Giornata di formazione Validazione dei metodi e incertezza di misura nei laboratori di prova addetti al controllo di alimenti e bevande
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- Enrico Festa
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1 Giornata di formazione Validazione dei metodi e incertezza di misura nei laboratori di prova addetti al controllo di alimenti e bevande Bologna 5 Novembre 004 RELAZIONE INTERVENTO APPLICAZIONE DEI DIVERSI APPROCCI PER IL CALCOLO DELL INCERTEZZA DI MISURA, ALLA DETERMINAZIONE DI NITRITI NELLE ACQUE POTABILI L intervento ha lo scopo di presentare l esperienza di Arpa Piemonte, in merito al calcolo dell incertezza di misura, associata ai risultati forniti dal metodo CNR IRSA 4030 Q 100/1994, adottato per la determinazioni di nitriti nelle acque destinate al consumo umano. Prima di entrare nel merito del calcolo e delle conseguenti considerazioni sull incertezza di misura, diamo una breve presentazione del metodo preso in esame; innanzitutto dobbiamo dire che si tratta di un metodo spettrofotometrico che non prevede alcun pretrattamento del campione, se non eventuale filtrazione e/o aggiustamento di ph in quei casi in cui il campione risulta torbido e/o con ph lontano dalla neutralità, casi peraltro poco frequenti nell analisi di campioni di acque potabili. Il campo di applicazione del metodo prevede il dosaggio dei nitriti in un campo di concentrazione che va da 0,05 a 0,50 mg/l di N-NO (utilizzando cuvette con cammino ottico di 1 cm) e individua come matrici: le acque naturali, comprese quelle marine e le acque di scarico. Pur non essendo espressamente indicate le acque destinate al consumo umano, esse possono essere comunque tranquillamente inclusa nel campo di applicazione in quanto assimilabili alle acque naturali. La tecnica operativa prevede semplicemente l addizione in successione, ad una opportuna aliquota di campione (50 ml) di quantità definite di una soluzione di solfanilammide (SA) e di una soluzione di N-(1-naftil)-etilendiammina (NEDA), che in presenza di acido nitroso danno origine ad un azocomposto di colore rosso porpora, la cui assorbanza viene successivamente misurata alla lunghezza d onda di 543 nm. Dopo aver dato una presentazione del metodo, necessaria per poter applicare con coscienza le diverse metodiche per il calcolo dell incertezza, entriamo ora nello specifico dell argomento incertezza di misura, senza pero approfondire eccessivamente il discorso in merito al calcolo in se, ma dando maggior spazio alle considerazioni derivanti dai valori ottenuti. Applicando i tre metodi per la stima dell incertezza di misura: approccio metrologico (o approccio bottom-up): approccio olistico o decostruttivo (o approccio top-down); 1
2 approccio utilizzando la relazione di Horwitz/Tompson; andiamo a valutare i valori di incertezza da associare al misurando (N-NO) all interno del campo di misura del metodo (0,05 0,50 mg/l). APPROCCIO METROLOGICO Per quanto concerne l approccio metrologico, sono stati considerati sia i contributi derivanti dall incertezza associata alla curva di taratura (contributo di tipo B) sia quelli derivanti dalle prove di ripetibilità eseguite dai laboratori Arpa (contributo di tipo A). Come noto l incertezza associata alla curva di taratura la si ottiene dagli scarti tipo di regressione associati ad ogni singola prova di ripetibilità attraverso la relazione: dove: s Q y q s Q scarto tipo di regressione lineare; S / scarto tipo dei residui; y q y q x i m n b ( yq y q ) S y / q = 1 sq b i ( x ) i x la media generale delle letture effettuate in fase di taratura (assorbanza); la lettura effettuata in ogni singola prova di ripetibilità; il valore di un generico punto i-esimo di taratura (con i che va da 1 a n); x il valore medio dei punti di taratura (media delle concentrazioni usate per la taratura; b coefficiente angolare della retta di taratura; n numero dei punti di taratura; m numero di letture effettuate su ogni campione nelle prove di ripetibilità (repliche eseguite per ognuna delle determinazioni. Dagli scarti tipo di regressione, calcolati per ogni prova effettuata di ripetibilità, si è poi ricavato il valore di incertezza u B ( x m ) (in valore assoluto) dovuta alla curva di taratura mediante l equazione: u ( x B m ) = N s q dove N indica il numero repliche effettuate durante le prove di ripetibilità.
