Regolamento REACH BPL Prospettive e Progetti ArpaER Bologna, 20 giugno Quadro delle competenze del Laboratorio Tematico Mutagenesi Ambientale

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1 Regolamento REACH BPL Prospettive e Progetti ArpaER Bologna, 20 giugno 2011

2 sommario 1 Il di Arpa Emilia Romagna. SOMMARIO 2 Test di genotossicità utilizzati. 3 Collaborazione a progetti. 4 Divulgazione dati. 5 Centro di Saggio Cometa, certificazione BPL.

3 Il Laboratorio Tematico mutagenesi ambientale di Arpa Emilia Rimagna Il di Arpa Emilia Romagna ècomposto da: Responsabile: Biologo Dirigente Personale di Comparto: 2 Biologi 1 Chimico 2 Periti Chimici 1 Assistente Tecnico

4 Il Laboratorio Tematico mutagenesi ambientale di Arpa Emilia Rimagna Il di Arpa Emilia Romagna, opera nel campo della Mutagenesi ambientale dal 1991, collaborando con Università, Istituti di ricerca, Comuni, Province ed Enti di Sanità Pubblica e fornendo prestazioni anche a soggetti privati. Le attività principali del laboratorio riguardano la ricerca di sostanze genotossiche nelle matrici ambientali: acqua, aria e suolo. A tal fine vengono effettuati test di genotossicità, cioè test che evidenziano danni, a diversi livelli, del materiale genetico arrecati da sostanze che possono agire sia singolarmente che in miscela.

5 Test utilizzati I test utilizzati sono stati scelti, fra quelli più impiegati in letteratura nella valutazione della genotossicità di xenobiotici e nel monitoraggio ambientale, per la loro complementarietà nella risposta e quindi nella ricerca di sostanze con differente azione sul DNA: Test di reversione batterica in Salmonella (Test di Ames: metodo tradizionale di incorporazione in piastra e test di Ames di nuova generazione: Ames II); Test dei Micronuclei in linfociti umani coltivati in vitro; Test della Cometa (Comet assay) in leucociti umani in vitro e in biomonitoraggio su esposti.

6 Test di reversione su batteri Il saggio di retromutazione su batteri utilizza ceppi di Salmonella typhimurium mutati geneticamente mediante mutazioni puntiformi (sostituzione, addizione o delezione di una o più paia di basi del DNA), in modo da non essere più in grado di crescere senza un aminoacido essenziale (istidina). Il principio su cui è basato il saggio èla capacità di rivelare, nei ceppi sperimentali, le mutazioni indotte dalle sostanze testate, che ripristinano la capacità funzionale dei batteri di sintetizzare l'istidina e quindi di crescere in sua assenza. Aggiungendo un complesso enzimatico alle piastre, è possibile identificare le sostanze che diventano mutagene dopo attivazione metabolica esogena (promutageni). L Ames II è una versione aggiornata dell Ames classico effettuato in micropiastra, in terreno liquido, necessita di quantitativi inferiori di campione e permette di testare un numero più elevato di campioni in minor tempo.

7 Test dellacometa(comet Assay) Il test della Cometa in cellule umane èun test di rapida esecuzione per la visualizzazione diretta del danno precoce al DNA di natura pre mutagena, quindi ancora riparabile, visualizzato in ogni singola cellula. DNA da singola cellula, integro e a diversi livelli di danno, visualizzato al termine del test (immagine elaborata con software Comet assay IV, Perceptive Instruments,UK) Attraverso una tecnica elettroforetica si rilevano rotture a doppio e singolo filamento del DNA e siti alcalo labili (addotti, siti apurinici e apirimidinici, ossidazioni delle basi azotate, etc.). Durante l elettroforesi, i frammenti rilassati e/o rotti migrano in maniera differenziale verso l anodo così che, dopo colorazione, l immagine che ne risulta ha l aspetto di una cometa.

