La taratura della strumentazione nel laboratorio analitico
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- Claudio Carlucci
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1 La taratura della strumentazione nel laboratorio analitico Autori: Sandro Spezia, Maurizio Bettinelli PREMESSA Il presente articolo vuole essere uno spunto di riflessione e discussione relativamente alle modalità di costruzione e verifica della taratura di strumentazione complessa, e al calcolo della conseguente incertezza di taratura. Come illustrato ampiamente dalla UNI EN ISO 1001 la gestione delle apparecchiature prevede una complessa attività che va sotto il nome di conferma metrologica che comprende, oltre all operazione di regolazione e messa a punto, la taratura della strumentazione e la valutazione dell affidabilità delle operazioni effettuate in relazione alle richieste analitiche che il laboratorio deve soddisfare, sia per quanto riguarda richieste cogenti da parte del metodo di riferimento, sia esigenze specifiche della clientela. All interno di questo processo di conferma metrologica, si situa pertanto il processo di taratura della stessa apparecchiatura legata ad uno specifico procedimento analitico ed eseguita con materiali di misura idonei. Il presente articolo intende sviluppare ed illustrare le problematiche legate esclusivamente a quest ultimo aspetto INTRODUZIONE La taratura strumentale è un stadio essenziale nella maggioranza delle procedure di misura. Come noto, per taratura della strumentazione chimica si intende una serie di operazione tendenti a stabilire una relazione tra il risultato di un sistema di misura (ad esempio l assorbanza di un assorbimento atomico) e i valori definiti per una serie di standard di taratura (ad es. la quantità di analita presente in ciascuno standard). Si tratta quindi di preparare una serie di soluzioni standard con quantità note di analita, misurare una risposta strumentale per ciascuno standard e stabilire quindi una relazione tra queste due grandezze. (Vedi in figura 1 una tipica retta di taratura) Il processo di taratura si può riassumere nei seguenti passaggi - pianificazione dell esperimento - effettuazione delle misure 1
2 costruzione di un grafico dei risultati e studio della funzione di taratura (in genere lineare) valutazione dei risultati del modello ottenuto utilizzo della funzione calcolata per l analisi dei campioni reali valutazione dell incertezza associata alla taratura per i diversi campioni analizzati. PIANIFICAZIONE DELL ESPERIMENTO Per pianificare correttamente uno studio di taratura occorre operare secondo i seguenti passaggi: - decidere il numero di soluzioni standard di taratura e la loro concentrazione - decidere il numero di replicati per ogni punto di taratura - preparare le soluzioni standard e decidere quanti esperimenti dobbiamo ripetere La risposta a queste domande deve essere tale da coprire le esigenze analitiche del laboratorio. Come prima valutazione della funzione di taratura (verifica cioè della linearità della risposta) dovrebbero essere preparate almeno cinque-sette soluzioni a differenti concentrazioni tali da coprire, almeno, il range di concentrazioni normalmente incontrate nell analisi di routine. Idealmente, il range di concentrazione dovrebbe essere stabilito in modo tale che la maggior parte dei campioni si trovi nella parte centrale della retta (come spiegato in seguito). Bisogna inoltre considerare anche la matrice nella quale gli standard vengono preparati: è infatti opportuno che gli standard siano preparati in una matrice simile a quella dei campioni, nel caso venga utilizzato il metodo dello standard interno o dell aggiunta standard, questa esigenza è meno impellente. Al fine della costruzione di una funzione lineare di correlazione, è utile fare riferimento alla norma ISO :1990. Tale norma stabilisce regole molto rigide sulla costruzione della retta, ed è basata sull assunto dell omogeneità delle varianze. Secondo la ISO , infatti, una volta costruita la retta andrebbero determinati 10 replicati del primo e dell ultimo punto della retta e le varianze di queste due serie di misure dovrebbero risultare omogenee. Nel caso questo criterio non fosse soddisfatto, si dovrà procedere