Introduzione. Colture cellulari in vitro: cellule isolate dal loro ambiente e messe in condizioni di vivere all'interno di un sistema definito

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1 Colture Cellulari

2 Introduzione Colture cellulari in vitro: cellule isolate dal loro ambiente e messe in condizioni di vivere all'interno di un sistema definito strumento fondamentale per studi biochimici, microbiologici, farmacologici utili nella produzione di fattori di crescita, anticorpi monoclonali, vaccini, proteine ricombinanti in generale

3 Introduzione 1951 messa in coltura della prima linea cellulare stabilizzata umana, di origine tumorale: la linea HeLa (dal nome della prima paziente). Conoscendo le caratteristiche delle colture è possibile apprezzarne i vantaggi offerti (ad esempio studi di tossicità sulla nostra specie, per la quale in vivo esistono evidenti problemi).

4 Colture cellulari Batteri Lieviti (eucarioti inferiori) Colture di cellule vegetali Colture primarie di cellule animali Linee cellulari In sospensione Adese

5 Cellule primarie animali: esempii Linfociti/timociti Macrofagi Cellule di embrione di pollo/ratto Cellule di fegato /cuore di embrione Fibroblasti

6 Vantaggi nelle colture cellulari Larga disponibilità di tipi di cellule Disponibilità commerciale di media, fattori, ecc. Documentazione su isolamento/conservazione Controllo delle variabili ambientali (T, ph..) Semplicità nel replicare esperimenti Possibilità di dimensionare gli esperimenti con finalità biotecnologiche Riduzione nel numero di animali uccisi

7 Svantaggi nelle colture cellulari Metodi molto specializzati e laboriosi Costo dei materiali richiesti (ad esempio, siero, fattori di crescita...) Sistemi semplificati rispetto ad un organismo integrato Difficoltà di correlare le concentrazioni in vitro con quelle in vivo

8 Tipi di colture cellulari Colture a breve/lungo termine: nel primo caso il numero di cicli cellulari cui vanno incontro le cellule è ridotto: in colture a lungo termine le cellule si dividono molte volte, o addirittura illimitatamente (linee cellulari stabilizzate.) Colture in monostrato/ in sospensione: generalmente le cellule tendono ad aderire alla superficie del recipiente di coltura: moltiplicandosi formano un monostrato, in quanto risentono dell inibizione da contatto. Cellule trasformate invece possono formare pluristrati. Colture clonali: le cellule vengono diluite prima della semina in modo da avere ogni cellula separata, che prolifera formando una singola colonia (clone).

9 Evoluzione di una linea cellulare in coltura Tra la semina e la ripresa della crescita c è un intervallo. Il grafico mostra l evoluzione del logaritmo del numero di cellule nel tempo. La coltura primaria è caratterizzata da un tempo di duplicazione lento, che aumenta notevolmente nei successivi passaggi in coltura, quando si parla di linea cellulare primaria. Nella terza fase si nota la senescenza, con tempi di duplicazione progressivamente più lunghi (sino alla morte), a meno che (porzione arancione) non intervenga una trasformazione, che produce una linea cellulare immortalizzata in grado di replicarsi indefinitamente.

10 Colture primarie Prelievo delle cellule da un campione (organo, embrioni o uova). dissezione meccanica. Trattamento con tripsina (o altro enzima) per eliminare i contatti tra cellule. Inibitore per bloccare la digestione enzimatica Controllo della vitalità cellulare (ad esempio trypan blue) Le colture cellulari possono essere seminate su terreno solido in piastra Petri oppure in sospensione.

11 Coltura primaria Le cellule derivano direttamente dal tessuto d origine, mantenendo molte caratteristiche funzionali riscontrabili in vivo. Durante la crescita avviene una selezione in base al grado di proliferazione: aumentano cellule attivamente proliferanti, restano stazionarie quelle in grado di sopravvivere ma non di duplicarsi, mentre altri tipi di cellule sono incapaci di resistere. Questo comporta un evoluzione nel tempo delle proporzioni dei diversi tipi cellulari, fino a giungere ad un equilibrio notevolmente diverso dalla situazione di partenza. Quando la proliferazione ha depauperato il mezzo di coltura, occorre provvedere ad una sub-coltura in un nuovo recipiente con terreno fresco

12 Linee cellulari Linee cellulari a vita finita Resistono in coltura un numero limitato di cicli cellulari; crescono in monostrato risentendo dell inibizione da contatto; fortemente dipendenti da fattori di crescita presenti nel siero. Linee cellulari continue (trasformate) hanno origine da mutazioni (spontanee o indotte con agenti chimici, fisici o biologici) a partire da colture primarie o da linee cellulari a vita finita; possono essere ottenute da tumori. Presentano minore dipendenza da fattori del siero e minore inibizione da contatto. Linee cellulari clonali sono linee cellulari derivanti da una singola cellula; servono per ottenere una popolazione il più possibile omogenea

13 Trasformazione di una linea cellulare Il processo della trasformazione rende immortale una linea cellulare. ll processo ha inizio con l acquisizione da parte della linea cellulare della capacità di proliferare indefinitamente (immortalizzazione); richiede un certo numero di mutazioni in geni diversi. Quando avviene (anche spontaneamente) in coltura, si osservano al microscopio dei foci di trasformazione, ovvero delle masserelle di cellule simili a quelle tumorali, che non risentono della inibizione da contatto.