8 Test dei Micronuclei Il test dei Micronuclei in linfociti umani mette in evidenza sostanze che inducono la rottura (sostanze clastogene) e/o la perdita (sostanze aneugeniche) di cromosomi, portando alla formazione nel citoplasma, al termine di una divisione cellulare, di piccoli corpi extranucleari, di dimensioni inferiori rispetto al nucleo, detti micronuclei (MN). Micronucleo in una cellula binucleata, dopo la divisione nucleare e prima della divisione citoplasmatica (Citodieresi o Citochinesi). Questo èun tipo di danno fissato e l aumento della frequenza di Micronuclei è ritenuto indicatore di aumentato rischio di cancro.

9 Collaborazioni a progetti Progetto Supersito: Realizzazione di uno studio integrato dell inquinamento dell atmosfera nella Regione Emilia Romagna che prevede tecniche innovative di indagini chimiche, fisiche, tossicologiche, utili in particolare per gli aspetti di valutazione sanitaria, epidemiologica e interpretazione di fenomeni ambientali. Progetto regionale pluriennale, coordinato da Arpa con la collaborazione di Istituti Universitari e Centri di ricerca italiani ed europei (2010 ). Progetto Moniter: Organizzazione di un sistema di sorveglianza ambientale e valutazione epidemiologica nelle aree circostanti gli impianti di incenerimento in Emilia Romagna. Progetto regionale pluriennale coordinato dalla Regione Emilia Romagna in collaborazione con Arpa, ASL, Istituti Universitari e Centri di ricerca (2008 ). Monitoraggio della genotossicità di risorse idropotabili: Progetto in collaborazione con l Università di Parma su commissione del Consorzio dei Gestori del Servizio Idrico della Provincia di Parma ( ). Progetto PolveRE: Caratterizzazione chimico fisica del particolato atmosferico nelle classi dimensionali tra 10 e 0,4 μm. Progetto regionale coordinato da Arpa Emilia Romagna in collaborazione con l Università di Bologna ( ). Controllo dell impatto ambientale derivante dall incenerimento di rsu mediante la valutazione della genotossicita di matrici di processo e di suoli circostanti il forno inceneritore di Parma: Progetto pluriennale in collaborazione con l Università di Parma ( ).

10 Divulgazione dei dati Nell ambito delle attività del Laboratorio Tematico èdi rilevanza la gestione della Rete Regionale di monitoraggio della genotossicità del Particolato Atmosferico urbano. La rete esiste dal 1997 attualmente è costituita da 5 nodi e il monitoraggio riguarda il PM 2,5. I dati relativi alla mutagenicità del particolato atmosferico urbano campionato nei nodi della rete regionale vengono divulgati tramite report annuali e sul sito web del Laboratorio Tematico Mutagenesi Ambientale : dove sono pubblicati non solo gli ultimi dati rilevati, ma anche tutte le serie storiche degli anni precedenti.

11 Centro di Saggio Cometa, certificazione BPL; certificazione BPL All interno del Laboratorio Tematico, èin via di sviluppo il Centro di Saggio Cometa che opererà nell ambito dell applicazione delle prove di laboratorio previste nel Regolamento REACH, in conformità ai principi delle BPL (DL 50/2007). Il test che verrà portato in certificazione nel 2012 è il test B13/14, dell Allegato B del regolamento CE 440/2008: Mutagenicità Test di reversione sui batteri che utilizza ceppi di S. typhimurium e di E. coli. In particolare si tratta di un metodo in micropiastra con preincubazione di nuova generazione rispetto a quanto descritto da Maron and Ames nel 1983 (Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, Mutation Res.). Si utilizza un Kit (Produttore: Xenometrix) : AMES MPF TM Penta I (Microplate Format Mutagenicity Assay). Il metodo previsto e i ceppi inclusi in questo kit incontrano le richieste delle linee guida OECD 471/1997 per testare sostanze chimiche. (inserire Laboratorio nome Tematico struttura Mutagenesi /nodo) Ambientale Sezione Provinciale di Parma

