stnf-r (60kDa) ELISA

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1 Istruzioni per l Uso stnf-r (60kDa) ELISA Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa stnf-r (60kDa) nel siero, plasma e supernatanti di colture cellulari umani. BE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 TABLE OF CONTENTS 1 Uso Previsto 2 2 Summary 2 3 Principio del Test 3 4 Reagenti Forniti 4 5 Istruzioni di Conservazione 4 6 Prelievo e conservazione dei Campioni 4 7 Materiali necessair ma no forniti 5 8 Precauzioni per l'uso 5 9 Preparazione dei Reagenti 6 10 Procedura del Test 8 11 Calcolo dei Resultati Limiti della procedura Caratteristiche di Prestazione Informationi per gli ordini Sommario: Preparazione dei Reagenti Sommario di Procedura del Test Riferimenti Bibliografici sul Prodotto (27) 1/18

3 1 Uso Previsto Il stnf-r (60kDa) ELISA è un test ELISA per la determinazione quantitativa di TNF alfa umano. Il stnf-r (60kDa) ELISA è per uso diagnostico in vitro. Non si usa per procedure terapeutiche. 2 Sommario Il fattore di necrosi tumorale (TNF) è stato originariamente scoperto nei sera degli animali e si è scoperto che provoca la necrosi emorragica di alcuni tumori umani e tumori umani trapiantati e di esporre principalmente attività citotossiche contro il tumore ma non le cellule normali in vitro. La famiglia di TNF è costituita da due proteine designate TNF alfa, chiamata anche cachectina e beta TNF, chiamata anche linfotossina, che sono citochine pleiotropiche che possono mediare un'ampia varietà di effetti biologici. Sia TNF alfa e TNF beta hanno dimostrato di interagire con una cellula attraverso recettori specifici ad alta affinità con poche centinaia fino a più di copie per cellula. I recettori del TNF sono stati dimostrati su un'ampia varietà di cellule somatiche umane tra cui fibroblasti, cellule endoteliali, adipociti, membrane epatiche, granulociti e diverse linee cellulari tumorali. Cellule mieloide normali e maligne e linfociti stimolati da mitogeni esprimono un numero simile di recettori TNF ( per cellula), mentre le cellule linfatiche riposanti hanno meno globuli rossi e le piastrine non hanno recettori TNF rilevabili. Nella maggior parte dei casi non si osserva correlazione tra il numero di recettori e la sensibilità al TNF. Sulla base degli esperimenti di filtrazione del gel, il recettore sembra essere un complesso di proteine diverse con un peso molecolare di 350 kda. In una varietà di linee cellulari sono stati identificati due diversi tipi di recettori TNF con rispettivamente e kda. I cdna che codificano i due diversi recettori TNF sono stati clonati. Il meccanismo esatto di trasduzione del segnale dopo il legame di TNF al recettore è ancora poco chiaro. Il frammento extracellulare del recettore TNF di 60 kda, con una massa molecolare di circa 30 kda è stato purificato, parzialmente sequenziato e il rispettivo cdna è stato clonato. Questa proteina legante TNF viene liberata dalla molecola intatta mediante scissione proteolitica e comprende la maggior parte della parte extracellulare del recettore, inclusi tutti e tre i siti di N-glicosilazione. Il presente dosaggio fornisce un metodo semplice, rapido ed altamente sensibile per la determinazione di livelli solubili di stnf-r (60 kda) nei liquidi corporei o nei supernatanti della coltura cellulare. Questo dosaggio aiuterà a chiarire il possibile valore diagnostico e prognostico della circolazione stnf-r (60 kda) in varie malattie neoplastiche e infiammatorie (27) 2/18

4 3 Principio del Test I micropozzetti vengono rivestiti con un anticorpo di rivestimento anti- stnf-r (60 kda) umano. Figura 1 Micropozzetto Rivestito Anticorpo di Rivestimento Il stnf-r (60 kda) umano presente nel campione o nello standard si lega agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti. Vi si aggiunge una miscela di tracciante (anticorpo anti-umano stnf-r (60 kda) coniugato con l HRP), che si lega con la stnf-r (60 kda) umana catturato dal primo anticorpo. Figura 2 Prima Incubazione Standard o Campione HRP-Conjugate Dopo l incubazione, la stnf-r (60 kda) anti-umana coniugato all HRP e non legato viene rimosso con una fase di lavaggio e ai pozzetti viene aggiunta una soluzione di substrato reattiva all HRP. Figura 3 Seconda Incubazione Substrate In proporzione alla quantità di stnf-r (60 kda) umano presente nel campione o nello standard si forma un prodotto colorato. La reazione viene terminata aggiungendo l acido e l assorbanza si misura a 450 nm. Si prepara una curva standard sulla base di 7 diluizioni standard di stnf-r (60 kda)umano e si determina la concentrazione del campione di stnf-r (60 kda)umano. Figura 4 - Substrato-reazione (27) 3/18

