Ammine aromatiche ad azione cancerogena certa, probabile o possibile: valori di riferimento

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1 G Ital Med Lav Erg 2003; 25:1, PI-ME, Pavia 2003 I. Pavan, C. Baroffio, E. Buglione, V. Passini, E. Pira Ammine aromatiche ad azione cancerogena certa, probabile o possibile: valori di riferimento Dipartimento di Traumatologia Ortopedia e Medicina del Lavoro - Università di Torino Questo lavoro si propone di verificare i tenori attuali di alcune AA, nelle urine di soggetti professionalmente non esposti, e fornire indicazioni chimico-analitiche praticabili, al fine di definire un valore standard di riferimento per esposizioni professionali. Dall esame della bibliografia risulta che solo alcune delle AA tossicologicamente rilevanti sono state dosate su urine (Anilina, Benzidina, 2-Naftilamina, o-toluidina, Diclorobenzidina, 4-Cloro-o-Toluidina e 4-Cloroanilina) e che, per monitorare l esposizione ad AA cancerogene in operatori non esposti professionalmente, non è assolutamente significativo il dosaggio delle AA totali, in quanto legate a fattori di vita (dieta alimentare, farmaci o necessità estetiche quale la colorazione dei capelli). La necessità analitica di dosare le AA a concentrazioni pari od inferiori a 1 µg/l su urine richiede l impiego di metodi semplici, dotati di elevata sensibilità e specificità. In base all esame della bibliografia e alla nostra esperienza, il metodo proposto da Lichtenstein è quello che permette di raggiungere i risultati analitici più interessanti. Parole chiave: ammine aromatiche, urine, popolazione non esposta. ABSTRACT. - The aim of this work is to determine the amount of some aromatic amines in urine of nonexposed people in order to define a reference value. The literature examination has showed that only a small numbers of aromatic amines are usually determined in urine namely: aniline, benzidine, 2-naphtilamine, o-toluidine, 3,3 - dichlorobenzidine, 4-chloro-o-toluidine and 4-chlorobenzidine. On the basis of our experience the analytical method proposed by Lichtenstein is appropriate for obtaining reliable analytical results. Key words: aromatic amines, urine, no-exposed people. 1. Introduzione Appartengono alle ammine aromatiche (aa) i prodotti derivanti dall ammoniaca di cui almeno un atomo di idrogeno è sostituito da un radicale aromatico (es. Benzene, Naftalene, Difenile). Si tratta quindi di una vastissima famiglia di composti il cui capostipite è rappresentato dall anilina. Le ammine aromatiche si dividono in aa primarie, secondarie, terziarie in base al numero di atomi di idrogeno che sono sostituiti sul radicale -NH 2. Dal punto di vista chimico-fisico le aa sono caratterizzate da una elevata reattività con conseguente capacità di formare molecole complesse, da proprietà catalizzanti ed ossidanti, caratteristiche sfruttate in campo industriale soprattutto nei settori della produzione di coloranti ed isocianati, dell industria della gomma, delle materie plastiche, della petrolchimica, della farmaceutica e dei laboratori chimici. Nella valutazione della tossicità sull uomo è importante considerare il fatto che molecole strutturalmente molto simili presentano, sia dal punto di vista sperimentale sia epidemiologico, caratteristiche molto differenti anche per l attività oncogena per cui, al momento, solo tre aa primarie appartengono al gruppo 1 secondo la classificazione IARC (International Agency Research of Cancer) (1) (4- Aminodifenile, Benzidina, 2-Naftilamina) per la loro provata azione sul tratto urinario nella specie umana. Il differente grado di volatilità e di liposolubilità