Metodi analitici normati e non normati, Limiti di Rilevabilità. Incertezza di Misura

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1 Metodi analitici normati e non normati, Limiti di Rilevabilità Incertezza di Misura Dr. Patrizio Nuti

2 UNI-EN-ISO Metodi di prova e di taratura e validazione dei metodi Generalità Il laboratorio deve adottare metodi e procedure appropriati per tutte le prove e/o tarature che rientrano nei suoi scopi. Questi includono il campionamento, la manipolazione, il trasporto, l immagazzinamento e la preparazione degli oggetti da provare e/o da tarare, e quando appropriato, una stima dell incertezza di misura come pure le tecniche statistiche per l analisi dei dati di prova e/o di taratura. (omissis) Deviazioni dai metodi di prova e di taratura devono avvenire soltanto se le deviazioni sono state documentate, tecnicamente giustificate, autorizzate ed accettate dal cliente.

3 RT-08 - Prescrizioni per l'accreditamento dei laboratori di prova Se le modifiche apportate ad un metodo ufficiale / normalizzato / non normalizzato sono tali da migliorarne le prestazioni senza snaturarne il principio (es. impiego di apparecchiatura con migliore risoluzione e stabilità,materiali di riferimento e reagenti di più elevata purezza) il metodo può essere indicato nell elenco prove mantenendo i riferimenti originali. Altri scostamenti dai metodi, quali: impiego fuori dal campo di misura o di applicazione indicato, se assimilabile, estensioni e/o modifiche rispetto al protocollo consentono di mantenere i riferimenti al metodo originario, purché tali modifiche siano soggette a validazione.

4 UNI-EN-ISO Metodi di prova e di taratura e validazione dei metodi Scelta dei metodi Il laboratorio deve utilizzare metodi di prova e/o di taratura, inclusi i metodi di campionamento, che soddisfino le esigenze del cliente e che siano appropriati per le prove e/o di tarature da eseguire. Si devono utilizzare preferibilmente i metodi pubblicati nelle norme internazionali, regionali o nazionali. (omissis) Quando il cliente non specifica il metodo da utilizzare, il laboratorio deve selezionare i metodi appropriati che sono stati pubblicati sia su: norme internazionali, regionali o nazionali, da organizzazioni tecniche rinomate, su pubblicazioni o riviste scientifiche specializzate, sia come specificato dal costruttore delle apparecchiature.

5 METODI DI PROVA METODI DI PROVA UFFICIALI Metodi di prova riportati o richiamati in documenti normativi cogenti pubblicati nella Gazzetta Ufficiale Italiana (G.U.) o comunitaria (G.U.C.E.) METODI DI PROVA NORMALIZZATI (NORMATI) Metodi emessi da organismi di normazione nazionali, europei, o internazionali ( es. UNI, CEI, ISO) Quando un metodo normalizzato o ufficiale indica la ripetibilità e l esattezza, il laboratorio è tenuto a verificare che, in condizioni di ripetibilità, le prestazioni del laboratorio siano compatibili con quelle indicate Ove manchino tali informazioni, il laboratorio deve determinare la propria ripetibilità e l esattezza e verificare di mantenerle nel tempo 5

6 METODI DI PROVA METODI DI PROVA NON NORMALIZZATI (NON NORMATI) Metodi emessi da organizzazioni tecniche nazionali o internazionali (ad Es. metodi AOAC, Rapporti ISTISAN, Quaderni IRSA, etc) Quando un metodo non normalizzato indica la ripetibilità e l esattezza, il laboratorio è tenuto anche a verificare che, in condizioni di ripetibilità le proprie prestazioni siano compatibili con quelle indicate Ove manchino tali informazioni, il laboratorio nella procedura di validazione deve determinare la propria ripetibilità ed esattezza; in entrambi i casi il laboratorio deve verificare di mantenere nel tempo tali parametri. 6

7 METODI DI PROVA INTERNI Metodi di prova messi a punto o adottati da un laboratorio sulla base delle conoscenze ricavate dalla bibliografia scientifica o dall esperienza pratica 7

8 METODI DI PROVA INTERNI UNI EN ISO 17025: a) identificazione appropriata; b) scopo; c) descrizione del tipo di oggetto da provare o tarare; d) parametri o grandezze e campi di misura da determinare; e) attrezzature e apparecchiature, compresi i requisiti tecnici di prestazione; f) campioni di riferimento e materiali di riferimento richiesti; g) condizioni ambientali e periodo di stabilizzazione richiesto; h) descrizione della procedura, comprendente: apposizione di marchi di identificazione, manipolazione, trasporto, immagazzinamento e preparazione degli oggetti da provare, verifiche da effettuare prima di iniziare le attività, verifiche del buon funzionamento dell apparecchiatura e, se richiesto, taratura e messa a punto prima dell utilizzo, metodi di registrazione delle osservazioni e dei risultati, tutte le misure di sicurezza da osservare; i) criteri e/o requisiti per l approvazione/rifiuto; j) dati da registrare e i metodi di analisi e di presentazione; k) incertezza o le procedure di stima dell incertezza 8