5 4 Reagenti Forniti 1 busta d alluminio con Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpo monoclonale anti-human stnf-r (60 kda) 1 flaconcino (200 µl) di anticorpo HRP-Coniugato (anticorpo monoclonale human stnf-r (60 kda)) 2 flaconcini (50 µl) human stnf-r (60 kda) Standard, 10 ng/ml 1 flaconcino di Controllo basso, liofilizzato 1 flaconcino di Controllo alto, liofilizzato 1 flaconcino (5 ml) con Tampone del Saggio concentrata 20x (PBS con 1% Tween 20 e 10% BSA) 1 bottiglia (50 ml) con Tampone di Lavaggio concentrato 20x (PBS con 1% Tween 20) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione Substrato (tetrametilbenzidina) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione bloccante (acido fosforico 1M) 2 Copripiastra adesivi 5 Istruzioni di Conservazione Conservare i reagenti del kit a 2-8 C e i controlli a -20 C. Subito dopo l'uso riporre i reagenti nel luogo di conservazione a 2-8 C e i controlli a -20 C. La scadenza del kit e dei reagenti è indicata sulle etichette. La data di scadenza dei componenti del kit può essere garantita solo se questi sono conservati correttamente e, in caso di uso ripetuto di un componente, il reagente non è stato contaminato durante la prima manipolazione. 6 Prelievo e conservazione dei Campioni Con questo dosaggio sono stati testati i supernatanti delle colture cellulari, il siero ed il plasma (EDTA, citrato, eparina). Altri campioni biologici potrebbero essere idonei all uso per questo dosaggio. Dopo la coagulazione e la separazione, rimuovere il siero o plasma dal coagulo o gli cellulas il più presto possibile. I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio. Non usare campioni emolizzati in maniera grossolana, o lipemici. I campioni devono essere aliquotati e conservati sotto zero a -20 C, per evitare la perdita di stnf-r (60 kda) umano bioattiva. Se i campioni devono essere usati entro 24 ore, possono essere conservati a una temperatura tra 2 C ed 8 C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto 13.5). Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelato dev essere portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela (27) 4/18

6 7 Materiali necessair ma no forniti Pipette graduate da 5 ml e 10 ml Micropipette adattabili da 5 µl a 1000 µl a canale singolo, con punte usa e getta Micropipette adattabili da 50 µl to 300 µl multicanale con punte usa e getta Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico. Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (lunghezza d onda di riferimento 620 nm) Acqua bidistillata o deionizzata Calcolatore statistico con programma che esegua l analisi di regressione 8 Precauzioni per l'uso Tutti i prodotti reagenti vanno considerati come potenzialmente pericolosi. Raccomandiamo, perciò, l'utilizzo di questo prodotto solo da personale addestrato alle tecniche di laboratorio e che siano avvezze alle comuni pratiche di laboratorio. Indossare abbigliamento idoneo come camici, guanti ed occhiali. Attenzione ad evitare contatto con la pelle e gli occhi. Nel caso di contatto con pelle o occhi, immediatamente lavare con acqua. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per specifici consigli. I reagenti sono per uso in vitro diagnostico e non sono per uso terapeutico. Non mischiare tra loro reagenti di diversi lotti o provenienza. Non usare i kit dopo la data di scadenza. Non esporre i reagenti del kit, durante la conservazione e incubazione a forti fonti di luce. Non pipettare utilizzando la bocca. Non mangiare o fumare nell'area dove sono utilizzati i reagenti dei kit o i campioni. Evitare il contatto dei reagenti o campioni con la pelle o le mucose. Guanti di gomma o lattice dovrebbero essere sempre indossati quando si usano reagenti e campioni. Evitare il contatto tra il substrato del kit e agenti ossidanti e metallo. Evitare schizzi o produzione di aereosol. Per evitare contaminazione microbica o cross-contaminazione dei reagenti o dei campioni che invaliderebbero il test, usare sempre pipette e puntali mono-uso. Usare vaschette pulite e dedicate per la dispensare il reagente substrato. L'esposizione agli acidi inattiva il coniugato. Acqua distillata o de-ionizzata deve essere utilizzata per la preparazione dei reagenti. La soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente prima dell'utilizzo. Decontaminare ed eliminare i campioni e tutto il materiale potenzialmente contaminante perchè potrebbero contenere agenti infettanti. Il metodo preferito per la decontaminazione è l'autoclavaggio per minimo 1 ora a C. Gli scarti liquidi, non contenenti acido e gli scarti neutralizzati possono essere mischiati con sodio ipoclorido in un volume finale di 1.0%. Lasciare minimo 30 minuti per l'effettiva decontaminazione. Scarti liquidi contenenti acido devono essere neutralizzati prima dell'aggiunta di sodio ipoclorido (27) 5/18