è in grado di influenzare l assorbimento per via inalatoria e gastroenterica e conferisce alle diverse aa la capacità di penetrare anche attraverso la cute integra. L esposizione a tali composti avviene prevalentemente in ambito professionale. L esposizione di natura non professionale può avvenire per la loro presenza in alcune matrici ambientali (cibo, acqua, suolo, cosmetici, medicinali). Rilevante, inoltre, è l apporto dovuto al fumo di sigaretta (1 sigaretta contiene una quantità di anilina tra 50.6 e 577ng pari a 1-10 µg per pacchetto di sigarette): ne deriva quindi che in un fumatore medio l escrezione urinaria di anilina dovrebbe essere compresa tra 0.4 e 4 µg/l (2). Lo scopo di questo lavoro è verificare quali sono attualmente i tenori di alcune aa nelle urine di soggetti professionalmente non esposti e fornire indicazioni chimico-

2 G Ital Med Lav Erg 2003; 25:1 69 analitiche praticabili per verificare le concentrazioni di tali ammine in questo substrato biologico anche al fine di definire un valore standard di riferimento per esposizioni professionali. 2. Aspetti Normativi e Legislativi Nella Tabella I sono riportate le aa oggetto di questa revisione, classificate secondo le indicazioni della IARC. La produzione e l utilizzo di aa sono regolamentati nel nostro Paese dalle seguenti norme: DPR 303/56, CM 46/79, CM 61/81, Dlgs 77/92, Dlgs 626/94 allegato n 8. In base alla CM n. 46/79 le aa sono suddivise in 3 gruppi a loro volta suddivisi in serie: Gruppo 1: aa che hanno dimostrato attività cancerogena Serie 1: accertata capacità di aumentare significativamente nell uomo il rischio di cancerogenesi Serie 2: evidenza di cancerogenicità in più specie di mammiferi Tabella I. Ammine Aromatiche Gruppo CAS Peso Molecolare 4-Aminodifenile Benzidina Naftilamina Cloro-o-toluidina 2A ,4 -Metilen-bis 2A (2 cloroanilina) 4-Aminoazobenzolo 2B Aminoazotoluolo 2B Cloroanilina 2B diaminoanisolo 2B ,4 -Diaminodifenilmetano 2B ,3 -Diclorobenzidina 2B ,3 -Dimetossibenzidina 2B ,3 -Dimetilbenzidina 2B ,3 -Dimetil-4,4-2B Diaminodifenilmetano p-cresidina 2B ,4 -Ossidianilina 2B ,4 -Tioanilina 2B o-toluidina 2B ,4-Toluilendiamina 2B ,4,5-Trimetilanilina Anilina note: gruppo 1: agenti carcinogeni per l uomo; gruppo 2A: agenti probabili carcinogeni per l uomo; gruppo 2B: agenti possibili carcinogeni per l uomo; gruppo 3: agenti non classificabili come carcinogeni per l uomo; gruppo 4: agenti probabili non carcinogeni per l uomo. Serie 3: evidenza di cancerogenicità su una sola specie di mammiferi Gruppo 2: aa in cui è stata testata la cancerogenicità con i seguenti risultati: Serie 1: sostanze dimostratesi cancerogene in una sola specie animale d esperimento Serie 2: sostanze testate, ma con risultati non chiaramente valutabili Gruppo 3: aa rimanenti non elencate negli altri gruppi Attualmente sono vietate la produzione e l utilizzo delle seguenti aa: 2-Naftilamina e suoi sali, 4-Aminodifenile e suoi sali, Benzidina e suoi sali, 4-Nitrodifenile, fatta eccezione il caso in cui siano presenti in concentrazione inferiore allo 0.1% in peso. L utilizzo di tali aa, a fini sperimentali, è comunque possibile in seguito ad autorizzazione in deroga rilasciata dal Ministero del Lavoro con validità di tre anni; tale autorizzazione dovrà essere richiesta anche nel caso in cui tali aa compaiano come prodotti intermedi o siano presenti in concentrazione superiore allo 0.1% (Dlgs 77/92). La concentrazione non potrà in alcun caso superare l 1% in peso per le altre aa appartenenti al gruppo 1 e 2 serie 1 ed il 5% in peso per le aa di gruppo 2 serie 2 e gruppo 3 (CM 61/81). 