alla riduzione dell intervallo di concentrazioni della retta di taratura. E evidente che un tale criterio è molto stringente e rischia di essere particolarmente limitante per il laboratorio che esegue analisi di routine. Gli stessi gruppi di lavoro ISO, ben consapevoli di ciò, nei metodi più recenti (si veda ad esempio la revisione del 007 della norma ISO , per l analisi degli anioni in campioni di acque mediante cromatografia ionica) riconoscono espressamente come seguire alla lettera la ISO può essere penalizzante per il laboratorio, che dovrà però considerare l eventuale perdita di accuratezza derivante da questa scelta: EFFETTUAZIONE DELLE MISURE Idealmente le soluzioni standard andrebbero preparate da sorgenti indipendenti, in caso contrario si dovrebbe preparare indipendentemente almeno una soluzione standard di verifica da leggere subito dopo la preparazione della curva di taratura. Non è quasi mai necessario effettuare più replicati per ogni punto di taratura, a meno che questo non sia esplicitamente richiesto dal metodo: normalmente l esecuzione di più replicati viene limitata alla fase di studio iniziale della linearità e non alle operazioni di routine, per le quali si utilizza un solo replicato per ogni punto di taratura. Sarà comunque responsabilità del laboratorio valutare questo punto sulla base della complessità delle operazioni di taratura e del livello di rischio che si intende assumere. CALCOLO DELLA FUNZIONE DI TARATURA Una volta effettuate le analisi, occorre stabilire l esistenza di una funzione lineare o meno. Per prima cosa dai dati ottenuti verrà calcolata una funzione di interpolazione, generalmente seguendo il metodo dei minimi quadrati, vale a dire cercando la funzione (lineare) in grado di minimizzare gli scarti residui dei vari punti determinati nel corso della taratura.
3 E bene ricordare che il metodo dei minimi quadrati è basato sull assunto per il quale le incertezze dei punti utilizzati per le ascisse ( x ) siano trascurabili rispetto alle incertezze dei punti determinati alle ordinate ( y ). Questo è generalmente vero nei casi dei metodi strumentali dove le ascisse sono concentrazioni di soluzioni standard con incertezze derivanti dalle incertezze del materiale di riferimento di partenza e dalle opportune diluizioni, generalmente di 1- ordini di grandezza inferiori rispetto alle incertezze delle ordinate dovute alla ripetibilità strumentale. In ogni caso, qualora sorgesse un dubbio circa l applicabilità di tale approccio statistico, andrebbero confrontate le varianze delle due coppie di dati per verificarne la reale incompatibilità statistica. A tale scopo si può utilizzare il test di Fisher delle varianze. Una volta calcolata l equazione della retta secondo il metodo dei minimi quadrati, ne va valutata la linearità. A tale scopo si possono utilizzare diversi approcci, quali ad esempio l analisi visiva dei residui: in una relazione lineare i residui dovrebbero essere disposti secondo una relazione casuale sopra e sotto la linea zero di riferimento. Esistono anche test matematici più rigorosi quali il test di MANDEL (nel caso di singole determinazioni per ogni punto di taratura) o il test ANOVA (nel caso di più replicati per ciascun punto). Da ricordarsi però che tali test vanno a confrontare una correlazione lineare rispetto ad una quadratica e indicano quale delle due ipotesi dia una migliore correlazione per i dati a disposizione. Nel caso di dati con un elevato livello di correlazione, potrebbe risultare preferibile la correlazione quadratica anche in presenza di una quasi perfetta linearità. Dovrà essere compito del laboratorio valutare quindi caso per caso e adottare le necessarie decisioni sula base di adeguate considerazioni. VALUTARE I RISULTATI DELLA REGRESSIONE OTTENUTA Una volta stabilita una retta di correlazione lineare, il software statistico che ha calcolato la retta in genere restituirà anche un parametro per la valutazione della bontà della retta denominato coefficiente di regressione ( r ). Tale valore indica il grado di correlazione tra i dati, con il valore 1 per una correlazione perfetta, ma non è un indicatore della linearità dei dati. Il parametro r pertanto è un dato utile, ma purtroppo fuorviante. In