7 9 Preparazione dei Reagenti Prima di cominciare con le procedure del test i concentrati dei tamponi devono essere portati a temperatura ambientale e diluiti alle concentrazioni adeguate. Se i concentrati dei tampone presenta cristalli in sospensione, riscaldare lievemente i tamponi fino a ottenere la completa dissoluzione dei cristalli. 9.1 Tampone di Lavaggio (1x) Versare l'intero contenuto (50 ml) del tampone di lavaggio concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 1000 ml. Portare il volume finale a 1000 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Trasferire il prodotto in una bottiglia pulita e conservare a temperature comprese fra 2 C e 25 C. Il tampone di lavaggio è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il tampone di lavaggio secondo la tabella seguente: Numero di strip Tampone di lavaggio (20x) (ml) Acqua distillata (ml) Tampone del Saggio (1x) Versare l'intero contenuto (5 ml) del tampone del saggio concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 100 ml. Portare il volume finale a 100 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Conservare a temperatura compresa fra 2 C e 8 C. La soluzione tampone diluita è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare la soluzione tampone secondo la tabella seguente: Numero di strip Tampone del Saggio concentrato (20x) (ml) Acqua distillata (ml) HRP-Conjugato Il HRP-Coniugato deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione. HRP-Coniugato deve essere diluito 1:100 (1:300 per campioni urinari) contampone del Saggio (1x) in una provetta di plastica pulita secondo la tabella seguente: Numero di strip HRP-Coniugato (ml) Tampone del Saggio (1x) (8.97)* (17.94)* * per campioni urinari (27) 6/18

8 9.4 Human stnf-r (60 kda) Standard Diluire lo human stnf-r (60 kda) standard aggiungendo il Tampone del Saggio (1x) come riportato sull'etichetta della fiala e mescolare gentilmente (concentrazione dello standard diluito = 10 ng/ml). È raccomandato di centrifugare i tubi per qualche secondo in una microcentrifuga prima di aprirli per raccogliere il standard dal fondo del tubo. Dopo l'uso, lo standard rimanente non può essere riutilizzato e deve essere buttato. La diluizione dello standard può essere fatto direttamente nella piastra (vedi 10.c.) oppure nei tubi (vedi 9.4.1) Diluizione degli Standard esterni Etichettare 7 tubi, uno per ogni punto dello standard. S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7 Preparare diluizione seriali 1:2 per lo standard nel seguente modo: Pipettare 225 µl di Tampone del Saggio (1x) nei tutti tubi. Pipettare 225 µl di diluito (concentrazione dello standard = 10 ng/ml) nel primo tubo, etichettato S1, e mescolare (concentrazione dello standard 1= 5 ng/ml). Pipettare 225 µl di questa diluizione nel secondo tubo, etichettato S2, mischiare accuratamente prima del successivo trasferimento. Ripetere le 5 diluizioni seriali in modo da creare i punti della curva di calibrazione (vedere Figura 5) Tampone del Saggio (1x) serve come bianco. Figura 5 Transferire 225 µl S2 S3 S4 S5 - S7 Human stnf-r (60 kda) Standard diluito Tampone del Saggio (1x) 225 µl Buttare 225 µl 9.5 Controlli Solubilizzare aggiungendo 100 µl di acqua distillata al controlli liofilizzati. Permettere al controlli di riposare per minuti. Agitare o mescolare delicatamente per assicurare una solubilizzazione completa ed omogenea. In seguito considerare i controlli allo stesso modo dei campioni del dosaggio. Per il range dei valori del controllo si rimanda al certificato di analysis o all'etichetta presente sulla fiala. Conservare i controlli ricostituiti in aliquote a -20 C. Evitare ripetuti cicli di scongelamento (27) 7/18