3. Esame della Letteratura È stata analizzata la letteratura relativa all ultimo ventennio, selezionando i lavori più significativi. Da questa analisi risulta che tra le aa di rilevante importanza tossicologica solo alcune sono state dosate su urine di soggetti esposti o non esposti professionalmente e precisamente: Anilina, Benzidina, 2-Naftilamina, o-toluidina, 3-3 -Diclorobenzidina, 4-Cloro-o-Toluidina e 4-Cloroanilina (Tab. II e III) (4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12). Per comodità di lettura le Tabelle II e III riportano in sintesi i risultati raccolti. L esame della bibliografia fa emergere che per monitorare l esposizione ad aa cancerogene in operatori non esposti professionalmente, non è assolutamente significativo il dosaggio delle aa totali in quanto queste ultime sono legate a fattori di vita (dieta alimentare, farmaci o necessità estetiche quale la colorazione dei capelli). Nei soggetti non professionalmente esposti emergerebbe una correlazione significativa tra concentrazione urinaria di questi metaboliti e fumo (Tab. II) (4, 5, 6, 7, 8), mentre tale associazione nei soggetti professionalmente esposti non viene chiaramente evidenziata (Tab. III) (4, 5, 7, 9, 10, 11, 12). Inoltre, a nostro parere, una possibile fonte esogena di esposizione ad aa sarebbe rappresentata dall assorbimento di coloranti azoici (coloranti tessili, tinture per capelli, coloranti in genere a base amminica, etc.) (Tab. IV) (12, 13, 14, 15, 16, 17); tali composti potrebbero contenere infatti una piccola concentrazione di aa sotto forma di impurezza, che potrebbe essere assorbita ritrovandosi successivamente in tracce nelle urine (7, 14).

3 70 G Ital Med Lav Erg 2003; 25:1 Ammina aromatica Autore Anno Tabella II. Non esposti professionalmente Concent. Concent. Urinaria Concent. Urinaria Metodo Urinaria (µg/l) fumatori (µg/l) non fumatori (µg/l) analitico min medio max min medio max Anilina Riffelmann GC-ECD 4-Cloroanilina o-toluidina Cloro-o-Toluidina Naftilamina Benzidina Anilina Teass HPLC o-toluidina 2.7 Anilina * Bayoumy GC/MS o-toluidina * Diclorobenzidina Hatfield GC/MS Ammine Aromatiche Armeli Spettrofotometria totali (p.s.1024) (p.s.1024) (p.s.1024) (p.s.1024) (p.s.1024) (p.s.1024) * I risultati forniti dall autore in mg/24h sono stati corretti basandosi su una diuresi media di 1.5 L Ammina aromatica Autore Anno Tabella III. Esposti professionalmente Concent. Concent. Urinaria Concent. Urinaria Metodo Urinaria (µg/l) fumatori (µg/l) non fumatori (µg/l) analitico min medio max min medio max Anilina Riffelmann GC-ECD 4-Cloroanilina o-toluidina Cloro-o-Toluidina Naftilamina Benzidina Anilina Teass HPLC o-toluidina 104 Benzidina Meal GC-MS dopo (nmoli/mmoli x idrolisi acida Creat) delle urine Anilina Pozzoli GC (inizio turno) (fine turno) 3-3 Diclorobenzidina Hatfield GC/MS Benzidina Dewan HPLC 3-3 Diclorobenzidina Pavan < GC-MS Altri autori, invece, sostengono che i coloranti azoici, una volta introdotti nell organismo, possono liberare, mediante un processo di azoriduzione, aa potenzialmente cancerogene. A tale proposito studi sperimentali su animale hanno dimostrato che i coloranti azoderivati possono essere metabolizzati a livello intestinale ad opera dell attività enzimatica della flora batterica ed a livello epatico ad opera del sistema enzimatico azoriduttasi (13, 15, 17). Tale biotrasformazione può avvenire anche a livello cutaneo in quanto su di essa sono presenti batteri con attività enzimatica azoriducente (11). Esempi di tale reazione relativi a coloranti azoici con formazione di diclorobenzidina possono essere (12): PIGMENT YELLOW DICLOROBENZIDINA + 2 (P- ACETACETOTOLUIDINE) PIGMENT ORANGE DICLOROBENZIDINA + 2 (3-METIL-1-P-TOLIL-5-PIRROLONE)

