. Non si è rilevata alcuna reattività crociata o interferenza (24) 14/18

16 13.7. Valori Attesi Per la IL-1 alpha umana è stato testato un pannello di 40 campioni di sia siero sia plasma EDTA, Citrato ed Eparina di donatori apparentemente sani (maschi e femmine) selezionati casualmente (vedi Tavola 3). I livelli misurati possono variare con la raccolta di campioni usata. Per i livelli di IL-1 alpha umana misurati vedi la Tavola 3. Tavola 3 Matrice di Campione Numero di Campioni Intervallo Esaminati (pg/ml) % Rilevable Siero 40 nd* Plasma (Citrato) 40 nd* Plasma (EDTA) 40 nd* Plasma (Heparina) 40 nd* Media dei Valori Rilevabile (pg/ml) *nd = non-detectable (non rilevabile), i campioni misurati sotto il punto standard più basso sono stati considerati non rilevabili. 14. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI Per gli ordini contattare: Vedi ultima pagina. Per informazioni tecniche contattare: IBL@IBL-International.com (24) 15/18

17 15. Sommario: Preparazione dei Reagenti Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Lavaggio 20x (50 ml) a 950 ml di acqua distillata. Numero di strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Acqua Distillata (ml) Aggiungere Concentrato di Tampone di Dosaggio 20x (5 ml) a 95 ml di acqua distillata. Numero di strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata (ml) Coniugato di Biotina Fare una diluizione 1:100 di Coniugato di Biotina nel Tampone di Dosaggio (1x): Numero di strisce Acqua Distillata (ml) Coniugato de Biotina (ml) Estreptavidina-HRP Fare una diluizione 1:200 di Streptavidina-HRP nel Tampone di Dosaggio (1x): Numero di strisce Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Streptavidina-HRP (ml) Standard IL-1 alpha Umana Reconstituire il Standard liofilizzato di IL-1 alpha umana con acqua distillata. (Il volume di ricostituzione è dichiarato sull etichetta del flaconcino dello standard.) Tampone di Dosaggio (1x) (ml) (24) 16/18

18 16. Sommario di Procedura del Test 1. Determinare il numero di strisce di micropozzetti richiesto. 2. Lavare le strisce di micropozzetti due volte con il Tampone di Lavaggio. 3. Diluizione standard sulla piastra di micropozzetti: Aggiungere 100 µl di Diluente dei Campioni, in duplicato, a tutti i pozzetti standard. Pipettare 100 µl di standard preparato nei primi pozzetti e creare diluizioni di standard trasferendo 100 µl da pozzetto a pozzetto. Scartare 100 µl dagli ultimi pozzetti. Alternativamente diluizione esterna dello standard in tubi (vedi ): Pipettare 100 µl di queste diluizioni dello standard nei micropozzetti. 4. Aggiungere 100 µl di Diluente dei Campioni, in duplicati, ai pozzetti del bianco. 5. Aggiungere 50 µl di Diluente dei Campioni a tutti i pozzetti. 6. Aggiungere 50 µl di campione in duplicato a tutti i pozzetti. 7. Preparare il Coniugato di Biotina. 8. Aggiungere 50 µl di Coniugato di Biotina a tutti i pozzetti. 9. Coprire le strisce e incubare 2 ore a temperatura ambiente (18-25 C). 10. Preparare la Streptavidina-HRP. 11. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 4 volte con Soluzione Tampone di Lavaggio. 12. Aggiungere 100 µl di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti. 13. Coprire le strisce e incubare 1 ore a temperatura ambiente (18-25 C). 14. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 4 volte con Soluzione Tampone di Lavaggio. 15. Aggiungere 100 µl di Soluzione di Substrato TMB a tutti i pozzetti. 16. Incubare le strisce di micropozzetti per circa 10 minuti a temperatura ambiente (18-25 C). 17. Aggiungere 100 µl di Soluzione Bloccante a tutti i pozzetti. 18. Azzerare il lettore di micropozzetti e misurare l intensità del colore a 450 nm. Nota bene: Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni di supernatanti di colture cellulari sono stati diluiti 1:2 (50 µl di campione + 50 Diluente dei Campioni). La concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (2x) (24) 17/18

