METODI DI CAMPIONAMENTO NEL MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO AMBIENTALE IN ANIMAL FACILITY

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Antonietta Ferrero
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1 METODI DI CAMPIONAMENTO NEL MONITORAGGIO MICROBIOLOGICO AMBIENTALE IN ANIMAL FACILITY Dott.ssa Piera Anna Martino DIPAV, Sezione di Microbiologia e Immunologia Veterinaria Facoltà di Medicina Veterinaria Università degli Studi di Milano Siena, 16 settembre 2011

2 Il monitoraggio microbiologico all interno di una animal facility è molto importante e, in genere, è associato al controllo dello stato sanitario degli animali stabulati superfici aria acqua

3 SUPERFICI

4 CAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICI Permette di determinare o confermare la presenza di agenti biologici È fondamentale come supporto All attività di monitoraggio sanitario Nella determinazione dell ampiezza della contaminazione Nella valutazione dell attività di disinfezione

5 CAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICI Il campionamento necessita La scelta di una porzione della superficie da indagare Superfici non porose (plastica, metallo, acciaio, ) La scelta di uno strumento efficace per la raccolta dei contaminanti microbici Fase di indagine Tipologia dell agente Dimensione e tipologia della/e superficie/i Limiti del metodo di campionamento

6 CAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICI Gli elementi essenziali per ottenere un campionamento di successo includono: Personale adeguatamente istruito Strategia di campionamento Definizione degli obiettivi Scelta del numero e dei tipi di campioni ambientali da raccogliere Scelta dei terreni colturali Laboratorio qualificato di sostegno Controllo di qualità

7 CAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICI In ogni procedura sperimentale di campionamento di agenti biologici dovranno essere utilizzati Materiali sterili Pre-sterilizzati in autoclave o irradiati Tecniche di asepsi Garantiscono un campione significativo

8 CAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICI Tre possibili fasi del campionamento delle superfici: 1. Fase di screening iniziale 2. Fase di caratterizzazione/identificazione 3. Fase di pulizia e controllo post-disinfezione

9 CAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICI 1. Fase di screening iniziale Campionamento qualitativo Presenza o assenza del microrganismo/i nell ambiente Scelta di punti sicuramente o molto probabilmente contaminati Porzioni di filtri di ventilazione/condizionamento Attenzione alle dimensioni del campione Fase rapida

10 CAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICI 2. Fase di caratterizzazione/identificazione Campionamento quantitativo Importanza dell area campionata in quanto i risultati sono riportati come concentrazione/area Permette di identificare le potenzialità dell infezione, le possibili vie di diffusione Identifica le zone da decontaminare/disinfettare Fase più indaginosa

11 CAMPIONAMENTO DELLE SUPERFICI 3. Fase di pulizia e controllo post-disinfezione Permette di controllare l efficacia delle procedure di disinfezione Riduzione del numero dei microrganismi ~0 UFC o al limite dello strumento/metodo utilizzato Tre possibilità di campionamento: Più campioni per avere un area maggiore Zone raggiungibili dal trattamento Zone difficili da raggiungere Attenzione alla presenza di residui di disinfettanti Uso di terreni con neutralizzanti

12 MA QUALI AGENTI BIOLOGICI SONO DA RICERCARE NELL AMBIENTE? MEDCHROME.COM

13 GLI STRUMENTI A DISPOSIZIONE salviette/spugnette piastre a contatto tamponi

14 LE LORO CARATTERISTICHE Tipo di campione Descrizione Target Usi Agenti biologici SPUGNETTE Garze/spugne sterili 5 x 5 cm Campionamento di un area piccola Screening di piccole zone Batteri Virus Inumidire con soluzione sterile Solo per superfici non porose Valutazione della contaminazione Tossine biologiche Campionamento mediante sagoma o su un area ben definita Valutazione efficacia della decontaminazione

16 LE LORO CARATTERISTICHE Tipo di campione Descrizione Target Usi Agenti biologici TAMPONE Tamponi sterili singoli Inumiditi con soluzione sterile o in terreno di trasporto Campionamento di un area ben definita Campionamento di un area molto piccola Solo per superfici non porose, angoli e piccole fessure Screening di zone molto piccole Valutazione della contaminazione di punti critici Valutazione efficacia della decontaminazione Batteri Virus Tossine biologiche

20 LE LORO CARATTERISTICHE Tipo di campione Descrizione Target Usi Agenti biologici PIASTRE A CONTATTO Raccolta del campione mediante pressione della piastra sulla superficie identificata Campionamento di un area piccola Solo per superfici non porose Screening di zone piccole Valutazione della contaminazione Valutazione efficacia della decontaminazione Batteri Non usare su superfici molto contaminate Breve shelf-life Scelta del terreno colturale

21 PBI

possibile Il laboratorio processerà altrettanto celermente i campioni Uso di

22 DA RICORDARE È importante che durante la conservazione e il trasporto i campioni siano mantenuti refrigerati e inviati al laboratorio il più rapidamente possibile Il laboratorio processerà altrettanto celermente i campioni Uso di metodi analitici validati perché i risultati siano ripetibili, riproducibili e confrontabili

