Prof. C. Mazzoni. Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie Agro- Industriali Università di Roma La Sapienza. Appunti della lezione 6

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1 MICROBIOLOGIA GENERALE Prof. C. Mazzoni Corso di Laurea Triennale in Biotecnologie Agro- Industriali Università di Roma La Sapienza Appunti della lezione 6

2 I microrganismi eucariotici La struttura della cellula eucariotica e il nucleo Paragrafo 12.1 e Diap. 2 Confronto tra le cellule procariotiche e quelle eucariotiche Diap. 3 Ad una maggiore complessità degli eucarioti, corrisponde un aumento del numero di geni e della quantità di DNA. Il lievito, un organismo unicellulare eucariotico, contiene solo un terzo di geni in più di E. coli (Diap. 4). Tra i microrganismi eucariotici troviamo funghi, alghe e protozoi (Diap. 5). I funghi e le alghe possono essere unicellulari o pluricellulari, mentre i protozoi sono sempre unicellulari. I funghi e i protozoi sono chemioeterotrofi, ovvero utilizzano composti organici del carbonio per l accrescimento e come fonte di energia; le alghe sono invece fototrofe, ovvero possono usare l anidride carbonica come fonte di carbonio per l accrescimento e la luce come fonte di energia (vedi anche appunti e diap. 5 della lezione 10). In questo corso ci occuperemo solo dello studio dei funghi in quanto tra di loro sono presenti microrganismi di interesse biotecnologico. I funghi infatti, oltre ad essere fonte di malattie per gli animali e di contaminazione delle derrate alimentari (Diap. 6), sono utilizzati in molti processi industriali per la produzione di antibiotici ed acidi organici (Diap. 7). Questi ultimi hanno molteplici applicazioni che vanno dal campo alimentare ai prodotti farmaceutici, etc I funghi I funghi sono organismi eucariotici chemioorganotrofi; la maggior parte sono aerobi. Da un punto di vista fisiologico sono molto versatili e possono tollerare condizioni ambientali estreme (alte e basse temperature, alte concentrazioni di zuccheri, ph acidi). La maggior parte dei funghi sono pluricellulari filamentosi, ma vi sono funghi unicellulari (lieviti) e funghi che alternano la forma filamentosa a quella unicellulare a seconda delle condizioni di nutrizione e temperatura. Tale dimorfismo è comune a molte specie patogene come per esempio Candida. Il tallo di un fungo è costituito da filamenti tubulari dal diametro compreso tra 3-10 mm denominati ife. Un aggregato di ife è chiamato micelio. A volte si possono distinguere un micelio vegetativo, immerso nel terreno di coltura, e un micelio aereo, (ife che emergono nell aria e spesso specializzate per la formazione di spore vegetative o sessuali) Diap. 8. La parete cellulare è composta per l 80-90% del suo peso da polisaccaridi, la restante parte comprende proteine e lipidi. La rigidità è dovuta alla presenza di microfibrille tenute assieme da una matrice amorfa. Chitina e cellulosa sono i componenti più comuni. Nei lieviti sono presenti glucani e mannani. Diap. 9. Le ife possono essere: A) non settate (cenocitiche). Presenti nei Ficomiceti. B) settate con cellule uninucleate; i setti si originano per accrescimento centripeto; in alcuni funghi il setto presenta un poro centrale di 0,4-1mm attraverso il quale il citoplasma e i nuclei possono migrare da compartimento ad un altro C) Settate con cellule plurinucleate. Diap. 10. Le ife dei funghi si estendono continuamente sulla punta, dove gli enzimi sono rilasciati nell ambiente e dove sono sintetizzati i materiali nella nuova parete. Il tasso di estensione della punta può essere molto rapido - fino a 40 micrometri per minuto. La crescita apicale è una caratteristica distintiva dei funghi che gli consente di estendersi in zone fresche di substrato. Questo è particolarmente importante per la crescita su polimeri insolubili come la cellulosa in quanto gli enzimi rilasciati dalle ife hanno un tasso di diffusione limitato. Questi enzimi creano zone di erosione attorno all ifa, ma la punta può continuare a crescere oltre queste zone dove i nutrienti sono esauriti. La crescita apicale consente ai funghi di inserirsi nella parete cellulare delle piante e la cuticola degli insetti. L organizzazione ultrastrutturale dell ifa fornisce importanti informazioni sulla crescita apicale. La punta estrema di un ifa in crescita

