METABOLISMO DI BASI AZOTATE E NUCLEOTIDI

Transcript

1 METABOLISMO DI BASI AZOTATE E NUCLEOTIDI Le basi azotate si dividono in purine e pirimidine. Le purine sono l adenina e la guanina. La xantina e la ipoxantina sono considerati due intermedi della sintesi dell adenina e guanina. Le pirimidine sono invece l uracile, la citosina e la timina. I nucleosidi sono costituita dalle basi azotate legate a uno zucchero, il ribosio. Purinici Pirimidinici 112

2 I nucleotidi sono molecole costitute invece da una base azotata, uno zucchero (il ribosio o il desossiribosio) e i gruppi fosfati (massimo 3). NUCLEOTIDI La biosintesi dei nucleotidi può procedere attraverso due processi che avvengono nel citoplasma: 1. Sintesi de novo: combinando insieme i vari precursori si sintetizza l intero nucleotide. I precursori nella sintesi de novo sono la CO 2, l NH 3, gli amminoacidi glicina (essenziale per la sintesi delle purine), aspartato (essenziale per la sintesi delle pirimidine), glutammina (partecipa a entrambe le vie metaboliche donando il gruppo ammidico); il ribosio 5- fosfato derivante dalla via dei pentosi. Il ribosio 5-fosfato deve essere attivato nel composto 5-fosforibosil-1-pirofosfato (PRPP). Questa reazione reazione è catalizzata dalla PRPP sintetasi e il pirofosfato è donato da una molecola di ATP. La disponibilità di questo composto e del fosfato inorganico determina la velocità della sintesi dei vari nucleotidi. Gli inibitori competitivi di questa via metabolica sono l ADP e il 2,3-bisfosfoglicerato che competono per ATP e ribosio 5-fosfato. ciclo dei pentosi PRPP sintetasi I livelli di PRPP sono bassi in cellule confluenti quando non si dividono e aumentano rapidamente all entrata nel ciclo cellulare. Questo enzima può essere mutato e causare la malattia di von Gierke (deficit di glucosio 6- fosfato fosfatasi; aumento della PRPP, aumento della purine; iperuricemia e acidosi lattica). 2. Vie di salvataggio: riciclano le basi azotate e i nucleotidi che sono resi disponibili dal catabolismo degli acidi nucleici. Il 5-fosforibosil-1-pirofosfato 113

3 Sintesi de novo delle purine La sintesi de novo delle purine include dieci reazioni che portano alla sintesi di nucleotidi monofosfato, AMP e GMP. Si parte dal ribosio attivato (PPRP) e sono aggiunti sullo zucchero tutti i gruppi che formeranno l anello delle purine. Una volta formato l anello si ottiene l inosinato (IMP), dal quale verranno sintetizzati successivamente AMP e GMP. Buchanan ha identifato l origine di tutti gli atomi che compongono l anello aromatico. La glicina fornisce la maggior parte di atomi. 8/61 1. Commiting step: il ribosio amminato è indirizzato alla sintesi delle purine tramite la glutammina- PRPP amidotransferasi. È il principale sito di regolazione della sintesi de novo. L amminazione avviene sul carbonio anomerico dello zucchero con rimozione del pirofosfato. Si ottiene una 5-fosfo-β-D -ribosilammina. 114

4 2. Entra la glicina attraverso la GAR sintetasi (enzima trifunzionale) e si forma il glicinammide ribonucleotide (GAR). Viene consumata ATP e inserita la glicina. (trifunctional protein) 3. Viene aggiunto un terzo carbonio sotto forma di formile ceduto dal tetraidrofolato tramite la GAR transformilasi e si ottiene la formilglinamide ribonucleotide (FGAR). protein) (trifunctional protein) 4. Interviene ora una ammidotransferasi che inserisce il gruppo ammidico, preso dalla glutammina entrante, sul gruppo carbossilico della glicina del FGAR. Si è formata la formilglicinamidine ribonucleotide (FGAM). (trifunctional protein) 115

5 5. Avviene la ciclizzazione: si chiude il primo anello, l imidazolo. Si forma il 5-aminoimidazolo ribonucleotide (AIR). 6. Sull AIR avviene una carbossilazione, ovvero viene inserito un gruppo carbossilico fornito dall anidride carbonica. Il composto ottenuto è un imidazolo con gruppo carbossilico e amminico, il carbossiamino-imidazolo ribonucleotide (CAIR). 7. Entra in gioco l aspartato che dona il gruppo amminico. Le reazioni che avvengono sono uguali a quelle avvenute nel ciclo dell urea. Su questo composto si inserisce l aspartato per intero. Il gruppo amminico dell aspartato reagisce con il gruppo carbossilico appena inserito. Si forma il N Succinil-5-amonoimidasolo-4-carbossamide ribonucleotide (SAICAR). 116

6 8. Lo scheletro carbonioso dell aspartato viene rimosso da una liasi ed esce come fumarato. Si ottiene il composto 5-aminoimidazole-4-carboammide ribonucleotide (AICAR). 9. Viene inserito un ultimo C sotto forma di formile donato dall N 10 formile tetraidrofolato. Si è formato il N-formiaminoimidazolo-4-carbossamide ribonucleotide. 10. Il secondo anello si ciclizza e si forma l inosinato (IMP). Viene sintetizzato il primo nucleotide purinico come nucleotide monofosfato. 117

7 L inositato è il precursore della sintesi di AMP e GMP attraverso due reazioni. Dall inositato si ha una biforcazione. Sintesi di AMP Bisogna sostituire il chetone dell IMP con un ammina. L azoto per l ammina viene donato dall aspartato con lo stesso meccanismo del ciclo dell urea. 1. L enzima adenilosuccinato sintetasi lega l aspartato al carbonio chetonico dell IMP e si forma l adenilosuccinato. Questa reazione richiede energia. Il nucleotide trifosfato usato è il GTP. 2. L enzima adenilato liasi rimuove lo scheletro carbonioso dell aspartato che esce come fumarato. Si produce così adenilato (AMP). Sintesi di GMP Il guanilato contiene un gruppo ammidico. 1. Viene introdotto un gruppo chetonico per formare il nucleotide xantilato (XMP). Si impiega NAD + per ossidare, che diventa NADH, e H 2 O per ottenere il gruppo chetonico. 2. Il chetone viene dunque sostituito da una ammina. Il donatore di questo gruppo ammidico è la glutammina. La reazione è catalizzata dalla xantilato-glutammina amidotransferasi. È richiesta energia tramite l ATP. Si produce così il guanilato (GMP). Regolazione della sintesi delle purine Questa via metabolica viene regolata da una regolazione allosterica retroattiva sequenziale perché si ha prima la sintesi di un intermedio comune, IMP, e poi la sintesi di AMP e GMP (i veri nucleotidi finali). È importante che la disponibilità di nucleotidi sia bilanciata. L AMP o il GMP inibisce la sua stessa sintesi quando la sua quantità è sufficiente. Contemporaneamente questi due nucleotidi inibiscono la glutammina PRPP ammidotransferasi che porta alla sintesi di IMP. L IMP inibisce a sua volta la glutammina PRPP ammidotransferasi. Per bloccare completamente l enzima sono necessari tutti i composti (GMP, AMP e IMP), se è presente solo IMP l enzima rallenta solamente. 118

8 L AMP per diventare un nucleotide da inserire nel DNA o RNA deve essere fosforilato. Il primo passaggio è la sua fosforilazione da AMP a ADP. La produzione di grandi quantità di ADP inibisce la sintesi di ribosio 5-fosfato. L ADP segnala l adeguata quantità di purine a disposizione. Sintesi de novo delle pirimidine Per la loro sintesi prima vien costruita la base azotata che ha una struttura molto più semplice delle purine. L aspartato costituisce più della metà dell anello fornendo gli atomi , l azoto è fornito dalla glutammina e l altro atomo di carbonio da HCO 3. Una volta sintetizzato è coniugato con PRPP. I prodotti ottenuti sono nucleotidi trifosfato. Verrà sintetizzata una prima base azotata intermedia che sarà poi modificata. 1. La carbamilfosfato sintetasi II (CPS II) catalizza la reazione che produce carbamilfosfato a partire dalla glutammina. La CPS II è un isoforma presente nel citosol delle cellule. Essa non sa usare ione ammonio libero, ma glutammina che cede il gruppo ammidico alla CO 2. Questo enzima è inibito da UTP e attivato da ATP. Sono quindi inseriti i primi due atomi di carbonio che faranno parte dell anello delle basi pirimidiniche. 119

9 2. Viene inserito l aspartato sul carbamilfosfato tramite l enzima aspartato transcarbamoilasi. Si ottiene il N-carbamoilaspartato. 3. L anello si ciclizza tramite l enzima didroorotasi. Si forma il legame fra gruppo amminico e carbossilico e si chiude l anello. Si forma così il L-diidroorato. 4. Viene inserita l insaturazione tramite una diidrorato deidrogenasi che trasforma un legame singolo in un legame doppio usando il NAD per produrre NADH. Si ottiene orato o acido orotico. 5. La base azotata viene coniugata con il PRPP e si ottiene il nucleotide monofosfato orotidilato. 120

10 6. Da qua si parte per la sintesi di uridilato (UMP) e citidina (CTP). Si tratta di una sintesi sequenziale. L orotidilato subisce una decarbossilazione e viene convertito in uridilato. 7. Interviene una chinasi che fosforila sequenzialmente l UMP prima a UDP e poi UTP ottenendo l uridina 5 -trisfosfato. 8. La citidilato sintetasi ammina l anello, partendo da glutammina, e si ottiene il composto citidina 5 -trifosfato (CTP). Il CTP va a inibire l aspartato transcarbamilasi, tramite meccanismo retrogrado. 121

11 Regolazione della sintesi delle pirimidine È una regolazione allosterica a feedback negativo e positivo: gli enzimi regolati sono la carbamilsintetasi II e la OMP decarbossilasi. I modulatori allosterici sono l uridilato nelle sue forme fosforilate: l UMP funziona con feedback negativo sulla OMP decarbossilasi. UDP e UTP inibiscono la CPSII. L ATP e il 5 fosforibosil-1-pirofosfato invece promuove la sintesi. Sintesi dei nucleotidi trifosfati Sia le purine che le pirimidine devo essere trasformate nella forma difosfata. Le pirimidine devono essere convertite alla forma trifosforilata. Nella cellula esistono due chinasi: la nucleoside monofosfato chinasi base-specifica e la nucleoside difosfato chinasi. La prima, consumando ATP, trasforma le purine monofosfato nella corrispondete forma difosfata. La seconda invece fosforila il prodotto del primo enzima, consumando ATP, per produrre i nucleotidici trifosfati che la cellula può usare per sintetizzare i vari RNA. Sono enzimi reversibili. 122

12 Sintesi de novo dei deossiribonucleotidi Si parte dai corrispondenti ribonucleotidi ed esiste un enzima, la ribonucleotide reduttasi, che catalizza la loro sintesi. Viene ridotto ed eliminato il gruppo -OH per dare i deossiribonucleotidi. Questo enzima utilizza nucleotidi difosfati. Si ottiene il deossiribonucleotidi in forma difosfato. L enzima contiene due tioli liberi che si ossidano e diventano ponti disolfuro permettendo la catalisi. Affinché la proteina possa riprendere il suo ciclo è necessario che il ponte disofluro ritorni alla forma ridotta: gli equivalenti riducenti provengono dal NADPH e viene liberata acqua. Esistono due sistemi tramite i quali l enzima nucleotide reduttasi agisce: uno impiega la tioredossina, l altro la glutaredossina. Sistema tioredossina: l enzima fornisce gli equivalenti riducenti, ossidandosi a ponte disolfuro. Per ridurre il ponte disolfuro gli equivalenti riducenti sono forniti dalla tioredossina, che si ossida a sua volta con il ponte disolfuro. A questo punto è necessario ridurre la tioredossina, associata alla tioredossina reduttasi, che contiene un FAD covalentemente legato (che può essere nella forma ossidata o ridotta). La tioredossina reduttasi funzionante contiene FADH 2, che si ossida a FAD per ridurre la tioredossina. Il FAD deve essere ridotto nuovamente per ricominciare il ciclo: gli equivalenti riducenti sono forniti dal NADPH. Sistema glutaredossina: funziona con lo stesso meccanismo dell altro sistema. Il NADPH riduce il glutatione, che a sua volta riduce la glutaredossina che riduce la ribonucleotide reduttasi. 123

13 La ribonucleotide reduttasi è un unico enzima che può usare come substrati tutti i 4 ribonucleotidi in forma difosfato. È costituita da due dimeri R1 e R2. Il sito attivo si crea quando l enzima è assemblato correttamente ed è creato dalla struttura quaternaria, in esso sporgono le due cisteine, che si ridurranno ed ossideranno per la catalisi, e il residuo HX. Il residuo HX è un identità non identificata fondamentale nella catalisi. È presente anche una tirosina che lega il cofattore binucleare ferrico nella sua forma radicalica. nucleare izza il silico Meccanismo catalitico della ribonucleotide reduttasi Il residuo di tirosina radicalico nel sito attivo è stabilizzato dal ferro e può interagire con il residuo HX e trasferire il radicale sull amminoacido X. Si rigenera la tirosina generando il radicale X nel sito attivo attraverso una reazione catalitica. A questo punto entra il NDP, il radicale X reagisce con il carbonio 3 dello zucchero, rimuovendone un idrogeno e generando un radicale sul carbonio. La catalisi passa a carico dei due tioli e uno dei due tioli protona il gruppo ossidrilico in posizione 2, generando un solfuro. Il gruppo ossidrilico protonato viene liberato come acqua e si genera un catione sul carbonio 2. Questo carbocatione e questo solfuro si riorganizzano: il solfuro mette in compartecipazione il doppietto elettronico con lo zolfo e il carbocatione recupera lo ioduro dalla cisteina; si forma quindi un ponte disolfuro e avviene la protonazione del carbonio 2. Il radicale in 3 recupera l idrogeno, rigenerando il radicale X nel sito attivo. È completato il deossiribonucleotide difosfato che esce dal sito attivo. L enzima deve quindi essere rigenerato attraverso le reazioni precedentemente descritte tramite il trasferimento di elettroni (si rigenerano i due tioli liberi nel sito attivo). L enzima può così continuare i due cicli di riduzione. 124

14 125

15 Gli altri siti ne permettono la regolazione dell enzima: 1. Allosterica: controlla la velocità di riduzione dei ribonucleotidi. I modulatori sono l ATP e il deossiatp che si legano nel sito di regolazione primaria nella subunità R1. 2. Il sito di regolazione per la specificità di substrato: a seconda del nucleotide legato, l enzima scegli il substrato da ridurre. Il datp con un meccanismo a feedback negativo inibisce l attività dell enzima, mentre l ATP attiva l enzima. Questa regolazione avviene con meccanismo particolare: l enzima funzionante è un tetramero α2β2 e il suo stato attivo si trova in equilibrio tra lo stato dissociato e lo stato ad anello. I fattori che determinano lo spostamento dell equilibrio (lo stato dissociato o lo stato attivo) sono le concentrazioni proteiche: a basse concentrazioni prevale lo stato dissociato, a concentrazioni elevate prevale la forma attiva. Ad elevate concentrazioni di deossiatp i dimeri si organizzano in una struttura ad anello, a concentrazioni basse di deossiatp e alte di ATP cambia forma e passa allo stato più attivo e può catalizzare la riduzione. Quando l enzima ha la struttura ad anello, il sito attivo non è presente. Quando si ha la struttura ad anello, le subunità α e β si trovano nella stessa localizzazione, interagiscono le une con le altre. ATP dntp alte [datp] basse [datp] alte [ATP] Regolazione della ribonucleotide reduttasi I siti di specificità del substrato agiscono attraverso il seguente meccanismo: i substrati che entrano (CDP, UDP, GDP, ADP) vengono convertiti grazie all enzima nei corrispondenti deossiribonucleotidi difosfati (deossicdp, deossiudp, deossigdp, deossiadp). I ribonucleotidi difosfati devono essere fosforilati per formare dctp, dttp, dgtp, datp. Il dudp subisce un meccanismo diverso perché l uracile prima deve essere trasformato in timina per poi diventare dttp. I modulatori allosterici sono i nucleotidi trifosfato. Il dttp è sia modulatore allosterico positivo, in quanto attiva la riduzione di dgdp, che negativo in quanto inibisce la riduzione del CDP e dell UDP. Il dgtp così prodotto va a stimolare la riduzione a datp. Il datp stimola positivamente la sintesi delle deossipirimidine. La scelta del ribonucleotide da ridurre dipende dalla concentrazione dei deossiribonucleotidi dell altra classe presenti (purinici o pirimidinici). 126

