RADIOBIOLOGIA CELLULE, RADIAZIONI E STUDI DEGLI EFFETTI BIOLOGICI INDOTTI DALLE RADIAZIONI IONIZZANTI

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Tito Rocchi
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1 RADIOBIOLOGIA CELLULE, RADIAZIONI E STUDI DEGLI EFFETTI BIOLOGICI INDOTTI DALLE RADIAZIONI IONIZZANTI Maria Pachera Andrea Reffo Eugenio Saletta Kawarpreet Singh Tutor: R. Cherubini, V. De Nadal LNL 26 giugno 2015

2 Cos è la radiobiologia? Radiobiologia: studio degli effetti e dell azione delle radiazioni sui sistemi biologici Scopo: Individuazione dei parametri bio-fisici caratterizzanti l azione delle radiazioni sulla materia vivente Studio degli effetti biologici delle radiazioni a livello cellulare, tissutale o animale Implicazioni: Radioprotezione Radioterapia

3 Tipi di Radiazione Radiazioni ionizzanti Radiazioni non ionizzanti

4 Radiazioni ionizzanti Direttamente ionizzanti Indirettamente ionizzanti Sparsamente Ionizzanti Densamente Ionizzanti

5 Interazione radiazione - cellula Le radiazioni possono avere con la cellula due tipi di azione: diretta indiretta azione indiretta azione diretta

6 Grandezze Radiobiologiche Dose assorbita[gy]: quantità di energia assorbita da un mezzo per unità di massa D (Gy) = de/dm J/Kg LET (Linear Energy Transfer): l energia ceduta da una radiazione lungo il proprio percorso al mezzo attraversato per unità di percorso stesso LET= ΔE/Δx kev/µm

7 Efficacia Biologica Relativa (RBE) R.B.E.: rapporto tra la dose della radiazione di riferimento e la dose della radiazione in esame necessarie per indurre lo stesso effetto. Dipende da fattori chimici, fisici e biologici R.B.E.=(DRX/Dr) SF=SF0

8 Parte Sperimentale Irraggiamento con raggi γ di cellule V79 con sorgente di Cobalto-60 Irraggiamento con protoni di cellule V79 con acceleratore di particelle Tramite Comet Assay: analisi dei danni al DNA in cellule V79 irraggiate con raggi γ.

9 Irraggiamento con γ Scopo: valutare la sopravvivenza di cellule sottoposte a radiazioni γ Strumenti: sorgente di Cobalto 60 (Co-60) fiaschette materiale di laboratorio HAMSTER CINESE

Cobalto-60: isotopo radioattivo del Co Modello: GB-150-Gammabeam panoramic (Nordion,Canada) Attività (15/06/2015): 7.6 TBq Energia γ: 1.17 MeV e 1.33 MeV T 1/2 : 5.

10 Cobalto-60: isotopo radioattivo del Co Modello: GB-150-Gammabeam panoramic (Nordion,Canada) Attività (15/06/2015): 7.6 TBq Energia γ: 1.17 MeV e 1.33 MeV T 1/2 : 5.27 anni Simbolo: Co (A=60; Z=27) Rateo di dose: 1Gy/min; 19.6 cm Il Co-60 per motivi di sicurezza è contenuto in un cilindro di piombo abbastanza spesso da non far passare i raggi γ.

Raggi Gamma Fotoni provenienti dal nucleo dell atomo che ha perso energia Forma di radiazione elettromagnetica ad alta energia Per essere fermati devono trovarsi davanti almeno 10 cm di Pb La

12 Raggi Gamma Fotoni provenienti dal nucleo dell atomo che ha perso energia Forma di radiazione elettromagnetica ad alta energia Per essere fermati devono trovarsi davanti almeno 10 cm di Pb La radiazione gamma interagisce e ionizza la materia a seconda della sua energia tramite: effetto fotoelettrico, scattering Compton e produzione di coppie. Non viene provocata né trasmutazione né fissione.

Procedimento Far crescere cellule V79 in terreno di coltura Irraggiare fiaschette a 1 Gy/min, per diverso tempo a seconda della dose scelta Trasferire cellule in

13 Procedimento Far crescere cellule V79 in terreno di coltura Irraggiare fiaschette a 1 Gy/min, per diverso tempo a seconda della dose scelta Trasferire cellule in piastre petri Dopo 5 gg di incubazione, lavare con violetto di genziana per fissare e colorare le colonie Conteggio e raccolta dati per disegnare grafico dose-risposta

14 DATI RACCOLTI DOSE (Gy) Petri1 Petri2 Petri3 Petri4 Petri5 Semina Media % SF* Controllo ,2 89, ,6 81, ,4 70, ,2 51, ,2 45, ,5 28,1 * %SF= survival fraction

15 Curva di Sopravvivenza Raggi

16 Irraggiamento con protoni Scopo: valutare la sopravvivenza delle cellule (V79) sottoposte ad un fascio di protoni accelerato Strumenti: Acceleratore CN (Van de Graaff di 7 MeV) Linea di fascio di radiobiologia Petri in acciaio Materiale da laboratorio Petri in acciaio

17 Linea di fascio di radiobiologia

18 CALCOLO DELLA DOSE F = φ Ф φ = (fluenza in aria) / (n particelle 1 monitor) Ф = n particelle 1 monitor -9-2 D[Gy]=1.6 x 10 LET[keV/µm] F [cm ] LET= 28.5 kev/µm

19 Saggio clonogenico Seminare le V79 in fiaschette Dopo alcuni giorni di duplicazione, trasferirle e farle aderire al foglio di mylar all interno dei campioni Irraggiare i campioni con fascio di protoni con 3 MeV di energia fornito dall acceleratore CN sulla linea di fascio di radiobiologia Staccare le cellule dai campioni, e seminarle a numero definito in piastre Petri Fissare, colorare e contare le colonie formatesi dopo 5 giorni per disegnare la curva di sopravvivenza

20 DATI RACCOLTI DOSE (Gy) Petri1 Petri2 Petri3 Petri4 Petri5 Semina Media % SF* Controllo * %SF= survival fraction

21 Curva di sopravvivenza H + 3 MeV

22 SF Curve di Sopravvivenza e RBE RBE (SF 60%)= Dγ /D protoni = 1.98/0.81 = 2.44 RBE (SF 90%)= Dγ /D protoni = 0.44/0.16 = Raggi 0.1 H + 3 MeV Dose (Gy)

23 Comet Assay Scopo: valutare il danno al DNA di cellule sottoposte a radiazioni γ Strumenti: sorgente di Cobalto 60 (Co-60) fiaschette e vetrini cella elettroforetica materiale di laboratorio microscopio a fluorescenza

24 Comet Assay Tecnica per rilevare i danni al DNA su singole cellule eucariotiche Vantaggi: versatile sensibile veloce Tipi di danno rilevati: singole o doppie rotture siti alcalo-labili DNA cross-link

25 Danni da Radiazioni

Protocollo del saggio Cellulle sospese in gel di agarosio a 37 C Trasferire la sospensione su un vetrino con superficie di gel di agarosio solido Porre in

26 Protocollo del saggio Cellulle sospese in gel di agarosio a 37 C Trasferire la sospensione su un vetrino con superficie di gel di agarosio solido Porre in soluzione di lisi Porre in soluzione alcalina a ph 13 Sottoporre il DNA a corsa elettro-foretica (20 min., 25 V) Colorare il DNA con colorante fluorescente

27 coda Controllo 0 Gy nucleoide 3 Gy 1 Gy

28 FINE

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