3 possiede un corpo apicale definito Spitzenkörper che consiste in un raggruppamento di piccole vescicole membrana-legate avvolte da microfilamenti di actina. Si pensa che le vescicole apicali che formano lo Spitzenkörper siano prodotte nel Golgi e quindi trasportate nella punta da elementi del citoscheletro. (microtubuli, microfilamenti di actina e miosina). Le vescicole quindi si fondono con la membrana plasmatica e rilasciano il loro contenuto che può essere costituito da: - enzimi coinvolti nella sintesi della parete - enzimi coinvolti nella degradazione della parete - enzimi attivatori - alcuni polimeri della parete come le mannoproteine E chiaro che il processo di crescita alla punta dell ifa è estremamente complesso, con molti componenti che si devono coordinare. Qualunque cambiamento o sbilanciamento di questi componenti può alterare la forma della punta dell ifa o la direzione di crescita. Diap Coltivazione delle muffe Quasi tutte le muffe crescono su comuni terreni batteriologici a temperature comprese tra 20 e 30 C. La crescita è più lenta rispetto ai batteri; per favorire la crescita delle muffe si possono utilizzare terreni acidi (ph 5,6) contenenti una concentrazione di zucchero piuttosto alta. In queste condizioni la crescita di molti batteri viene inibita. Esistono tre tipi generali di terreni per la coltivazione delle muffe: 1. Terreni sintetici o chimicamente definiti 2. Terreni colturali preparati con peptoni, estratti vegetali, agar 3. Terreni naturali come infusi di frutta, cereali ortaggi. Diap. 15 Nei terreni, indipendentemente dalla provenienza, devono contenere fonti di carbonio/energia, azoto, vitamine e tracce di sali. E inoltre importante la presenza di tamponi e agenti antischiumogeni. Nella tabella mostrata nella Diap. 16, sono riportati i principali componenti dei terreni di crescita usati nelle fermentazioni industriali. Particolare attenzione viene riservata alla crescita delle forme filamentose, che possono essere propagate sia su terreni solidi che su terreni liquidi. Diap Crescita delle forme filamentose su terreni solidi Se si semina una sospensione di spore in un punto su un terreno solido, si forma una grossa colonia circolare che compare dopo pochi giorni e continua ad ingrandirsi con velocità che dipende da caratteristiche della specie. Si possono distinguere tre fasi principali: fase di latenza fase di crescita fase di invecchiamento Se la semina è stata fatta con spore, la fase di latenza è dovuta alla loro germinazione; se invece è stata fatta con micelio, è dovuta alla rigenerazione delle ife spezzate o a cambiamenti dell ambiente. La velocità della crescita dipenderà dalla natura e la quantità delle sostanze nutritive, dal ph, dalla pressione osmotica, dalla temperatura, dall O 2, dalla CO 2 e dall umidità relativa dell atmosfera interna della piastra. Nella terza fase (invecchiamento) si osserva che le ife ai bordi della colonia crescono ancora un po, ma in modo irregolare. In molte specie si ha autolisi al centro della colonia. Crescita delle forme filamentose su terreni liquidi Essendo dei microrganismi aerobi, in terreno liquido le muffe hanno la tendenza a crescere in superficie e formano così miceli molto spessi (feltri) non omogenei. Infatti, tra la parte che si sviluppa a contatto con il liquido e quella più a contatto con l aria si crea un gradiente fra una condizione anaerobica e una aerobica. Le esigenze industriali prevedono però l uso di colture sommerse. In questo caso è necessario provvedere al fabbisogno di ossigeno mediante insufflamento di aria accompagnato da una forte agitazione. In questo modo si formano dei miceli frammentati in piccole palline (pellets). La grandezza dei pellets