una correlazione lineare, infatti, non tutti i punti avranno il medesimo peso statistico, ma i punti a maggiore concentrazione influenzeranno maggiormente il risultato finale. Il risultato di tali considerazioni è che potrebbe essere anche facilmente raggiungibile una buona correlazione (r>0,995) anche in presenza di errori grossolani ai livelli di concentrazione più bassi della prima parte della retta. Non a caso infatti il metodo 870 dell EPA suggerisce di valutare sì il coefficiente di correlazione, ma di accompagnare a tale valutazione anche la stima dell errore assoluto per ogni punto di taratura, con il limite di accettabilità massimo del 30% di errore per i primi punti della retta. Spesso in molti software strumentali non viene riportato il dato del coefficiente di correlazione, ma quello del coefficiente di determinazione corrispondente a r. In questo caso vengono utilizzate per la costruzione della curva le varianze dei residui, ma il significato e applicabilità finale ai fini dell utilizzo della retta sono simili. Da considerare che r sarà sempre inferiore a r (essendo il quadrato di un numero inferiore a 1) pertanto si dovrà porre attenzione ai criteri di valutazione dei coefficienti utilizzati ai fini dell accettabilità della retta. ANALISI DEI CAMPIONI REALI La curva di taratura così definita può quindi essere utilizzata per l analisi dei campioni reali. Il laboratorio potrà decidere di operare con una taratura giornaliera (all uso) il che vorrà dire effettuare una curva di taratura nuova ad ogni utilizzo dello strumento, oppure si potrà prevedere di prolungare la validità della taratura nel tempo e ad ogni nuovo set di campioni effettuare solo un controllo di validità preliminare della retta. In ogni caso, sia che si tratti di taratura giornaliera che di taratura periodica, il laboratorio dovrà sempre prevedere all inizio e alla fine del batch di analisi, e nel caso di batch numerosi anche ad intervalli regolari, dei controlli di validità della curva basati sulla rilettura di uno o più standard a confronto con criteri di accettabilità definiti. 3
4 Il controllo ideale prevede due soluzioni di controllo, una ricadente nella prima parte della retta e una nell ultima parte, questo per assicurare una verifica puntuale delle prestazioni sia alle alte e basse concentrazioni. I criteri di accettabilità di tali soluzioni di verifica, se non definiti dal metodo di riferimento, saranno stabiliti dal laboratorio e dovranno essere congruenti con l incertezza di misura desiderata o definita dal metodo. Come vedremo nel paragrafo successivo, i criteri di accettabilità delle soluzioni di verifica hanno un impatto diretto sul calcolo dell incertezza di misura, pertanto il laboratorio dovrà adottare dei criteri compatibili con l incertezza richiesta dal metodo o con gli obiettivi che il laboratorio stesso si è posto. In altri termini, (si veda a tale proposito la norma UNI EN ISO 1001), il laboratorio nel proprio processo di verifica metrologica dovrà stabilire dei corretti livelli di verifica metrologica coerenti con i requisiti dei metodi o le richieste analitiche. Nell analisi routinaria, qualora il metodo lo permetta, si potrebbe operare una ulteriore semplificazione: nel caso sia stata dimostrata la linearità della retta e l analisi non sia affetta da errori sistematici (vale a dire l intercetta è poco significativa) potrebbe essere sufficiente operare una taratura giornaliera che comprende l analisi di un bianco e di una sola soluzione standard; oppure, nel caso in cui il bianco non sia trascurabile, sarà necessario analizzare il bianco e due soluzioni standard. Ovviamente andranno comunque previste le successive soluzioni di controllo intermedio. L adozione di tale semplificazione sarà possibile solo nel momento in cui il laboratorio potrà dimostrare che i controlli previsti e le modalità utilizzate per monitorarli (es. carte di controllo) risultano puntuali ed efficaci. Per controlli si intendono sia le verifiche dirette della retta di taratura mediante l analisi delle soluzioni di verifica intermedia, sia le verifiche periodiche delle prestazioni strumentali in termini di sensibilità, efficienza, condizioni strumentali ecc.; verifiche che variano per