9 10 Procedura del Test a. Stabilire il numero di strip dei micropozzetti necessarie per analizzare la quantità desiderata di campioni più le strip per i bianchi e gli standard. Tutti i campioni, gli standardi, il bianco e il devono essere processati in duplicato. Rimuovere dal supporto le strip micropozzetti non utilizzate e conservarle nella bustina metallica contenente la polvere essiccante, mantenendole a 2-8 C e perfettamente sigillate. b. Lavare due volte le strip micropozzetti utilizzando circa 400 µl di tampone di lavaggio per pozzetto, aspirando accuratamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l'altro. Permettere al tampone di lavaggio di rimanere, nei pozzetti, circa secondi prima dell'aspirazione. Evitare di scalfire la superficie dei micropozzetti. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare le strip micropozzetti con un tampone o carta assorbente per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso. Utilizzare le strip subito dopo il lavaggio o sistemarle capovolte su carta assorbente umida per non più di 15 min. Non lasciar asciugare i pozzetti. c. Diluizione dello standard in micropozetti (alternativamente la diluizione dello standard può avvenire in tubi vedi 9.4.1) Aggiungere 100 ul di Tampone del Saggio (1x) in duplicato a tutti i pozzetti dello standard. Pipettare 100 µl standard preparato (vedi preparazione dello standard concentrazione = ng/ml) in duplicato nei pozzetti A1 e A2 (vedi Tavola 1). Mescolare il contenuto dei pozzetti A1 e A2 attraverso ripetute aspirazione ed iniezioni (concentrazione dello standard 1, S1 = 5.00 ng/ml) e trasferire 100 µl, rispettivamente, ai pozzetti B1 e B2 (vedere Figura 2). Fare attenzione a non graffiare la parte interna dei pozzetti. Continuare questa procedura per 5 volte, creando due colonne di standard in diluizione con concentrazione da 5.00 a 0.08 ng/ml. Buttare 100 µl del contenuto degli ultimi pozzetti (G1 e G2). Figura 6 Trasferire 100 µl S1 S2 S3 S4 - S7 Human stnf-r (60 kda) Standard diluito Tampone del Saggio (1x) 100 µl Buttare 100 µl In caso di diluizione esterna dello standard (vedi 4.4.1) pipettare 100 µl di queste diluizioni standard (S1 S7) nei pozzetti degli standard come da Tabella (27) 8/18

10 Tavola 1 Tabella rappresenta un esempio dell'organizzazione dei bianchi, standardi e campioni nei pozzetti: A Standard 1 (5.00 ng/ml) Standard 1 (5.00 ng/ml) Campione 1 Campione 1 B Standard 2 (2.50 ng/ml) Standard 2 (2.50 ng/ml) Campione 2 Campione 2 C Standard 3 (1.25 ng/ml) Standard 3 (1.25 ng/ml) Campione 3 Campione 3 D Standard 4 (0.63 ng/ml) Standard 4 (0.63 ng/ml) Campione 4 Campione 4 E Standard 5 (0.31 ng/ml) Standard 5 (0.31 ng/ml) Campione 5 Campione 5 F Standard 6 (0.16 ng/ml) Standard 6 (0.16 ng/ml) Campione 6 Campione 6 G Standard 7 (0.08 ng/ml) Standard 7 (0.08 ng/ml) Campione 7 Campione 7 H Bianco Bianco Campione 8 Campione 8 d. Dispensare 100 µl di Tampone del Saggio (1x) in duplicato ai pozzetti de bianco. e. Dispensare 90 µl di Tampone del Saggio (1x) in duplicato ai pozzetti dei campioni. f. Dispensare 10 µl di campione in duplicato ai pozzetti dei campioni. g. Preparare la HRP-coniugato (consultare la sezione HRP-coniugato 9.3 sulla preparazione dei reagenti). h. Dispensare 50 µl (100 µl per campioni urinari) di HRP-coniugato a ciascun pozzetto. i. Coprire con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 2 ore utilizzando, se disponibile, un vortex a 400 rpm. j. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strip della pozzeti 3 volte come descritto in punto 5.b del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo. k. Pipettare 100 µl di soluzione substrato TMB in tutti i pozzetti, inclusi quelli del blank. l. Incubare le strip a temperatura ambiente (18-25 C) per circa 10 minuti. Evitare l'esposizione diretta a luci intense. È necessario monitorare i valori O.D. a livello della piastra e interrompere la reazione del substrato (vedi il punto prossimo del protocollo) prima che i pozzetti positivi cessino di essere appropriatamente registrabili. La determinazione del tempo necessario per lo sviluppo del colore dev'essere fatto per ogni singolo parametro (27) 9/18

11 Si raccomanda di aggiungere la soluzione di stop quando lo standard più elevato ha sviluppato un colore blu scuro. Alternativamente lo sviluppo del colore può essere monitorato con un lettore ELISA a 620 nm. La reazione del substrato deve essere bloccata non appena viene misurato un valore delle OD di m. Interrompere la reazione enzimatica pipettando rapidamente 100 µl di soluzione bloccante in ciascun pozzetto, inclusi i pozzetti del bianco. È importante che la soluzione bloccante si diffonda rapidamente e uniformemente attraverso i micropozzetti per inattivare completamente l'enzima. I risultati devono essere letti immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione bloccante o entro 1 ora se le strip sono conservate in un luogo buio a 2-8 C. n. Leggere l'assorbanza di ciascun micropozzetto su uno spettrofotometro che utilizza 450 nm come lunghezza d'onda primaria (620 nm come lunghezza d'onda di riferimento alternativa; valori da 610 nm a 650 nm sono accettabili). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del produttore e utilizzando i pozzetti del bianco. Determinare l'assorbanza sia dei campioni, sia degli standard di human stnf-r (60 kda). I campioni sono stati diluiti 1:10, quindi la concentrazione dalla curva standard risultante deve essere moltiplicata per il fattore di diluizione (x 10). Note: In caso di incubazione senza agitazione i valori di densità ottica (O.D.) potranno essere più bassi di quanto indicato sotto. Tuttavia i risultati saranno da ritenersi validi. 11 Calcolo dei Resultati - Calcolare i valori medi dell assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati devono rientrare nel 20 % del valore medio. - Creare una curva standard segnando l assorbanza media di ogni concentrazione standard sull ordinata contro la concentrazione di stnf-r (60 kda) umano sull ascissa. Disegnare una curva di best-fit congiungendo i punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri). - Per determinare la concentrazione di stnf-r (60 kda) umano circolante per ogni campione, trovare prima il valore medio di assorbanza sull ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva standard. Nel punto d intersezione estendere una linea verticale fino all ascissa e leggere il valore corrispondente della concentrazione di stnf-r (60 kda) umano. - Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni di colture celulari sono stati diluiti 1:10 (10 µl campione + 90 µl Tampone del Saggio (1x)). La concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (10x). - Il calcolo dei campioni con una concentrazione superiore allo Standard 1 può dare per risultato livelli scorretti e bassi di stnf-r (60 kda) umano. Questi campioni richiedono un ulteriore prediluizione esterna secondo i valori stimati dell stnf-r (60 kda) umano, con un Tampone del Saggio (1x) in modo da quantificare con precisione i livelli reali di stnf-r (60 kda) umano. - Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione di stnf-r (60 kda) umano conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i valori ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non essere validi. - La Figura 7 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per dedurne risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di strisce per micropozzetti su cui si fa il dosaggio (27) 10/18

12 Figura 6 Curva standard rappresentativa per il stnf-r (60 kda) umano ELISA. Il stnf-r (60 kda) umano è stato diluito in 2 fasi seriali nel Tampone del Saggio (1x). Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva standard dev essere eseguita per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio. 10 Absorption 450 nm Concentration (ng/ml) (27) 11/18

13 Tavola 2 Dati tipici relativi all uso dell stnf-r (60 kda) umano ELISA Lunghezza d onda: 450 nm Lunghezza d onda di riferimento: 620 nm Standard Concentrazione stnf-r (60 kda) umano (ng/ml) O.D. 450 nm O.D. Meda 450 nm C.V. (%) Bianco I valori DO della curva standard possono variare a seconda delle condizioni di prestazione del dosaggio (ad es.: operatore, tecnica di pipettaggio o effetti della temperatura). Inoltre, il periodo di validità del kit può influenzare l attività enzimatica e quindi l intensità del colore. I valori misurati sono ancora validi. 12 Limiti della procedura Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva standard per ogni esecuzione del test. La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione crociata tra reagenti può casusare risultati erronei. Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro riutilizzabili devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell uso. Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o falsi negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la Soluzione di Lavaggio fresca, riempire con il Tampone di Lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti scoperti, o non permettere che si asciughino per periodi prolungati. L uso della radioimmunoterapia ha aumentato significativamente il numero di pazienti con anticorpi umani IgG anti-topo (HAMA). HAMA può interferire con dosaggi che utilizzano anticorpi monoclonali murini, portando sia a risultati falsi positivi, sia falsi negativi. I campioni di siero contenenti anticorpi delle immunoglobuline murine possono essere ancora analizzati in questi dosaggi quando le immunoglobuline murine (siero, liquido ascitico o anticorpi monoclonali di specificità irrilevante) vengono aggiunti al campione (27) 12/18

14 13 Caratteristiche di Prestazione 13.1 Sensibilità Il limite di rilevamento dell stnf-r (60 kda) umano definito come la concentrazione dell analita, risultante in un assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più 2 deviazioni standard), è stato determinato di 0.05 ng/ml (media di 6 dosaggi indipendenti) Riproducibilità Intra-Dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di stnf-r (60 kda) umano. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di stnf-r (60 kda) umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 3). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 1.9 %. Tavola 3 La concentrazione media di stnf-r (60 kda) umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione. Campione Esperimento Concentrazione Media stnf-r (60 kda) umano (ng/ml) CV (%) (27) 13/18

15 Inter-Dosaggio La riproducibilità da dosaggio a dosaggio nell ambito di un laboratorio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di stnf-r (60 kda) umano. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di stnf-r (60 kda) umano ed il coefficiente di variazione calcolato su 18 determinazioni di ogni campione (vedi Tavola 4). Il coefficiente di variazione inter-dosaggio complessivo calcolato era del 8.6 %. Tavola 4 La concentrazione media di stnf-r (60 kda) umano ed il coefficiente di variazione di ogni campione Campione Concentrazione Media stnf-r (60 kda) umano (ng/ml) CV (%) Test di Recupero Il test di recupero è stato valutato aggiungendo 2 livelli di stnf-r (60 kda) umano al siero (diluito 1:10). I recuperi sono stati determinati nel corso di 3 esperimenti indipendenti, ognuno con 8 replicati di campioni di siero. In questi esperimenti il siero non addizionato è stato usato come bianco. l recupero rientrava in un range dal 91 % al 96 % con un recupero medio complessivo del 93 % (27) 14/18

16 13.4 Parallelismo della Diluizione 3 campioni di siero con diversi livelli di stnf-r (60 kda) umano sono stati analizzati in diluizioni seriali multiple di 2 e con 4 replicati l uno. Il recupero rientrava in un range dal 92% al 111 % con un recupero medio complessivo del 103 % (vedi Tavola 5). Tavola 5 Campione Concentrazione attesa di stnf-r (60 kda) umano (ng/ml) Concentrazione misurata di stnf-r (60 kda) umano (ng/ml) Recupero di concentrazione attesa di stnf-r (60 kda) umano (%) Diluzione 1 1: : : : : : : : : : : : Stabilità dei Campioni Stabilità a Congelamento - Scongelamento Aliquote di campioni di siero e supernatanti di colture cellulari (non addizionati o addizionati) sono stati conservati a -20 C e scongelati 5 volte e sono stati determinati i livelli di stnf-r (60 kda) umano. Si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività della stnf-r (60 kda) umano con altri congelamento e lo scongelamento Stabilità della Conservazione Aliquote di campioni di siero (aggiunti o non aggiunti) sono state conservate a -20 C, 2-8 C, a temperatura ambiente (TA) ed a 37 C e il livello di stnf-r (60 kda) umano ne è stato determinato dopo 24 ore. Durante la conservazione a -20 C ed a 2-8 C non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività dello stnf-r (60 kda) umano. Si è rilevata una perdita leve d immunoreattività della stnf-r (60 kda) umano durante la conservazione a TA et a 37 C dopo 24 ore Comparazione tra Siero e Plasma Sono stati valutati siero ed EDTA, citrato e plasma eparinato ottenuti contemporaneamente e di due individui. Le concentrazioni di stnf-r (60 kda) umana non erano significativamente diverse; quindi tutti questi fluidi corporei sono idonei al dosaggio. Tuttavia, è altamente raccomandato di garantire l uniformità delle preparazioni del sangue. Tavola 6 Matrice di Concentrazione stnf-r (60 kda) umano (ng/ml) Campione Donatore 1 Donatore 2 Siero Plasma (EDTA) Plasma (Citrato) Plasma (Heparina) (27) 15/18