9 METODI DI PROVA INTERNI UNI EN ISO 17025: Le tecniche utilizzate per la determinazione della prestazione di un metodo dovrebbero essere una, o una combinazione delle seguenti: taratura, utilizzando campioni o materiali di riferimento; confronto dei risultati ottenuti con altri metodi; confronti interlaboratorio; valutazione sistematica dei fattori che influenzano il risultato stima dell incertezza dei risultati sulla base di una conoscenza scientifica dei principi teorici del metodo e di un esperienza pratica. 9

10 Validazione dei Metodi di Prova The Fitness for Purpose of Analytical Methods A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics Second Edition 2014

11 Validazione dei Metodi di Prova Table 2 Overview of performance characteristics commonly evaluated during method validation

12 Validazione dei Metodi di Prova Table 2 Overview of performance characteristics commonly evaluated during method validation

13 Validazione dei Metodi di Prova Table 2 Overview of performance characteristics commonly evaluated during method validation

14 Limite di Rilevabilità International vocabulary of metrology Basic and general concepts and associated terms (VIM) 3rd edition - JCGM 200: Detection Limit (limit of detection) measured quantity value, obtained by a given measurement procedure, for which the probability of falsely claiming the absence of a component in a material is β, given a probabilityαof falsely claiming its presence NOTE 1 IUPAC recommends default values for α and β equal to 0.05 NOTE 2 The abbreviation LOD is sometimes used. NOTE 3 The term sensitivity is discouraged for detection limit.

15 SENSIBILITA Capacità di discriminare tra piccole differenze nella concentrazione o quantità o caratteristiche del misurando. Variazione della risposta di uno strumento di misurazione diviso per la corrispondente variazione nello Stimolo (dato dalla concentrazione) È correlata alla pendenza della retta di taratura 15

16 LIMITE DI RIVELABILITÀ (LOD) LIMITE DI QUANTIFICAZIONE (LOQ) Il limite di rivelabilità ed il limite di quantificazione possono essere stimati in 3 modi diversi: dalla retta di taratura (LOD e/o LOQ strumentale) calcolo del rapporto segnale:rumore (S/N) applicando ripetutamente il metodo su bianco matrice (LOD e/o LOQ del metodo) 16

17 LOD - LOQ Pendenza della retta di taratura Rapporto segnale/rumore 17

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19 Calcolo LOD e LOQ mediante determinazione della standard deviation dei bianchi 19

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22 Calcolo dell incertezza di misura Esistono diversi metodi: Approccio olistico o decostruttivo (top-down) Equazione di Horwitz Approccio metrologico (bottom-up) 22

23 Approccio olistico Prevede di calcolare l incertezza di misura utilizzando i risultati di una stessa misura, eseguita in laboratori diversi. In tali condizioni alla riproducibilità del metodo σ R si attribuisce il valore dell incertezza composta e, successivamente, tramite opportuno fattore di copertura, l incertezza estesa. U = k σ R Gli strumenti per ottenere questa condizione sono: la partecipazione del laboratorio a circuiti interlaboratorio, dove tutti i laboratori partecipanti utilizzano lo stesso metodo di prova, per uno stesso parametro, sulla stessa matrice; l utilizzo di matrici di riferimento certificate; l utilizzo di metodi prova contenenti dati di validazione (precisione, incertezza di misura estesa ecc.) 23

24 Equazione di Horwitz È una espressione matematica empirica che lega la concentrazione dell analita al coefficiente di variazione percentuale. L equazione, ricavata analizzando decine di migliaia di risultati relativi a misurazioni interlaboratorio su matrici alimentari, permette di stimare la RSD percentuale assegnabile ad un risultato analitico sulla base della sola concentrazione, espressa come frazione di massa. CVR% = 2 (1 0,5 log C ) Per valori di concentrazione inferiore a 120 ppb l equazione di Horwitz è stata semplificata da Thompson secondo la seguente relazione: σ R = 0, 22C 24

25 Approccio metrologico Il metodo consiste nel calcolare l incertezza composta data da tutti i contributi all incertezza ritenuti rilevanti nell esecuzione della prova. Per calcolare l incertezza di misura di un dato analitico si deve valutare preliminarmente la sequenza completa delle operazioni che sono necessarie all esecuzione dell analisi, attribuendo ad ognuna la variabilità associata. 25

26 Grazie per l attenzione 26