4 G Ital Med Lav Erg 2003; 25:1 71 Tabella IV. Autore Anno Analisi colorante (impurità) Organismo Ammina Concent. Limite di Metodo aromatica Urinaria (µg/l) detezione analitico Gregory 1984 Benzidina (3 mg/kg) Hamsters Benzidina Aminodifenile (6 mg/kg) monoacetilbenzidina Diaminoazobenzene (670 mg/kg) Diacetilbenzidina 21 4-Aminodifenile 9.9 Benzidina idrossilata Aminodifenile 5.1 idrossilato Mondino Diclorobenzidina Topi 3-3 Diclorobenzidina µg TLC Conigli Scimmie Kennelly 1982 Benzidine (80 mg/kg) Topi Benzidina * 13.3 HPLC o-dianisidine (0.5 mg/kg) Hofmann 1993 Non effettuata Topi 3-3 -Diclorobenzidina 0 5 µg/l GC Cerniglia 1982 Non effettuata Batteri Benzidina Prove in vitro GC/MS 3-3-Dimetilbenzidina 3-3-Dimetoxibenzidina Pavan 3-3 -Diclorobenzidina (2-103 mg/kg) Uomini 3-3 -Diclorobenzidina < µg/l GC/MS * I risultati forniti dall autore in mg/24h sono stati corretti basandosi su una diuresi media di 1.5 L Qualora questa ipotesi fosse confermata nella specie umana, potrebbero sorgere problematiche nella valutazione del rischio e nella sorveglianza sanitaria dei soggetti professionalmente esposti, in quanto molte aa tra cui la stessa 3-3 -Diclorobenzidina sono etichettate come R45 (agenti cancerogeni), ma da un punto di vista strettamente normativo la presenza di impurezze nel colorante azoico a concentrazione infeiore allo 0.1% non richiede la neccessità di etichettare come carcinogeno il colorante stesso. 4. Esame dei metodi analitici La necessità analitica di dosare le aa a concentrazioni pari od inferiori a 1 µg/l su urine richiede l impiego di metodi che consentano di avere contemporaneamente elevata sensibilità e specificità, con la possibilità di una facile preparazione del campione. L esame della bibliografia in argomento e le esperienze da noi condotte hanno evidenziato che il metodo proposto da Lichtenstein et al. (3) è quello che, nel caso delle aa considerate, permette di raggiungere interessanti risultati analitici. Il metodo descritto nelle sue fasi essenziali da noi parzialmente modificato (18) è il seguente: Preparazione del campione: 10 ml di urina, raccolta al termine del turno lavorativo, viene basificata con 0.5 ml di NaOH e saturata con NaCl. L urina viene estratta con 2 ml di etilacetato. L estrazione viene ripetuta due volte. Gli estratti vengono riuniti, il tutto viene portato a secco sotto flusso d azoto. Il campione viene ripreso con 0.5 ml di toluene e trasferito in Vials da 2 ml in cui viene eseguita la reazione di derivatizzazione mediante 25 µl di anidride eptafluorobutirrica (HFBA). Le aa reagiscono con l HFBA secondo la reazione: NH 2 -Ar-NH 2 + 2(C 3 CO) 2 O -> C 3 CONH-Ar-NH- COC 3 + 2C 3 COOH Tale reazione avviene in Vials chiusi ermeticamente ed incubati in stufa a 80 per 30 minuti. I Vials vengono poi trasferiti su campionatore automatico, ed 1 µl viene iniettato in un sistema GC/MS equipaggiato per l analisi in frammentografia ionica monitorando lo ione dell aa ricercata. L analisi viene completata in 45 minuti circa. Nella Tabella V viene riportato, per le aa considerate, il frammento ionico di interesse analitico per ogni singola ammina (3). Condizioni strumentali: Per l analisi delle urine è stata preparata una curva di taratura addizionando urina liofilizzata precedentemente testata con aliquote di 2, 5, 20, 50 µg/l di ammina; tali standard sono stati trattati ed estratti come le urine dei soggetti esposti. Tabella V. Ammina Tempo di Frammento Aromatica Ritenzione (min) Ionico m/z Anilina Benzidina Naftilamina o-toluidina Diclorobenzidina Cloro-o-Toluidina Cloroanilina