è controllata da vari fattori quali la diffusione dell ossigeno, delle sostanze nutritive il ph ecc. La preparazione dei pellets richiede un ottimizzazione e può avere una notevole influenza sulle rese dei prodotti finali. Riproduzione sessuale nei funghi Le spore sessuali si trovano allo stato aploide e prendono nomi diversi a seconda del gruppo al quale appartengono i funghi stessi. In uno schema generale, due gameti si fondono formando lo zigote diploide che accrescendosi formerà l individuo adulto. Nella maggior parte degli eucarioti, alla fusione del citoplasma (plasmogamia) segue immediatamente la fusione dei nuclei (cariogamia). Nei funghi, plasmogamia e cariogamia possono essere separate da molte divisioni cellulari. Due nuclei aploidi nello stesso citoplasma formano un dicarion. La riproduzione può avvenire per:

4 -anisogamia -isogamia -oogamia -contatto tra gametangi (uno o più nuclei passano da un gametamgio maschile a uno femminile per contatto -somatogamia: fusione di cellule somatiche o ife non seguite da cariogamia I funghi omotallici presentano i due tipi di cellule sessuali sullo stesso tallo, mentre nei funghi eterotallici la riproduzione sessuale avviene tra gameti derivati da individui diversi. Diap. 19. In alcuni funghi il ciclo vitale è per la maggior parte del tempo aploide (n), quindi alla plasmogamia seguono immediatamente la cariogamia e la meiosi. In altri funghi, alla plasmogamia non segue immediatamente la cariogamia e il ciclo vitale è in predominanza dicarion (n + n). Infine, si trovano funghi nei quali il ciclo vitale è in predominanza diploide (2n) e alla meiosi seguono immediatamente la plasmogamia e la cariogamia. Diap Riproduzione vegetativa nei funghi Le spore si formano da un ifa aerea che si differenzia in una struttura denominata corpo fruttifero o sporoforo. I principali tipi di spore sono rappresentati nella figura. artrospore: si formano per segmentazione dell ifa blastospore: si formano per esocrescita lungo le ife settate clamidiospore: si formano lungo l ifa o ad un estremità conidiospore: si formano all estremità di conidiofori derivanti da ife settate sporangiospore: si producono entro lo sporangio all estremità di corpi fruttiferi (sporangiofori) derivanti da ife non settate. Diap. 23. Caratteristiche delle principali divisioni Analizzaremo ora le caratteristiche distintive ed i modi di riproduzione di alcuni gruppi di funghi (Diap ). Divisione Zygomycota La maggior parte vive su materia animale e vegetale in decomposizione nel suolo. Presentano ife cenocitiche con molti nuclei aploidi. Un membro di questa divisione è la muffa del pane Rhizopus stolonifer. Sul pane ife specializzate denominate rizoidi, si estendono all interno e assorbono le sostanze nutritive; altre ife denominate stoloni, si inarcano all indietro e formano nuovi rizoidi; altre ancora si erigono a formare gli sporangiofori. Nella riproduzione sessuale le ife di tipo opposto si uniscono e, nel punto di contatto, formano i gametangi. Questi, si fondono per formare una zigospora diploide caratterizzata da una parete ispessita. Dalla zigospora in seguito a meiosi, si origina un ifa che darà luogo allo sporangio con spore vegetative aploidi. Rhizopus viene utilizzato in Indonesia per produrre il tempeh (alimento ottenuto con la bollitura di soia sbucciata). Mucor viene usato con la soia per produrre il sofu (formaggio) Vengono inoltre utilizzati per la produzione di enzimi amilolitici a pectinasi Altri zigomiceti vengono impiegati nella preparazione di anestetici, alcoli industriali, preparati per rendere tenera la carne e di coloranti gialli per surrogati del burro e della margarina. Rhizopus si riproduce per via vegetativa, ma in condizioni ambientali sfavorevoli adotta la riproduzione sessuata. Divisione Ascomycota A questo gruppo appartengono numerosi funghi unicellulari, filamentosi e dimorfici. Le forme filamentose hanno il micelio settato. Molte specie sono economicamente importanti. Molte delle muffe che deteriorano i cibi sono ascomiceti. Lo stesso per il malbianco che attacca le foglie delle piante, il cancro del castagno e la moria dell olmo. Le morchelle e i tartufi sono ascomiceti. Anche il lievito S. cerevisiae, usato in molti processi biotecnologici e come modello di studio di cellule eucariotiche, appartiene a questa divisione. Nel ciclo riproduttivo di Neurospora, due ife specializzate di tipo opposto si fondono per formare le ife ascogene. Queste sono ife settate, dove i nuclei provenienti dalle due ife parentali non si fondono (dicarion). Quando questo ha raggiunto un certo sviluppo, all estremità dell ifa ascogena si forma una cellula a uncino. In seguito a mitosi, dei quattro nuclei prodotti uno rimane nella punta, uno alla base e due nella curva dell uncino. Questi due nuclei si fondono per formare lo zigote il quale, dopo la meiosi e una divisione mitotica, darà origine ad un asco contenente 8 spore. Divisione Basidiomycota Nei basidiomiceti il ciclo vitale inizia con la germinazione di una basidiospora, dalla quale si origina un micelio monocariotico (un unico nucleo in ciascuna cellula settata). Il micelio si

5 sviluppa rapidamente e si estende nel suolo. Quando questo micelio primario ne incontra un altro di tipo riproduttivo differente, essi si fondono, dando vita a un micelio dicariotico secondario. Questo può essere indotto a produrre un basidiocarpo, un corpo costituito da ife compatte che emerge dal suolo. Dal basidiocarpo si sviluppa il cappello, contenente numerose lamelle appiattite rivestite da basidi. I due nuclei all apice di ciascun basidio si fondono per dare origine ad un nucleo diploide, che immediatamente subisce una meiosi e forma quattro nuclei aploidi. All estremità del basidio si formano sottili estroflessioni, chiamate sterigmi, all interno delle quali si collocano i nuclei aploidi a formare le basidiospore. Una volta liberate, le basidiospore potranno germinare e ripetere il ciclo vitale crossing over, come accade nella meiosi, ma si allineano abbastanza spesso da subire qualche raro scambio genetico. Gli eventi e i possibili prodotti di un crossing over mitotico sono descritti nella Diap. 39. I diploidi che si formano durante il ciclo parasessuale possono andare incontro ad aploidizzazione tramite un processo di non disgiunzione mitotica (Diap ). Questo fenomeno, che avviene spontaneamente con una frequenza di 10-3, può essere indotto con p-fluoro fenilalanina. Divisione Deuteromycota Quando un fungo non ha la fase sessuale (forma perfetta) oppure questa non è mai stata osservata, esso viene inserito nella divisione Deuteromycetes. Molti dei funghi che erano stati includi nei Deuteromiceti, in seguito alla scoperta del loro ciclo sessuale sono risultati essere Ascomiceti o Basidiomiceti. In buona parte i Deuteromiceti sono patogeni e causano malattie come il piede d atleta e la tigna. In questa divisione si trovano anche molte muffe importanti per l industria. Penicillium: produzione di antibiotici penicillina e griseofulvina, conferimento profumi caratteristici di formaggi come il gorgonzola, il camembert e i roquefort Aspergillus: impiegati nella fermentazione delle salsa di soia, produzione di acido citrico gluconico e gallico. Aspergillus flavus e A. parasiticus producono dei metaboliti secondari denominati aflatossine che sono fortemente tossici e cancerogeni Nel genere Aspergillus è presente un ciclo parasessuale. La presenza di un ciclo parasessuale è molto importante poiché permette di studiare la genetica anche in organismi nei quali manca la riproduzione sessuale. Il ciclo parasessuale inizia con la fusione tra due ife e con formazione di un eterocarion. Questo è abbastanza stabile ed i nuclei non interagiscono ma in rari casi, con una frequenza che va da 10-6 a 10-7, si ha la fusione dei nuclei con formazione di nuclei diploidi all interno dei quali può avvenire uno scambio di materiale genetico attraverso il crossing over mitotico. Normalmente durante la mitosi i cromosomi omologhi non vanno incontro a sinapsi e