3 Infine si è passati dal valore assoluto ( u B ( x m ) ) al valore relativo ( u& B ( x m ) ) (da utilizzare nel calcolo dell incertezza composta) attraverso l equazione: ub( xm) u& B( xm) = x m dove è il valore medio, ricavato sulla curva di taratura delle prove di ripetibilità. x m Per ricavare invece l incertezza derivante dalla ripetibilità del laboratorio, sono stati utilizzati i valori degli scarti tipo di ripetibilità, derivanti dalle prove di ripetibilità effettuate in fase di validazione del metodo. La relazione utilizzata, che correla l incertezza allo scarto tipo di ripetibilità è la seguente: u = s( x ) = r m sr N dove N è il numero di repliche effettuate nelle prove di ripetibilità. Il valore relativo lo si ottiene dalla relazione ur u& r = x m x m dove è il valore medio delle concentrazioni ottenute al livello preso in esame nelle N prove di ripetibilità. Avendo ora a disposizione, i valori relativi di incertezza della curva di taratura e di ripetibilità è possibile calcolare i valori relativi, rispettivamente dell incertezza composta ([ u & ( y) ) ed estesa ( U & (x) ), quest ultima da associare ai risultati analitici. c ] n [ u& ] c = u& r + u& B ( xm ) n N n dove: N n numero di prove effettuate per la ripetibilità; numero di determinazioni effettuate per ogni campione (repliche). [ u& c ] t0.95; 1 U & = N n 3
4 Avendo, il laboratorio strumentale, effettuato in fase di validazione, prove di ripetibilità su diversi livelli all interno del campo di misura del metodo abbiamo stimato l incertezza di ripetibilità e conseguentemente l incertezza del metodo su tutto il campo di utilizzo dello stesso. Diagrammando tali valori in funzione della concentrazione media, si osserva un andamento lineare, come dimostrato dal diagramma sottoriportato. U(x) vs conc. N-NO U(x) mg/l 0,0095 0,0085 0,0075 y = 0,0465x + 0,0005 R = 0,999 0,0065 0,0055 0,0045 0,0035 0,005 0,0015 0,0000 0,0500 0,1000 0,1500 0,000 conc. N-NO mg/l Utilizzando dunque, l equazione della curva che meglio interpola i punti sperimentali, possiamo ricavare il valore di incertezza per tutto il campo di misura del metodo. In seguito al fatto che ci sia una correlazione lineare tra incertezza di misura e concentrazione, ne deriva che la stessa relazione di linearità valga tra i valori di scarto tipo di ripetiibilità e la concentrazione; ovvero in altri termini, il valore relativo dello scarto tipo di ripetibilità è costante in funzione della concentrazione. In una situazione simile, sarebbe possibile utilizzare ai fini del calcolo dell incertezza di ripetibilità, un unico valore di scarto tipo relativo (scarto tipo relativo pool) valido per tutto il campo di misura del metodo, anziché utilizzare i valori degli scarti tipo assoluti di ripetibilità calcolati ad ogni livello di concentrazione esaminato. APPROCCIO OLISTICO Il metodo olistico, per il calcolo dell incertezza di misura, prevede di effettuare valutazioni e calcoli sui dati ricavati dalla partecipazione dei laboratori a collaborative trial, ovvero circuiti interlaboratorio nei quali tutti i laboratori partecipanti adottano la stessa metodica per fornire i risultati. Nel caso specifico della determinazione di nitriti nelle acque potabili, i dati a nostra disposizione derivano dalla partecipazione a circuiti UNICHIM e IFA. Per quanto riguarda il numero di dati a nostra disposizione, dobbiamo dire che per circuiti UNICHIM possediamo i dati relativi ad una sola partecipazione, mentre per IFA ne possediamo circa una decina. Tale distribuzione numerica a favore dei circuiti IFA, non risulta essere delle più favorevoli per l applicazione del metodo olistico; questo semplicemente perché nei report conclusivi dei circuiti forniti da IFA non viene indicato con quale metodica i dati sono stati ottenuti dai laboratori e quindi non è possibile isolare i dati relativi al metodo in esame. 4
5 Una situazione più favorevole deriva invece dalla elaborazione dei dati derivanti dalla partecipazioni a circuiti organizzati da UNICHIM; all atto infatti della rilevazione dei dati UNICHIM, richiede al laboratorio, anche informazioni in merito alla metodica adottata, e successivamente riporta tali informazioni sui report finali, effettuando anche elaborazioni separate dei dati sulla base delle metodiche adottate. Per ovviare a questa situazione e quindi poter utilizzare con una certa tranquillità anche i dati derivanti dai circuiti IFA, abbiamo confrontato tramite il test di Fisher i valori degli scarto tipo relativi di riproducibilità ottenuti dai due circuiti (IFA, UNICHIM) a parità di concentrazione al fine di verificarne la compatibilità statistica. Dall analisi degli esiti del test di Fisher i dati risultano