I metodi di analisi : struttura, classificazione e parametri di convalida
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- Albina Carlini
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1 I metodi di analisi : struttura, classificazione e parametri di convalida S. Spezia - UNICHIM Milano, 7-8 ottobre
2 Metodo di analisi chimica E l insieme di operazioni, descritte in modo dettagliato, con le quali l operatore deve condurre il materiale da esaminare, per arrivare alla valutazione del valore della grandezza di interesse. Il procedimento analitico si può, di norma, riassumere nelle duefasi : preparazione del materiale da esaminare misurazione finale 2
3 Metodi di analisi chimica Possono essere raggruppati in due grandi classi : METODI RAZIONALI METODI EMPIRICI 3
4 Metodo analitico razionale E un metodo analitico avente come scopo la valutazione quantitativa, in un dato materiale, di una sostanza con una formula chimica esattamente definita e per la quale possono essere disponibili, in alternativa, altri metodi equivalenti. Esempi - concentrazione totale di Cu, As, Hg in un acqua - concentrazione di benzene nelle benzine 4
5 Metodo analitico empirico E un metodo analitico avente come scopo la valutazione quantitativa di una sostanza o di una classe di sostanze non chimicamente definite ed è invece il metodo stesso a fornire la loro definizione operativa. Pertanto la valutazione così ottenuta è l unica possibile. Esempi - determinazione dei grassi in un tessuto - COD: richiesta chimica di ossigeno 5
6 Metodi di misurazione finale Possono essere raggruppati in due grandi classi : METODI ASSOLUTI METODI RELATIVI 6
7 Metodi assoluti di misurazione finale Appartengono a questa classe quei metodi che descrivono l ottenimento del valore della grandezza di interesse attraverso una relazione nota ed accettata tra grandezze n o n omogenee con quella di interesse. Esempi - gravimetrie - coulombometrie 7
8 Metodi relativi di misurazione finale Appartengono a questa classe quei metodi che descrivono l ottenimento del valore della grandezza di interesse attraverso una relazione nota ed accettata tra grandezze a n c h e o mogenee con quella di interesse. Esempi - cromatografie - spettrometrie 8
9 Nella pratica, la scelta di un metodo dipende dagli scopiche il laboratorio si prefigge di raggiungere e dai vincoli di cui deve tener conto nello sviluppo del metodo stesso. Gli scopi riguardano spesso la necessità di avere un procedimento adeguato per determinare: un analitamai prima considerato, anche se in una matrice nota; un analitagià studiato, ma in matrici sostanzialmente diverse; un analitanon ancora studiato, in una matrice largamente sconosciuta. 9
10 Altri scopi importanti per un laboratorio che si accinge a sviluppare un metodo possono essere: migliorare l accuratezza e la precisione dei risultati, specialmente quando si tratta di determinare il titolo dei principi attivi dei medicinali o della parte attiva dei catalizzatori; abbassare il limite di rivelabilità, in modo che sia almeno di un ordine di grandezza inferiore rispetto alle concentrazioni da misurare. disporre di un procedimento robusto e affidabile. I vincolipiù comuni a cui si deve far fronte possono riguardare: reattivi apparecchiature personale tempo d analisi Costi 10
11 Parametri di prestazione Tipi di metodo Prove di Saggi di purezza Titoli identificazione Quantitativi al limite (composti principali) Giustezza Precisione Specificità Limite di rivelabilità (ISO: limite critico) Limite di quantificazione (ISO: limite minimo) Taratura dello strumento di misura finale Campo di applicazione Il segno (-) significa che normalmente il parametro non viene stimato. Il segno (+) significa che normalmente il parametro viene stimato. Combinazione metodi-parametri secondo ICH (International Conference on Harmonization) 11
12 Parametri di prestazione Tipo di metodo Categoria I Titoli (composti principali) Categoria II Categoria III Saggi di purezza Prove di Quantitativi al limite comportamento Giustezza + + (*) (*) Precisione Specificità (*) Limite di rivelabilità (ISO: limite critico) Limite di quantificazione (ISO: limite minimo) Taratura dello strumento di misura finale (*) (*) (*) Campo di applicazione + + (*) (*) Robustezza (*) Può essere richiesto in funzione della natura della particolare prova. Il segno (-) significa che normalmente il parametro non viene stimato. Il segno (+) significa che normalmente il parametro viene stimato. Combinazione metodi-parametri secondo USPC (UnitedStatesPharmacopeaConvention) 12
13 Combinazione metodi-parametri secondo UNICHIM 13
14 scelta del metodo di prova Metodi di prova ufficiali (metodi prescritti da leggi, decreti, direttive) possono essere normalizzati o non normalizzati metodi Normalizzati emessi da un ente di normazione internazionale, (per es. ISO, CEN) o nazionale, ( ad es. UNI, UNICHIM, DIN, AFNOR, BSI, ecc.) metodi non Normalizzati metodo emesso da organizzazioni tecniche nazionali o internazionali (ad es. Rapporti ISTISAN, Quaderni IRSA, ecc) e metodo sviluppato da laboratori/centri di riferimento nazionali o comunitari o da centri di referenza nazionali accreditati. metodi interni 14