5 72 G Ital Med Lav Erg 2003; 25:1 Sulle urine è stata scelta l estrazione liquido-liquido anziché l estrazione solido-liquido con cartucce SPE, in quanto da prove preliminari si è visto che il recupero era del 95% con la prima tecnica e del 70% con la seconda. La sensibilità analitica è pari a 0.01 µg/l. 5. Discussione Ad eccezione dei soggetti esposti professionalmente ad aa e dei casi di esposizione accidentale o voluttuaria, la presenza di alcune aa nelle urine di soggetti non esposti potrebbe derivare da due condizioni: 1. presenza di aa come impurezza originaria in alcune matrici ambientali (19, 20); 2. possibile formazione di aa durante un processo metabolico di azoriduzione di un colorante ingerito od assorbito attraverso la cute (11, 12, 13, 15, 17). Dall analisi dei dati presenti in letteratura si evidenzia che nei soggetti non professionalmente esposti l apporto di aa deriva in massima parte dall esposizione al fumo di sigaretta, anche se alcuni autori (21) sostengono che una possibile fonte sia anche i fumi derivanti da motori diesel. L ipotesi dell azoriduzione, a nostro parere, sarebbe improbabile o andrebbe per lo meno approfondita con ulteriori indagini in quanto in alcuni dei lavori da noi esaminati non viene considerata la presenza di aa come impurezza iniziale nel colorante (13, 14, 15, 16, 17). Questi risultati potrebbero avere un importante significato nei soggetti professionalmente esposti in quanto, dal punto di vista strettamente normativo, la presenza di impurezze nel colorante azoico a concentrazione inferiore allo 0.1% non rende necessaria l applicazione dei dispositivi di legge per la prevenzione del rischio da agenti cancerogeni. Persiste attualmente la problematica di discriminare nei soggetti professionalmente esposti l origine certa dell aa presente nelle urine (esposizione professionale o abitudini di vita). Dall esame della letteratura e dall analisi dei nostri dati risulta che solo sette aa (Anilina, Benzidina, 4-Cloroanilina, O-Toluidina, 4-Cloro-O-Toluidina, 2-Naftilamina e 3-3 -Diclorobenzidina) sono state ritrovate nelle urine di soggetti non professionalmente esposti, la cui presenza è da attribuirsi ad abitudini voluttuarie quali principalmente il fumo. Sarebbe pertanto opportuno effettuare uno screening su un maggior numero di soggetti non professionalmente esposti (fumatori e non fumatori) al fine di ottenere la concentrazione media su urine di tali aa. Questi dati, associati a quelli da noi riscontrati in letteratura, potrebbero essere successivamente utilizzati nel definire un valore limite di riferimento in soggetti professionalmente esposti. Per tutta una serie di aa, riportate in Tabella VI, l analisi della letteratura ed alcune prove da noi condotte su soggetti non esposti professionalmente consentono, allo stato attuale, di affermare che non vi è presenza, a livello urinario, di tracce di tali aa. Bibliografia Tabella VI. Ammine Aromatiche senza riscontro urinario 4-Aminodifenile 4,4 -Metilen-bis (2 cloranilina) 4-Aminoazobenzolo 2-Aminoazotoluolo 2-4-diaminoanisolo 4,4 -Diaminodifenilmetano 3,3 -Dimetoxibenzidina 3,3 -Dimetilbenzidina 3,3 -Dimetil-4,4 -Diaminodifenilmetano p-cresidina 4,4 -Oxidianilina 4,4 -Tiodianilina 2,4-Toluilendiamina 2,4,5-Trimetilanilina 1) International Agency Research of Cancer (IARC). 2) Pavan I, Buglione E, Colombi A, Cottica D, Della Vedova L, Larsen B, Micoli G, Mosconi G, Passini V. Aspetti metodologici e concettuali nella definizione di valori di riferimento di ammine aromatiche in fluidi biologici. Ed. Morgan. 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