14 Il laboratorio per le colture cellulari cappa incubatore centrifuga

15 Contaminazioni delle colture L ingresso indesiderato di microorganismi nel terreno di coltura è dannoso, in quanto questi competono con le cellule in coltura (che generalmente hanno ritmo di crescita inferiore) e possono secernere sostanze tossiche. Tipici contaminanti sono batteri, micoplasmi, lieviti, muffe. In caso di infezione batterica il terreno vira in fretta (acidifica) e intorbidisce. Le infezioni da micoplasmi sono più subdole, in quanto il microrganismo è meno visibile e richiede un paio di settimane per formare colonie visibili. Questo pericolo determina la prassi di aggiungere antibiotici al terreno (ad esempio: streptomicina-penicillina); va ricordato che sono stabili per pochi giorni a 37 C.

16 Sterilità Al fine di mantenere la sterilità per la coltura cellulare, il laboratorio di biologia cellulare deve essere esclusivo: occorre lavorare sotto cappe a flusso laminare, alle quali vanno sostituiti periodicamente i filtri. Per la sterilizzazione dei materiali: Stufa a secco, 150 C per 3 ore per la vetreria Autoclave (calore umido), 1 atm, 121 C per filtri, soluzioni saline Filtrazione con filtri da 0.22 μm terreni di coltura, soluzioni organiche Raggi γ materiali di plastica

17 Piastre di coltura Piastre Petri Fiasca con tappo ventilato Superficie: cm 2 Piastre multipozzetto (multiwell) (6-384 pozzetti)

18 Il mezzo extracellulare Fase gassosa, Temperatura, Substrato di adesione e terreno di coltura Le cellule di mammifero crescono a 37 C, sature di umidità, in un mezzo tamponato a ph ~7.3. Il sistema tampone più comunemente utilizzato è bicarbonato/acido carbonico Il ph viene monitorato aggiungendo un indicatore come il rosso fenolo (giallo a ph acido, rossoviola a ph alti).

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21 Composizione di un terreno per cellule animali Amminoacidi Vitamine Sali Glucosio Antibiotici Indicatore Siero

22 Terreni di coltura La composizione dei mezzi di coltura prevede: Sali inorganici (Na +, K +, Mg ++, Ca ++, Cl -,..) Glucosio, glutammina Aminoacidi essenziali Vitamine del gruppo B Tracce di Fe, Zn, Cu, Se, Mn, Mo (tracce significa che non occorre aggiungerli in quanto le minime contaminazioni presenti in altri componenti sono sufficienti). Siero fetale bovino, 5-20% o un sostituto

23 Il siero L uso del siero è controverso. Generalmente si preferisce il siero fetale in quanto contiene meno anticorpi. Vantaggi Protegge le membrane grazie al corretto grado di viscosità; Introduce fattori di crescita ed ormoni; Veicola lipidi, ferro e molecole organiche; Favorisce interazione cellule-substrato; Contiene inibitori della tripsina Svantaggi Possibile tossicità degli anticorpi; Variabilità da lotto a lotto; Inibitori metabolici; Fattori di crescita che favoriscono i fibroblasti rispetto ad altri tipi cellulari

24 Terreni definiti L uso di terreni privi di siero nasce al desiderio di avere condizioni controllate, riproducibili e specifiche per il tipo cellulare in esame. Devono contenere: un inibitore della tripsina, fattori di adesione, ormoni, fattori di crescita, nutrienti e proteine. Vantaggi Maggiore riproducibilità; Standardizzazione anche fra laboratori diversi; Può favorire subpopolazioni specifiche (non solo fibroblasti); Agevola la purificazione di un prodotto; Svantaggi Cellule più sensibili alle condizioni ambientali; Crescita più lenta; Alcuni additivi sono costosi e/o labili; I terreni sono specifici per un tipo cellulare;

25 La cappa

26 Campi d applicazione Esempi d indagine Ambito Controllo della crescita e del metabolismo, analisi del differenziamento. Ingegneria tissutale (coltura e produzione in vitro di porzioni di tessuto). Studio di promotori e enhancers, di espressione genica e di interi genomi. Analisi di mutanti. Mappaggio, trasfezione con DNA esogeno. Diagnosi cliniche (anche prenatali) Biologia cellulare Biologia molecolare Genetica Citogenetica Caratterizzazione di tumori. Oncologia Test di citotossicità. Farmacologia Produzione di proteine ricombinanti (ormoni ) e di anticorpi monoclonali. Immunologia