tipologia e frequenza da strumento a strumento. (vedi la nota introduttiva inserita in Premessa per la differenziazione di tali attività) VALUTAZIONE DELL INCERTEZZA ASSOCIATA Data la relazione y(q) = es. assorbanza a = intercetta b = coefficiente angolare q = es. concentrazione y(q) = a + bq (1) Dalla rette di regressione si possono calcolare i valori di y corrispondenti alle concentrazioni utilizzate nella taratura (y calcolato ). Si definiscono residui le differenze: r = y osservato - y calcolato Quando si valuta l incertezza e si utilizza una retta di regressione per determinare la quantità q, si determina l intervallo di predizione come lo scarto tipo che spetta alla quantità determinata q con la formula: s q s y / q 1 1 ( yq yq ) = + + b m n b ( q q) dove: s y/q = scarto tipo dei residui b = coefficiente angolare della retta di taratura m = il numero delle letture effettuate su ogni campione nelle prove di ripetibilità (repliche eseguite per ognuno dei punti di taratura) n = numero di punti di taratura (escluso il bianco) y q = la lettura effettuata durante ogni singola prova di ripetibilità (es.: assorbanza) y q (medio) = la media generale delle letture effettuate in fase di taratura (es.: assorbanza media) q i = il valore del generico punto di taratura (es. concentrazione del punto di taratura) q (medio) = il valore medio dei punti di taratura (es. media delle concentrazioni usate per la taratura) i () 4
5 Lo scarto tipo dei residui s y/q si ottiene da: s y / q ( y ˆ i yi ) = n (3) Dove yi è il valore osservato e y i il valore calcolato dalla curva. Una volta calcolati gli scarti tipo dovuti alla curva di taratura per ogni prova effettuata per la ripetibilità al livello preso in considerazione dallo scarto tipo s q si ricava u B (q m ) dalla seguente: u B ( q m ) = N s q (4) dove N indica il numero di prove di ripetibilità effettuate. Per ricavare l incertezza tipo relativa dovuta alla curva di taratura: u B ( qm ) u B ( qm ) = ; ν = ( n ) x m (5) x m = media dei valori ricavati dalla curva di taratura durante le prove di ripetibilità. Dalle equazioni sopra descritte si può vedere come l incertezza di una taratura non sia costante in tutto il suo intervallo ma sia maggiore agli estremi e minima al centro stesso. (Agli estremi sarà uguale in valore assoluto, il che vuol dire che all estremo superiore inciderà percentualmente meno rispetto all estremo inferiore). Inoltre tale valore è influenzato direttamente dalla qualità dei dati, vale a dire dal livello di correlazione raggiunto per la singola curva. Si tratta allora di definire una incertezza massima che possa essere poi tenuta sotto controllo dal laboratorio. Si può dimostrare analiticamente l esistenza della relazione:!!!!! =! 1!!!!!!!!!! (6) Sostituendo nella equazione dell intervallo di predizione e definendo un valore di correlazione e di pendenza minimi si può definire la massima incertezza definita dal laboratorio secondo l equazione qui riportata. s q =! 1 $ # -1 & " % r min ( x i x)! 1 n m + 1 n + (y q y q ) $ # " b min (q i q) & % (7) Per le tarature successive sarà pertanto sufficiente tenere sotto controllo il coefficiente di correlazione e la pendenza per essere sicuri che sia sotto controllo anche l incertezza di taratura. Significato di s q e condizioni per il calcolo Il valore di sq, come sopra definito, rappresenta l intervallo di predizione all interno del quale si può supporre, con il 95% di confidenza, cada la vera correlazione. Dall intervallo di predizione si può calcolare l intervallo di confidenza c x calcolato con la formula seguente c x = t s x (8) 5
6 dove t è il t di Student calcolato a n- gradi di libertà con n i punti utilizzati per il calcolo della funzione di taratura. Il laboratorio quindi dovrebbe adottare un criterio di accettabilità sia dell errore massimo residuo di ogni punto al momento della definizione della funzione di taratura, sia per le riletture successive degli standard di controllo coerente con tale intervallo di confidenza. Questo vuol dire che, qualora si calcoli l incertezza di taratura a partire da sq definito dall equazione () le letture successive degli standard di controllo della retta dovranno necessariamente avere come intervallo di accettabilità massimo