17 13.7 Specificità L interferenza dei fattori circolanti del sistema immune è stata valutata aggiungendo queste proteine in concentrazioni fisiologicamentre rilevanti ad un siero positivo di stnf-r (60 kda) umana. (50% di siero di Non è stata rilevata alcuna reattività crociata, con TNF alfa umano (<10 ng/ml) e TNF beta (<100 µg/ml) Valori Attesi Per la stnf-r (60 kda) umana è stato testato un pannello di 37 campioni di siero di donatori apparentemente sani (maschi e femmine) selezionati casualmente (random). I livelli di stnf-r (60 kda) umana rilevati erano compresi tra 1.47 e 4.16 ng/ml con un livello medio di 2.67 ng/ml e una deviazione standard di 0.69 ng/ml. 14 Informationi per gli ordini Per gli ordini contattare: Vedi ultima pagina. Per informazioni tecniche contattare: IBL@IBL-International.com 15 Sommario: Preparazione dei Reagenti 15.1 Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Lavaggio 20x (50 ml) a 950 ml di acqua distillata. Numero di strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (ml) Acqua Distillata (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Dosaggio 20x (5 ml) a 95 ml di acqua distillata. Numero di strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata (ml) Acqua Distillata (ml) HRP-Coniugato Fare una diluizione 1:100 di Coniugato di HRP nel Tampone di Dosaggio (1x): Numero di strisce HRP-Conjugato (ml) Tampone di Dosaggio (1x) (ml) (8.97)* (17.94)* * per campioni urinari (27) 16/18

18 15.4 Human stnf-r (60 kda) Standard Diluire lo human stnf-r (60 kda) standard aggiungendo il Tampone del Saggio (1x) come riportato sull'etichetta della fiala e mescolare gentilmente 15.5 Controlli Aggiungere 100 µl di acqua distillata ai controlli liofilizzati. 16 Sommario di Procedura del Test 1. Determinare il numero di strisce di micropozzetti richiesto. 2. Lavare le strisce di micropozzetti due volte con il Tampone di Lavaggio. 3. Diluizione standard sulla piastra di micropozzetti: Aggiungere 100 µl di Tampone del Saggio (1x)i, in duplicato, a tutti i pozzetti standard. Pipettare 100 µl di standard preparato nei primi pozzetti e creare diluizioni di standard trasferendo 100 µl da pozzetto a pozzetto. Scartare 100 µl dagli ultimi pozzetti. Alternativamente diluizione esterna dello standard in tubi (vedi ): Pipettare 100 µl di queste diluizioni dello standard nei micropozzetti. 4. Aggiungere 100 µl di Tampone di Dosaggio (1x), in duplicati, ai pozzetti del bianco. 5. Aggiungere 90 µl di Tampone di Dosaggio (1x), in duplicati, ai pozzetti di campione. 6. Aggiungere 10 µl di campione in duplicato ai pozzetti di campione. 7. Preparare il HRP-Coniugato. 8. Aggiungere 50 µl (100 µl per campioni urinari) di Coniugato di HRP a tutti i pozzetti. 9. Coprire le strisce e incubare 2 ore a temperatura ambiente (18-25 C). 10. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 3 volte con Soluzione Tampone di Lavaggio. 11. Aggiungere 100 µl di Soluzione di Substrato TMB a tutti i pozzetti. 12. Incubare le strisce di micropozzetti per circa 10 minuti a temperatura ambiente (18-25 C). 13. Aggiungere 100 µl di Soluzione Bloccante a tutti i pozzetti. 14. Azzerare il lettore di micropozzetti e misurare l intensità del colore a 450 nm. Nota bene: Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni sono stati diluiti 1:10 (10 µl campione + 90 µl Tampone di Dosaggio (1x)). La concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (10x). 17 Riferimenti Bibliografici sul Prodotto 1. Smith, C. A.; Davis, T.; Anderson, D.; Solam, L.; Beckmann, M. P.; Jerzy, R.; Dower, S. K.; Cosman, D.; Goodwin, R. G.. A receptor for tumor necrosis factor defines an unusual family of cellular and viral proteins. Science 1990; 248: Loetscher, H.; Pan, Y. C.; Lahm, H. W.; Gentz, R.; Brockhaus, M.; Tabuchi, H.; Lesslauer, W.. Molecular cloning and expression of the human 55 kd tumor necrosis factor receptor. Cell 1990; 61: Scheurich, P.; Thoma, B.; Ucer, U.; Pfizenmaier, K.. Immunoregulatory activity of recombinant human tumor necrosis factor (TNF)-alpha: induction of TNF receptors on human T cells and TNF-alphamediated enhancement of T cell responses. J.Immunol. 1987; 138: Schall, T. J.; Lewis, M.; Koller, K. J.; Lee, A.; Rice, G. C.; Wong, G. H.; Gatanaga, T.; Granger, G. A.; Lentz, R.; Raab, H.;.. Molecular cloning and expression of a receptor for human tumor necrosis factor. Cell 1990; 61: (27) 17/18