19 17. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO 1. Lay, Jong Ding; Tsao, Chao Jung; Chen, Jen Yang; Kadin, Marshall E.; Su, Ih Jen. Upregulation of Tumor Necrosis Factor-alpha Gene by Epstein-Barr Virus and Activation of Macrophages in Epstein- Barr Virus-infected T Cells in the Pathogenesis of Hemophagocytic Syndrome. Journal of Clinical Investigation 1997; 100: Karrer, S.; Bosserhoff, A. K.; Weiderer, P.; Landthaler, M.; Szeimies, R. M.. Keratinocytederived cytokines after photodynamic therapy and their paracrine induction of matrix metalloproteinases in fibroblasts. British Journal of Dermatology 2004; 151: Astiz, M. E.; Saha, D. C.; Carpati, C. M.; Rackow, E. C.. Induction of endotoxin tolerance with monophosphoryl lipid A in peritonitis: importance of localized therapy. J.Lab Clin.Med. 1994; 123: Lee, S. H.; Brennan, F. R.; Jacobs, J. J.; Urban, R. M.; Ragasa, D. R.; Glant, T. T.. Human monocyte/macrophage response to cobalt-chromium corrosion products and titanium particles in patients with total joint replacements. J. Orthop. Res. 1997; 15: Yamashita, U.; Shirakawa, F.; Nakamura, H.. Production of interleukin 1 by adult T cell leukemia (ATL) cell lines. J.Immunol. 1987; 138: Basso, D.; Plebani, M.; Fogar, P.; Panozzo,M. P.; Meggiato, T.; De, Paoli M.; Del, Favero G.. Insulin-like growth factor-i, interleukin-1 alpha and beta in pancreatic cancer: role in tumor invasiveness and associated diabetes. Int J.Clin.Lab Res. 1995; 25: Mantovani, G.; Maccio, A.; Bianchi, A.; Curreli, L.; Ghiani, M.; Santona, M. C.; Del Giacco, G. S.. Megestrol acetate in neoplastic anorexia/cachexia: clinical evaluation and comparison with cytokine levels in patients with head and neck carcinoma treated with neoadjuvant chemotherapy. Int J.Clin.Lab Res. 1995; 25: Wilmott, R. W.; Frenzke, M.; Kociela, V.; Peng, L.. Plasma interleukin-1 alpha and beta, tumor necrosis factor-alpha, and lipopolysaccharide concentrations during pulmonary exacerbations of cystic fibrosis. Pediatr.Pulmonol. 1994; 18: Jurincic-Winkler, C. D.; Gallati, H.; varez-mon, M.; Sippel, J.; Carballido, J.; Klippel, K. F.. Urinary interleukin-1 alpha levels are increased by intravesical instillation with keyhole limpet hemocyanin in patients with superficial transitional cell carcinoma of the bladder. Eur.Urol. 1995; 28: Shanbhag, A. S.; Jacobs, J. J.; Black, J.; Galante, J. O.; Glant, T. T.. Cellular mediators secreted by interfacial membranes obtained at revision total hip arthroplasty. J.Arthroplasty 1995; 10: Mizel, S. B.. Interleukin 1 and T cell activation. Immunol.Rev. 1982; 63: Yoshida, A.; Asaga, T.; Masuzawa, C.; Kawahara, S.; Yanoma, S.; Harada, M.; Okamoto, T.. Production of cytokines by thyroid carcinoma cell lines. J.Surg.Oncol. 1994; 55: Schuster, A.; Haarmann, A.; Wahn, V.. Cytokines in neutrophil-dominated airway inflammation in patients with cystic fibrosis. Eur.Arch.Otorhinolaryngol. 1995; 252 Suppl : S59-S Wood, D. D.; Bayne, E. K.; Goldring, M. B.; Gowen, M.; Hamerman, D.; Humes, J. L.; Ihrie, E. J.; Lipsky, P. E.; Staruch, M. J.. The four biochemically distinct species of human interleukin 1 all exhibit similar biologic activities. J.Immunol. 1985; 134: (24) 18/18

20 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /