Prof. C. Mazzoni. Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie Agro- Industriali Università di Roma La Sapienza. Appunti della lezione 15 Capitolo 12

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1 MICROBIOLOGIA GENERALE Prof. C. Mazzoni Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie Agro- Industriali Università di Roma La Sapienza Appunti della lezione 15 Capitolo 12 1

2 Genetica del lievito S. cerevisiae Paragrafo 12.6 Il lievito è un organismo eucariotico unicellulare che appartiene al Regno dei Funghi, divisione degli Ascomiceti. Può riprodursi per via asessuale, tramite gemmazione, sia per via sessuale. La riproduzione sessuale avviene tramite fusione di due cellule aploidi di sesso opposto, denominate "a" ed "α", il cui riconoscimento è mediato da fattori proteici (feromoni) denominati mating factors. Le cellule di lievito presentano sulla loro superficie recettori per il mating factor di tipo opposto. Il legame del feromone a questi recettori provoca il blocco del ciclo cellulare e l instaurarsi di una forma di differenziamento che produce cellule a forma di pera denominate shmoos. La parte apicale dello shmoo è il punto in cui si fonderanno le due cellule di sesso opposto. Dopo la plasmogamia avviene la cariogamia e la formazione di uno zigote che dà origine a cellule diploidi, le quali possono, a loro volta, riprodursi per gemmazione o, in condizioni di carenza nutritiva, andare incontro a sporulazione. La cellula diploide che effettua la sporulazione va incontro a meiosi e origina un asco che contiene quattro spore aploidi. Quando l asco è maturo la sua parete lisa e vengono rilasciate le quattro spore aploidi, due di tipo α e due di tipo a. La maggior parte dei lieviti presenti in natura sono OMOTALLICI. In questi ceppi il sesso non è stabile, ma passano rapidamente dal sesso α al sesso a e viceversa. Questa interconversione avviene circa una divisione cellulare sì e una no e quindi molto più rapidamente di quanto ci si potrebbe aspettare da un meccanismo che coinvolga mutazioni spontanee convenzionali. L omotallia fornisce un vantaggio evolutivo in quanto promuove una diploidizzazione precoce dei discendenti, quindi una eventuale mutazione si esprimerebbe in condizioni di diploidia; inoltre, i cambiamenti di sesso che portano alla diploidizzazione hanno il vantaggio di condurre ad una più rapida sporulazione in risposta a circostanza ambientali sfavorevoli. I ceppi utilizzati in laboratorio sono invece ETEROTALLICI. In questi ceppi il sesso è stabile (non si osserva un cambiamento (switching) del mating type nelle colture), e consentono di seguire con facilità i marcatori genetici. Questi ceppi sono mutati nel gene HO, che codifica per un endonucleasi. Determinazione e switch del mating type Le cellule α e le cellule a esprimono rispettivamente i caratteri α e a che sono presenti nei rispettivi loci MAT. Nel cromosoma sono presenti due due serbatoi, uno per i geni α (HML) e l altro per i geni a (HMR). HML e HMR si trovano rispettivamente a sinistra e a destra del locus MAT. Nella diap. 8 è rappresentato il modello della cassetta per i cambiamenti di tipo coniugativo. Un lievito che presenti nel locus MAT i geni caratteristici del tipo α viene indicato come MATα. Nel momento in cui si ha la sostituzione della cassetta (locus) α con la cassetta a, nel locus MAT saranno presenti i geni caratteristici del tipo a e la cellula avrà 2

3 cambiato tipo coniugativo da MATα a MATa. Se analizziamo più in dettaglio i loci MAT, HML e HMR si possono osservare ai lati delle sequenze codificanti, delle regioni di omologia denominate W, X, Y e Z (diap. 9). Le regioni X e Z sono comuni a tutti i loci, mentre le regioni Y sono tipiche per ogni tipo coniugativo. I geni presenti nei loci HML e HMR sono silenziati delle proteine SIR che, tramite modificazioni degli istoni, determinano una struttura della cromatina inaccessibile ai fattori di trascrizione e fanno in modo che soltanto i geni del locus MAT siano espressi (diap. 10). L endonucleasi codificata dal gene HO genera un taglio del doppio filamento di DNA nel locus MAT immediatamente a monte della regione di omologia Z, dando inizio al processo di switch del mating type (diap. 12). In seguito a questo taglio, la regione del locus MAT (Y) viene degradata; Per sostituire il segmento mancante (Y), le due estremità di DNA libere, poste all estremità Z del taglio effettuato da HO, invadono la regione di omologia del gene HM appropriato insieme alle estremità libere (X) generate dalla degradazione del segmento Y (diap. 13). La replicazione del DNA alle estremità delle doppie eliche che risultano dall invasione, copia il frammenti Y del locus HM; in questo modo, il locus MAT acquisisce la specificità genetica del locus HM invaso. A questo stadio, i due loci interconnessi sono uniti da due regioni di scambio di filamenti che devono essere risolte con successivi tagli a singolo filamento (diap. 14). Le modalità con cui i filamenti vengono tagliati sono simili a quelle della ricombinazione generale. I tagli devono essere eseguiti in modo da non avere uno scambio di marcatori fiancheggianti, che porterebbero ad un cromosoma difettivo. I siti riconosciuti da HO sono presenti anche su HML e HMR (diap. 15). Le proteine dei geni SIR, oltre ad impedire la trascrizione di tali loci, impediscono che il taglio avvenga in questi siti. Vista l importanza della proteina codificata dal gene HO per iniziare lo switch del mating type, appare chiaro il motivo per cui i ceppi mutanti di questo gene sono eterotallici (non cambiano mai sesso). Lo switch è regolato in modo tale che solo la cellula madre può fare lo switch e non la cellula figlia. Infatti, solo cellule che sono già andate incontro ad una divisione cellulare esprimono il gene HO. Inoltre, Il fatto che entrambe le cellule figlie cambiano sesso insieme indica che la traslocazione della cassetta avviene PRIMA della sintesi del DNA (diap. 17). I due loci silenti HM competono l uno con l altro come donatori dell informazione genetica che entrerà nel locus MAT contenente la rottura. Il locus MATα si associerà preferenzialmente con il locus HMR (a) mentre il locus MATa si associerà preferenzialmente con il locus HML (α) Prodotti genici dei loci MAT Quando nel locus MAT è presente Yα vengono sintetizzate le proteine α1 e α2. La proteina α1 determina l induzione dei geni α-specifici, mentre la proteina α2 reprime la trascrizione dei geni a-specifici. Il locus MATa codifica per la proteina a1. In queste cellule i geni α-specifici non sono espressi in quanto manca l induttore α1, mentre i geni a-specifici sono espressi in virtù dell assenza del repressore α2 (diap. 20). Nelle cellule aploidi di entrambe i tipi coniugativi, i geni tipici del diploide (geni α/a) sono repressi dalla proteina RME1. 3

4 Nelle cellule diploidi, vengono espressi solo i geni α/a. Infatti, la proteina α2 reprime la trascrizione dei geni a- specifici e, associata con a1, reprime il gene α1 in modo che non vengano espressi i geni α-specifici. Inoltre, il dimero α2/a1 reprime anche la trascrizione dei geni HO e RME1, consentendo così l espressione dei geni α/a specifici (diap. 20). Si può notare come il prodotto del gene a1 sia importante soprattutto nel diploide, mentre non ha alcuna funzione nell aploide. Analisi dei prodotti della ricombinazione meiotica: analisi delle tetradi Quando le cellule diploidi di lievito vanno incontro a sporulazione, le 4 spore si trovano tutte contenute in un asco. Gli aschi possono essere isolati e le quattro spore studiate. L analisi dei prodotti della ricombinazione meiotica consente di stabilire l associazione tra due marcatori e la loro distanza. Se due marcatori assortiscono indipendentemente ci si aspetta di trovare un rapporto di 1:1 tra tetradi P (parentali) e NPD (Ditipo non parentale). Se i due marcatori sono associati, si dovrà analizzare il numero delle tetradi parentali, non parentali e tetratipo. Si può così stabilire la loro distanza sul cromosoma. Le tetradi di tipo parentale (PD) si formano quando i cromatidi parentali vengono trasmessi integri ai prodotti della meiosi (diap. 23). Le tetradi tetratipo (T) si formeranno ogni volta che si verifica un singolo scambio tra i loci dei geni in esame in due dei quattro cromatidi di un bivalente (diap. 24). Le tetradi di tipo non parentale (NPD) contengono quattro prodotti ricombinanti e risultano dal verificarsi simultaneo di due scambi nell intervallo dei geni in esame che coinvolgano tutti equattro i cromatidi (doppio scambio a quattro filamenti, diap. 25). Se due geni sono vicini sul cromosoma, si presuppone che tali scambi doppi avvengano meno frequentemente degli scambi singoli. Sulla base del numero di tetradi P, T e NPD si può calcolare la percentuale di ricombinazione con la seguente formula % ricombinazione = T+6NPD/ P+T+NPD La percentuale di ricombinazione fornisce la distanza in unità di mappa. Per S. cerevisiae, 1 unità di mappa corrisponde a circa 3/5 kb. Genetica mitocondriale Il lievito S. cerevisiae è l organismo ideale per studiare difetti della funzione mitocondriale che sono alla base di molte malattie genetiche. Il vantaggio del lievito risiede nel fatto che esso è un anaerobio facoltativo. In questo microrganismo pertanto, le mutazioni che determinano una deficienza nelle funzioni respiratorie sono evidentemente delle mutazioni condizionali: non impediscono la crescita quando viene usata una fonte di carbonio fermentabile (es.:glucosio), ma limitano la crescita se il substrato è solo respirabile (es.: etanolo o glicerolo). Alla fine degli anni 40, Ephrussi ed i suoi collaboratori osservarono che quando le cellule di lievito venivano piastrate in condizioni in presenza di glucosio, tra le normali colonie, definite grande, potevano comparire colonie più piccole, definite petite. Le cellule delle colonie petite non erano capaci di utilizzare substrati respirabili e quindi la funzione mitocondriale era danneggiata. La frequenza con la quale insorgono le petite è molto alta (circa 10-3 ) e può essere ulteriormente indotta da mutageni quali il bromuro d etidio. 4

5 Alcune petite (pet) sono portatrici di mutazioni a carico di geni nucleari coinvolti con la funzione mitocondriale e mostrano un eredità mendeliana classica 2:2 (diap. 28). Altre petite (rho - ) recano mutazioni a carico del DNA mitocondriale e mostrano una segregazione 4:0 tipica dell eredità citoplasmatica (diap 29). Infatti, quando i mutanti rho - vengono incrociati con i ceppi selvatici, questi donano mitocondri sani che si fondono con quelli mutati. Seguono eventi di fissione e fusione dei mitocondri che durante la divisione cellulare si distribuiscono casualmente e possono supplire ai difetti del mutante. In questo caso la progenie sarà tutta selvatica e la petite viene definita neutrale. Un esempio di petite neutrale sono le rho, che mancano completamente di DNA mitocondriale. Nelle petite soppressive invece, il diploide derivato da un incrocio con una cellula selvatica esprime la mutazione e tutte le spore derivanti da tale diploide saranno petite. Molto spesso le mutazioni petite soppressive presentano delle delezioni nel DNA mitocondriale. 5