essere compatibili, quindi possiamo in prima approssimazione, confrontare i dati derivanti dalle due tipologie di circuito. Riportando in diagramma i valori degli scarti tipo di riproducibilità (desunti dai report dei circuiti) in funzione della concentrazione di azoto nitroso (valore medio ottenuto dai laboratori partecipanti al circuito); ancora una volta (similmente a quanto accaduto per lo scarto tipo di ripetibilità) si denota un andamento lineare, come mostrato dal diagramma sottoriportato. SR vs conc. N-NO SRmg/l 0,01 0,01 0,008 0,006 0,004 0,00 0 y = 0,0418x + 0,0014 R = 0,81 0 0,05 0,1 0,15 0, 0,5 Conc. N-NO mg/l Tale andamento, conferma in linea generale le assunzioni fatte sulla compatibilità dei dati rilevati dalle due tipologie di circuiti; in effetti questa confrontabilità è plausibile visto che la maggior parte dei metodi adottati per la determinazione di nitriti sono di tipo spettrofotometrico. L andamento riportato in diagramma rappresenta anche l andamento dell incertezza in funzione della concentrazione; infatti gli scarti tipo di riproducibilità ricavati dall elaborazione dei dati dei circuiti rappresentano gia i valori di incertezza composta e possiamo assumere un fattore di copertura prossimo a due, visto il numero elevato di laboratori interessati. APPROCIO MEDIANTE FORMULA DI HORWITZ/TOMPSON 5
6 Per avere numeri confrontabili con i risultati ottenuti mediante gli altri approcci, abbiamo calcolato l incertezza associata al risultato mediante le equazioni di Horwitz/Tompson, alle concentrazioni corrispondenti ai tre livelli utilizzati in fase di validazione per determinare la ripetibilità del metodo, ovvero 0,0440; 0,0930; 0,1840 mg/l N-NO. Attraverso l equazione di Horwitz è possibile ricavare lo scarto tipo di riproducibilità che corrisponde all incertezza composta associata alla concentrazione C (ppb; ppm). R σ = 0,0 C 0,8495 Per concentrazioni inferiori a 10 ppb vale la relazione di Tompson, ovvero: R σ = 0, C R Abbiamo dunque adottato; Tompson per il calcolo di σ alle concentrazioni 0,0440 mg/l (44 ppb) e 0,0930 mg/l (93 ppb), e abbiamo adottato Horwitz per la concentrazione 0,184 mg/l (184 ppb). Per il calcolo dell incertezza estesa si utilizza come fattore di copertura. I risultati ottenuti sono desumibili dalla tabella sottoriportata: Conc. mg/l N-NO Incertezza estesa mg/l Incertezza relativa % 0,0440 0,019 43, 0,0930 0,041 44,1 0,184 0,074 40, INCERTEZZE A CONFRONTO I valori di incertezza relativa U & (x) calcolati attraverso i tre approcci per la stessa concentrazione di analita, sono stati messi a confronto negli istogrammi sottoriportati. Le concentrazioni a cui sono stati fatti i confronti sono rispettivamente 0,044; 0,093 e 0,184 mg/l N-NO ovvero i livelli utilizzati per la determinazione della precisione del metodo in fase di validazione. 6
7 Confronto incertezze alla conc. 0,044 mg/l N-NO 50,00 40,00 30,00 U(x)% 0,00 10,00 0,00 METROLOGICO OLISTICO HORWITZ/TOMPSON Confronto incertezze alla conc. 0,093 mg/l N-NO 50,00 40,00 30,00 U(x)% 0,00 10,00 0,00 METROLOGICO OLISTICO HORWITZ/TOMPSON 7
8 Confronto incertezze alla conc. 0,184 N-NO 50,00 40,00 30,00 U(x)% 0,00 10,00 0,00 METROLOGICO OLISTICO HORWITZ/TOMPSON osservando gli istogrammi, la tendenza subito evidente è che passando dal metodo di Horwitz all olistico e al metrologico il valore dell incertezza stimata diminuisce; inoltre il valore dell incertezza stimata con Horwitz, risulta essere mediamente un ordine di grandezza superiore ai valori ottenuti con gli altri due metodi. Il metodo di Horwitz è un metodo empirico e come tale non abbisogna di alcun studio per poter essere applicato ed è di immediato uso, di contro però sovrastima fortemente il valore dell incertezza. Il metodo metrologico è invece un metodo razionale, che prevede uno studio molto accurato dei processi e che presuppone dunque la conoscenza degli stessi, d altro canto però esso fornisce un valore di incertezza reale fortemente legato alle prestazioni fornita dal laboratorio che l ha stimata. Il metodo olistico è evidentemente un metodo intermedio tra i due precedentemente esaminati e come tale presuppone un medio sforzo da parte del laboratorio, il valore di incertezza fornito, visto che tiene conto di tutte le possibili variazioni che influenzano il risultato, può essere assimilato al volore di incertezza del metodo. Sulla base di quanto detto la scelta di un laboratorio di adottare una metodica anziché un altra può essere effettuata sulla base delle seguenti considerazioni: tempo e risorse disponibili; livello raggiungibile di conoscenza dei processi del metodo; disponibilità di dati utilizzabili. 8
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