12 Centro di Saggio Cometa, certificazione BPL Il saggio di retromutazione su batteri previsto nel regolamento CE 440/2008, in linea di principio èdel tutto analogo a quello utilizzato nel nostro Laboratorio per le indagini ambientali. La principale differenza è l'utilizzo di una vasta batteria di ceppi batterici, ognuno in grado di rilevare un particolare tipo di mutazione puntiforme e quindi sostanze con diversa attività mutagena. Questo saggio è comunemente impiegato come prima tappa per individuare l'azione genotossica. Numerosi dati dimostrano che molte sostanze chimiche che risultano positive a questo saggio presentano attività mutagena anche in altri test. (inserire Laboratorio nome Tematico struttura Mutagenesi /nodo) Ambientale Sezione Provinciale di Parma

13 Centro di Saggio Cometa, certificazione BPL Si utilizzano sei ceppi di batteri, quattro ceppi di S. typhimurium la cui affidabilità è provata e che forniscono risposte riproducibili. Per identificare alcuni mutageni quali: ossidanti, agenti che provocano crosslinking e idrazine che non vengono identificati da Salmonella, si utilizza una miscela di due ceppi di E. coli. La combinazione di ceppi utilizzata è pertanto: S. typhimurium TA1535 S. typhimurium TA1537 S. typhimurium TA98 S. typhimurium TA100 E. coli WP2 uvra e E. coli WP2 (pkm101). (inserire Laboratorio nome Tematico struttura Mutagenesi /nodo) Ambientale Sezione Provinciale di Parma

14 Ceppo Mutazione Tipo Target Parete cellulare S. typhimurium Genotipo dei ceppi di Salmonella typhimurium e di E.coli Sistema di riparo pkm101 TA98 hisd3052 Scivolamento di lettura GCGCGCGC rfa uvrb sì TA100 his G46 Sost. basi GGG rfa uvrb sì TA1535 his G46 Sost. basi GGG rfa uvrb no TA1537 his C3076 Scivolamento di lettura E.coli +1 scivol. lettura,vicino a CCC rfa uvrb no uvra trp E65 Sost. basi A:T uvra no pkm101 trp E65 Sost. basi A:T sì rfa: uvrb/uvra: pkm101: Questa mutazione rende difettoso lo strato di lipopolisaccaride (LPS) che ricopre la superficie delle cellule, rendendo i batteri più permeabili a grosse molecole. La mutazione delezione uvrb/uvra elimina un sistema di riparo molto accurato: il riparo per excisione, facendo sì che molte lesioni vengano riparate da altri sistemi di riparo più facili all errore. Questo plasmide, con fattore R di resistenza all ampicillina, aumenta le probabilità di mutazione dovute a sostanze chimiche o a raggi UV, mediante un sistema di riparo per ricombinazione, facile all errore. (inserire Laboratorio nome Tematico struttura Mutagenesi /nodo) Ambientale Sezione Provinciale di Parma

15 Centro di Saggio Cometa ; certificazione BPL Questo test di nuova generazione presenta diversi vantaggi rispetto al test di Ames classico: più veloce; ceppi batterici controllati e con caratteristiche certe (mantenute nel tempo, senza deriva delle caratteristiche peculiari); colorimetrico (più chiara interpretazione); in formato piastra microtiter (meno laborioso, più facile e pratico); necessita di una minore quantità di sostanza da testare (3 volte meno del sistema tradizionale); tutto l occorrente è già pronto all uso ed è fornito nel kit (più controllo e omogeneità dei terreni e dei reagenti); richiede il 50% in meno di fegato di ratto (S9) rispetto al sistema tradizionale. (inserire Laboratorio nome Tematico struttura Mutagenesi /nodo) Ambientale Sezione Provinciale di Parma

16 Centro di Saggio Cometa ; certificazione BPL Successivamente si porterà in certificazione il Test della Cometa (Comet Assay) su cellule umane. E un test rapido e ampiamente utilizzato sia per la valutazione della genotossicità di sostanze singole che di matrici ambientali. Questo test è attualmente utilizzato nel Laboratorio Tematico, applicato soprattutto a matrici ambientali. E stato anche utilizzato in uno studio di biomonitoraggio su individui esposti a sorgenti inquinanti. Come il test di reversione batterica è stato utilizzato anche nella valutazione della genotossicità di alcuni composti di origine industriale.

17 Grazie per l attenzione!