23 ARIA

24 CAMPIONAMENTO DELL ARIA Permette di raccogliere e valutare la concentrazione e la composizione di agenti biologici aerosolizzati Attenzione alla caratteristica dei bioaerosol di sedimentare e ridisperdersi per movimenti dell aria Limitazioni legate al posizionamento e al tempo di campionamento (collection time) dello strumento utilizzato Risultati negativi indicano solo che un determinato agente non è presente in un certo sito in concentrazioni evidenziabili al momento del campionamento Raccolta di più campioni nel tempo

25 CAMPIONAMENTO DELL ARIA 1. Campionamento passivo 2. Campionamento attivo impattatori /aspiratori filtrazione

CAMPIONAMENTO PASSIVO DELL ARIA Passivo o deposizionale Deposizione per via gravitazionale delle bioparticelle su una superficie Poco costoso e facile

26 CAMPIONAMENTO PASSIVO DELL ARIA Passivo o deposizionale Deposizione per via gravitazionale delle bioparticelle su una superficie Poco costoso e facile da eseguire Campionamento non quantitativo Volume raccolto sconosciuto Particelle più grandi si depositano prima e in maggior numero rispetto alle piccole

CAMPIONAMENTO ATTIVO DELL ARIA Sistema a compressione Campionamento forzato di aria su una superficie solida o liquida mantenendo i microrganismi aerogeni vitali o fisicamente inalterati Metodo a

27 CAMPIONAMENTO ATTIVO DELL ARIA Sistema a compressione Campionamento forzato di aria su una superficie solida o liquida mantenendo i microrganismi aerogeni vitali o fisicamente inalterati Metodo a compressione Microrganismi superficie solida o semisolida L aria viene aspirata e convogliata, attraverso fori circolari o ugelli, direttamente Terreno agarizzato Agar-sangue, TSA, R2A Superficie adesiva

28 PBI International

29 per batteri

30 per funghi

31 CAMPIONAMENTO ATTIVO DELL ARIA Sistema per filtrazione Campionamento forzato di aria attraverso una membrana filtrante Efficienza di raccolta legata Alle dimensioni delle particelle Alle proprietà fisiche delle particelle Alle forze inerziali ed elettrostatiche Alle caratteristiche del campionatore Vengono raccolte le particelle più piccole del diametro dei pori del filtro

32 Membrane in gelatina Sartorius Diverse tipologie di filtri ma attenzione alla disidratazione del campione sul filtro

33 ACQUA

34 CAMPIONAMENTO DELL ACQUA Drinking water Ampio range di microrganismi Coliformi, E. coli, Campylobacter, virus Limite legato al bassissimo numero di organismi presenti nell acqua di bevanda Procedure microbiologiche basate su: Concentrazione/arricchimento del campione Isolamento microrganismi Quantificazione (UFC/mL)

35 CAMPIONAMENTO DELL ACQUA Necessità di un approccio multi-steps MICRORGANISMI METODI VIRUS BATTERI Concentrazione Adsorbimento/eluizione Filtrazione su membrana Identificazione/conta Colture cellulari/cpe/unità formanti placca Crescita su terreni selettivi/ufc

36 CAMPIONAMENTO DELL ACQUA CONCENTRAZIONE E IDENTIFICAZIONE BATTERI Filtri con diametro 47 mm e pori da 0.22 a 0.45 µm Semina su terreni solidi o liquidi Importante fare più repliche per ottenere una conta più probabile

38 CAMPIONAMENTO DELL ACQUA CONCENTRAZIONE E IDENTIFICAZIONE Uso di tecniche di pre-arricchimento e arricchimento per alcuni batteri

39 IN ITALIA Per l acqua di bevanda (in bottiglia) i parametri sono: Escherichia coli Enterococchi Pseudomonas aeruginosa Conta a 22 C Conta a 37 C 0/250 ml 0/250 ml 0/250 ml 100/mL 20/mL

42 CAMPIONAMENTO DELL ACQUA CONCENTRAZIONE E CONTA VIRUS Adsorbimento ed eluizione su filtro Uso di filtri in polisulfonato (0.02 µm) Presenza/assenza (TC) Tecnica delle placche

43 LIMITI DEI METODI MICROBIOLOGICI Metodi classici Sensibili ma indaginosi nella caratterizzazione dei microrganismi Legati al volume di campione Metodi molecolari Sensibili ed affidabili Non discriminano tra microrganismi vivi e morti Non permettono di valutare la patogenicità

44 STANDARDIZZAZIONE DEI METODI Metodi standardizzati disponibili International Organization of Standardization (ISO) European Committee for Standardisation (CEN) American Public Health Association (APHA) French Standard (NF) In continua revisione e aggiornamento

46 ISO

47 ISO

48 ISO

49 ISO

50 QUINDI OBIETTIVI STRUMENTI CAMPIONAMENTO SIGNIFICATIVO CONOSCENZA DELLA PROPRIA STRUTTURA

51 GRAZIE PER L ATTENZIONE

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