l intervallo definito dall equazione (8). Dobbiamo però chiederci a questo punto se l equazione () sia in realtà sempre applicabile o quali siano i suoi confini di applicabilità. A queste domande risponde la norma ISO :1990 che, nel definire e descrivere appunto tale funzione di calcolo, stabilisce i paletti dell omoscedasticità, cioè che, quanto detto finora, vale a condizione che si verifichi che le varianze siano omogenee per tutto il campo di taratura scelto. La norma ISO descrive un semplice test per tale verifica vale a dire misurare la ripetibilità (10 replicati) del primo punto della retta e dell ultimo punto della retta e confrontare le varianze così calcolate con il test di Fisher. (9) s a s b F p=1 α;ν 1 ;ν dove s a e s b sono gli scarti tipo della serie di risultati ottenuti in sede di verifica e in sede di convalida del metodo (mettendo al numeratore il valore maggiore) p=1-α è il livello di probabilità prescelto (di solito α=0.05), ν 1 e ν sono i rispettivi gradi di libertà. Le varianze saranno omogenee qualora il valore di F così calcolato risulterà inferiore al valore di F tabulato. E facile verificare (e la stessa norma lo dice) che tale possibilità si può avere solo qualora il range di taratura non superi l ordine di grandezza. Quindi tutte le considerazioni sopra esposte finora valgono solo per le tarature il cui range di concentrazione non superi l intervallo di un ordine di grandezza. E altrettanto evidente che tale condizione non rappresenta la stragrande maggioranza delle tarature adottate nella pratica routinaria dai laboratori, dove le tarature oltrepassano quasi sempre, la singola decade di concentrazioni. In questi casi andrebbero utilizzati altri algoritmi per il calcolo della retta di taratura, (tipo la lineare pesata o la massima verosimiglianza), che non sono di utilizzo comune nei laboratori e spesso non sono neppure implementati nei software commerciali delle varie strumentazioni. In ogni caso sarebbero di difficile gestione e controllo da parte dei laboratori. Questa consapevolezza è esplicitamente dichiarata in una norma, più recente, vale a dire la UNI EN ISO :009 (analisi di anioni in acqua mediante cromatografia ionica) che al paragrafo 8. (Calibration) dice testualmente generalmente il metodo di taratura non è ristretto ad una strategia di taratura che copra una singola decade di concentrazioni come vorrebbe la ISO , in questi casi si potrebbe avere una perdita di accuratezza. Vale a dire: se si supera la singola decade di concentrazioni, è compito del laboratorio calcolare e tenere sotto controllo l accuratezza delle proprie tarature. Intervallo di confidenza definito dal laboratorio Sarà quindi compito del laboratorio definire un intervallo di confidenza che non sarà più legato alle risultanze della singola taratura ma sarà definito a priori o sulla base delle indicazioni del metodo o sulla base di valutazioni interne del laboratorio stesso. Questo intervallo di confidenza, come detto sopra, coinciderà con l errore massimo ammesso sia per i residui di ogni punto di taratura al momento della definizione della funzione di taratura, sia per le riletture successive degli standard di controllo effettuati nel tempo per la verifica della validità nel tempo della retta stessa. 6
7 L intervallo di accettabilità così considerato rappresenterà quindi l intervallo di confidenza dal quale partire per il calcolo dell incertezza di taratura: essendo un criterio stabilito a priori e non conseguente dal calcolo di una serie di misure, avrà una distribuzione rettangolare e quindi il valore scelto dovrà essere diviso per radice quadrata di 3. Ad esempio, se si ritiene valida la curva di taratura con una tolleranza massima del 5% sul valore trovato del materiale di riferimento, il contributo di incertezza relativa, essendo una distribuzione rettangolare sarà pari a: u. 0, 05 tar = = 0, 09 3 (10) In questo caso, al fine di dimostrare di avere sotto controllo la retta nel suo intero campo di applicazione, sarà indispensabile effettuare sempre almeno due controlli uno nella parte alta e uno nella parte bassa della curva, ognuno con il suo proprio criterio di accettabilità. La continua rilettura di tali standard di controllo risponde all