16 Sintesi di timidilato (dtmp) Il deossitimidilato può essere ottenuto a partire da dctp e dutp. Il dctp viene convertito a dutp, che viene convertito dal dutpasi a dump, substrato della timidato sintasi che lo converte in dtmp. Se il timidilato non è sufficiente le cellule possono inserire dump invece di dtmp nel DNA creando delle alterazioni. È essenziale che ci sia il timidilato. Esiste un altra via che utilizza il CDP per la sintesi del timidilato: il dctp può essere deaminato e convertito in dutp, utilizzato per la sintesi di timidilato. Quindi la sintesi dipende dalla concentrazione di nucleotidi sia purinici che pirimidinici. La timidilato sintasi metila la base azotata del dump per convertirlo in dtmp: il donatore del gruppo metilico è una forma di tetraidrofolato, che trasferisce un atomo di idrogeno. Il tetraidrofolato cambia lo stato di ossidazione: passa da N 5, N 10 -metilene-tetraidrofolato a 7,8-diidrofolato. È necessario ridurre nuovamente il diidrofolato, grazie alla diidrofolato reduttasi che consuma NADPH. A questo punto il tetraidrofolato deve essere ricaricato del gruppo metilenico che deve trasportare, che è quello che proviene dalla catena laterale della serina. Il secondo enzima che serve si chiama, infatti, serina idrossimetil-transferasi; la serina viene convertita in glicina. Questa sintesi richiede un adeguata quantità di purine e pirimidine, così come una grande quantità di folati. Meccanismo d azione di timidilato sintasi 127

17 CATABOLISMO DELLE BASI PURINICHE Si parte dalle forme monofosfato dei nucleotidi purinici e si ottiene acido urico. 1. La prima reazione è la separazione tra lo zucchero e la base. Partendo da GMP il primo enzima che agisce è una 5 -nucleotidasi che rimuove la guanosina e il fosfato inorganico; il secondo enzima è una nucleosidasi che rimuove lo zucchero dal nucleoside. Per la degradazione dell AMP. La 5 nucleosidasi rimuove il fosfato (è una fosfatasi); l adenosina deaminasi ha come substrato l adenosina ottenuta e libera il gruppo amminico come ione ammonio: si ottiene l inosina. Sull inosina agisce la nucleosidasi che rimuove il ribosio e la basa azotata (ipoxantina). 2. Le due basi ottenute (guanina e ipoxantina) sono convertite in xantina. La guanina è deaminata dall enzima guanina deaminasi, che genera xantina liberando ammoniaca. L ipoxantina è substrato della xantina ossidasi; ossidasi che utilizza ossigeno e lo inserisce sull anello aromatico; il restante ossigeno esce come acqua ossigenata. Sono necessari sistemi per eliminare l ammoniaca (usata dalla glutammina sintetasi) e l acqua ossigenata (catalasi o glutatione reduttasi). 3. La xantina è nuovamente substrato della xantina ossidasi (contenente molipteno e 14 centri ferro-zolfo), che inserisce un nuovo ossigeno ottenendo acido urico. Xantina ossidasi: Enzima dimerico FAD Mo 4 centri Fe-S 128

18 Vie di recupero per la sintesi di nucleotidi purinici Circa il 90% delle purine sono recuperate e riutilizzate. PRPP + base à nucleotide. L enzima ipoxantina-guanina fosforibosiltransferasi (HGPRT) regola il riciclaggio di ipoxantina e guanina. Se l enzima è mutato non avviene il riciclo di ipoxantina e guanina, che vengono degradati. L acido urico si forma nella forma chetonica e nella forma enolica. È una molecola poco solubile in una soluzione acquosa (massima solubilità 7mg/100 ml) e presente in sali solidi, che quando precipitano si depositano preferenzialmente nelle articolazioni (infiammazione per cui le articolazioni si gonfiano, gotta). La gotta si genera in condizioni di iperuceremia: questa è attribuita a un errore congenito nel metabolismo, oppure a malattie renali per cui si riduce la clearance, ad alcuni tumori, all alterazione dell HGPRT, della glucosio -6P fosfatasi e a un aumentata sintesi di PRPP. La sindrome di Lesch-Nyhan è una disfunzione ereditaria recessiva legata al cromosoma X associata a una mancanza quasi totale della HGPRT. In questi casi di carenze enzimatiche l organismo risponde utilizzando molte riserve energetiche per la sintesi de novo di basi azotate. La gotta viene curata dal farmaco allopurinolo: è un inibitore competitivo della xantina ossidasi, che quindi non utilizza ipoxantina. Conseguentemente la xantina e l ipoxantina si accumulano, ma sono più solubili dell acido urico e quindi non si accumulano. L allopurinolo forma una forma idrossilata eliminata con le urine. L acido urico ha un ruolo nell eliminazione dei radicali liberi. La mancanza di adenosina deaminasi induce l insorgenza di immunodeficienza combinata grave, che comporta una disfunzione ai linfociti T, accumulo di datp a livello dei globuli rossi e quindi in circolo. 129