19 5. Aggarwal, B. B.; Eessalu, T. E.; Hass, P. E.. Characterization of receptors for human tumour necrosis factor and their regulation by gamma-interferon. Nature 1985; 318: Brockhaus, M.; Schoenfeld, H. J.; Schlaeger, E. J.; Hunziker, W.; Lesslauer, W.; Loetscher, H.. Identification of two types of tumor necrosis factor receptors on human cell lines by monoclonal antibodies. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1990; 87: Adolf, G. R.; Apfler, I.. A monoclonal antibody-based enzyme immunoassay for quantitation of human tumor necrosis factor binding protein I, a soluble fragment of the 60 kda TNF receptor, in biological fluids. J.Immunol.Methods 1991; 143: Creasey, A. A.; Yamamoto, R.; Vitt, C. R.. A high molecular weight component of the human tumor necrosis factor receptor is associated with cytotoxicity. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1987; 84: Tsujimoto, M.; Yip, Y. K.; Vilcek, J.. Tumor necrosis factor: specific binding and internalization in sensitive and resistant cells. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1985; 82: Kull, F. C., Jr.; Jacobs, S.; Cuatrecasas, P.. Cellular receptor for 125I-labeled tumor necrosis factor: specific binding, affinity labeling, and relationship to sensitivity. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1985; 82: Rubin, B. Y.; Anderson, S. L.; Sullivan, S. A.; Williamson, B. D.; Carswell, E. A.; Old, L. J.. High affinity binding of 125I-labeled human tumor necrosis factor (LuKII) to specific cell surface receptors. J.Exp.Med. 1985; 162: Paul, N. L.; Ruddle, N. H.. Lymphotoxin. Annu.Rev.Immunol. 1988; 6: Beutler, B.; Mahoney, J.; Le, Trang N.; Pekala, P.; Cerami, A.. Purification of cachectin, a lipoprotein lipasesuppressing hormone secreted by endotoxin-induced RAW cells. J.Exp.Med. 1985; 161: Baglioni, C.; McCandless, S.; Tavernier, J.; Fiers, W.. Binding of human tumor necrosis factor to high affinity receptors on HeLa and lymphoblastoid cells sensitive to growth inhibition. J.Biol.Chem. 1985; 260: Scheurich, P.; Ucer, U.; Kronke, M.; Pfizenmaier, K.. Quantification and characterization of high-affinity membrane receptors for tumor necrosis factor on human leukemic cell lines. Int.J.Cancer 1986; 38: Olsson, I.; Lantz, M.; Nilsson, E.; Peetre, C.; Thysell, H.; Grubb, A.; Adolf, G.. Isolation and characterization of a tumor necrosis factor binding protein from urine. Eur.J.Haematol. 1989; 42: Munker, R.; DiPersio, J.; Koeffler, H. P.. Tumor necrosis factor: receptors on hematopoietic cells. Blood 1987; 70: Himmler, A.; Maurer-Fogy, I.; Kronke, M.; Scheurich, P.; Pfizenmaier, K.; Lantz, M.; Olsson, I.; Hauptmann, R.; Stratowa, C.; Adolf, G. R.. Molecular cloning and expression of human and rat tumor necrosis factor receptor chain (p60) and its soluble derivative, tumor necrosis factor-binding protein. DNA Cell Biol. 1990; 9: Thoma, B.; Grell, M.; Pfizenmaier, K.; Scheurich, P.. Identification of a 60-kD tumor necrosis factor (TNF) receptor as the major signal transducing component in TNF responses. J.Exp.Med. 1990; 172: Hohmann, H. P.; Remy, R.; Brockhaus, M.; van Loon, A. P.. Two different cell types have different major receptors for human tumor necrosis factor (TNF alpha). J.Biol.Chem. 1989; 264: (27) 18/18

20 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθμός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Symbols Version 4.5 /