esigenza dichiarata dalla ISO di tenere sotto controllo l accuratezza della propria taratura. Da quanto detto finora, i valori definiti nelle equazioni () e (10) sono alternativi e non complementari in quanto definiscono entrambi un intervallo di predizione, in un caso calcolato e nell altro definito a priori : gli intervalli così calcolati saranno differenti, ma si tratterà sempre della medesima grandezza, calcolata in due modalità differenti. Pertanto nel calcolo dell incertezza di taratura dovrà essere introdotto o l uno o l altro dei due contributi, ma non entrambi. Una conferma dell approccio sopra riportato ci arriva dalla UNI ISO 11095:010 che propone di considerare come incertezza del valore misurato l intervallo di confidenza calcolato a partire dalla pooled standard deviation relativa alla varianza dei controlli effettuati nella parte alta e bassa della retta. Generalmente, se si considerano concentrazioni ricadenti nella parte superiore della curva (dal 0 al 100% dell intervallo di taratura), il calcolo dell incertezza derivante da (10) risulta nettamente superiore al valore risultante da (), mentre in molti casi il contrario accade nella parte inferiore (0-0% dell intervallo) per cui si ha non infrequentemente, nel caso di tarature effettuate in un ampio range di concentrazioni, che il dato risultante dal calcolo della formula dello scarto tipo dei residui (calcolata come in oppure in 7) porti a valori estremamente elevati dell ordine anche del 70-80%. Non per questo però si dovrà adottare il criterio, come alcuni propongono, di prendere di volta in volta il valore maggiore. Questo perché, come sopra spiegato, l applicazione dell equazione (), in queste situazioni, porta a dati di incertezza non realistici, troppo elevati rispetto a quanto sperimentalmente misurato dal laboratorio stesso. In molti casi, infatti, il laboratorio può dimostrare di riuscire a contenere i risultati delle proprie verifiche di taratura, nell intervallo basso della retta, entro una variabilità del ± 30% che risulta nei fatti essere sensibilmente inferiore agli ampi intervalli di predizione calcolati con la formula teorica sopra descritta. Il fatto di restare all interno di un criterio di accettabilità sensibilmente inferiore a tali valori, quindi, potrà fornire sufficiente assicurazione che questa sia la reale incertezza di taratura garantita dal laboratorio. Fattore di risposta medio Alcuni metodi (per esempio i metodi EPA) suggeriscono di calcolare il fattore di risposta medio di un analita rispetto ad uno standard interno ai vari livelli di concentrazione. L accettabilità della taratura è definita da ciascun metodo in termini di RSD% massimo applicato ai fattori di risposta calcolati per i singoli livelli. Tenendo presente che l incertezza sul valore medio del fattore di risposta è uguale al rapporto tra lo scarto tipo dei singoli fattori di risposta e la radice quadrata del numero di 7
8 livelli, l incertezza tipo relativa massima di taratura, costante per tutto il campo di misura, si calcola con la seguente formula: u. tar = RSD max 3 (11) dove RSD max è espresso in termini relativi (es. 0% = 0,0) Evidentemente è necessario e sufficiente in questo caso controllare l RSD% massimo per tenere sotto controllo l incertezza di taratura. In questo caso, il criterio di accettabilità dei controlli intermedi (10) dovrà essere costruito in modo tale da essere congruente con il criterio di accettabilità della retta, per cui i valori di incertezza coincidono. BIBLIOGRAFIA Preparation of Calibration Curves A Guide to best Practice LGC-VAM 003 UNI EN ISO 1001: 004 Requisiti per i processi e le apparecchiature di misurazione ISO :1990 Water quality Calibration and evaluation of analytical methods and estimation of performances characteristics UNI EN ISO :009 Qualità dell acqua Determinazione di anioni disciolti mediante cromatografia ionica in fase liquida ISO 11095:1996 Linear calibration using reference materials RINGRAZIAMENTI Gli autori intendono rivolgere un particolare ringraziamento al dott. Michele Fiore dall ARPA di Palermo, per la rilettura attenta del manoscritto e i preziosi consigli che hanno arricchito il presente lavoro 8
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