15 Validazione di un metodo E UN PROCESSO DI VERIFICA CON IL QUALE SI CONTROLLA CHE IL METODO SVILUPPATO SODDISFI CONVENIENTEMENTE GLI SCOPI PREFISSATI 15
16 UNI CEI EN ISO/IEC Metodi di prova e di taratura e validazione dei metodi Generalità Il laboratorio deve adottare metodi e procedure appropriati per tutte le prove e/o tarature che rientrano nei suoi scopi. Questi includono il campionamento, la manipolazione, il trasporto, l immagazzinamento e la preparazione degli oggetti da provare e/o da tarare, e quando appropriato, una stima dell incertezza di misuracome pure le tecniche statistiche per l analisi dei dati di prova e/o di taratura. 16
17 UNI CEI EN ISO/IEC Scelta dei metodi - Il laboratorio deve utilizzare metodi di prova e/o di taratura, inclusi i metodi di campionamento, che soddisfino le esigenze del cliente e che siano appropriati per le prove e/o le tarature da eseguire. - Si devono utilizzare preferibilmente i metodi pubblicati nelle norme internazionali, regionali o nazionali. Il laboratorio deve garantire che sia utilizzata l ultima edizione valida. salvo che ciò non sia appropriato o possibile. - Metodi sviluppati dal laboratorio o adottati dal laboratorio possono essere utilizzati se sono appropriati per l uso previsto e se sono validati. 17
18 UNI CEI EN ISO/IEC Validazione dei metodi La validazione è la conferma attraverso esame e l apporto di evidenza oggettiva che i requisiti particolari per l utilizzazione prevista sono soddisfatti. Il laboratorio deve validare i metodi non normalizzati, i metodi sviluppati/progettati dal laboratorio, i metodi normalizzati utilizzati al di fuori del proprio scopo e campo di applicazione prefissato, come pure estensioni e modifiche di metodi normalizzati per confermare che i metodi siano adatti all utilizzazione prevista... Nota 2 Le tecniche utilizzate per la determinazione della prestazione di un metodo dovrebbero essere una, o una combinazione delle seguenti: - taratura, utilizzando campioni o materiali di riferimento; - confronto dei risultati ottenuti con altri metodi; - confronti interlaboratorio; - valutazione sistematica dei fattori che influenzano i risultati; - stima dell incertezza dei risultati sulla base di una conoscenza scientifica dei principi teorici del metodo e di un esperienza pratica. 18
19 UNI CEI EN ISO/IEC Nota 3 La validazione è sempre un bilancio fra i costi, i rischi e le possibilità tecniche. Vi sono molti casi in cui il campo e l incertezza dei valori (per esempio l incertezza, i limiti di rilevazione, la selettività, la linearità, la ripetibilità e/o la riproducibilità, la robustezza e/o la sensibilità alle interferenze) può essere solo fornita in modo semplificato a causa di mancanza di informazioni. 19
20 Validazione di un metodo SCELTA DEI PARAMETRI DA CONSIDERARE PROCESSI DI VERIFICA DEI VALORI DEI PARAMETRI VALUTAZIONE DEI DATI OTTENUTI IN BASE AI CRITERI DI ACCETTAZIONE PREFISSATI 20
21 VALIDAZIONE DI UN METODO ANALITICO Parametri da validare nella sequenza più comunemente impiegata Riferibilità metrologica Taratura Specificità Recupero Accuratezza Precisione Giustezza ripetibilità riproducibilità Limite di rivelabilità critico minimo Campo di applicazione Affidabilità e robustezza 21
22 RIFERIBILITA METROLOGICA Secondo VIM (Vocabolario Internazionale di Metrologia) 3 edizione dicembre 2007 recepito come UNI CEI : Proprietà di un risultato di misura per cui esso è posto in relazione a un riferimento attraverso una documentata catena ininterrotta di tarature, ciascuna delle quali contribuisce all incertezza di misura. 22
23 LA RIFERIBILITA METROLOGICA COME SCHEMA GERARCHICO DI TIPO PIRAMIDALE Campione internazionale o compatibilità tra campioni nazionali Campione nazionale Campioni di riferimento (laboratori di certificazione) Campioni di lavoro (di prima linea) per il laboratorio Strumenti di misura routinari per il laboratorio Materiali da misurare 23
24 VIM, 3 edizione dicembre Campione di misura di riferimento Campione di misura dedicato alla taratura di altri campioni di misura di grandezze di una data specie in una determinata organizzazione o in un determinato luogo. 5.7 Campione di misura di lavoro Campione di misura usato correntemente per tarare o verificare strumenti di misura o sistemi di misura. 24
25 CAMPIONE PRIMARIO E SECONDARIO Definizioni secondo VIM, 3 edizione dicembre 2007 Campione di misura primario(5.4) Campione di misura definito usando una procedura di misurazione di riferimento primaria o realizzato come artefatto scelto per convenzione Campione di misura secondario(5.5) Campione di misura definito mediante una taratura rispetto a un campione di misura primario di una grandezza della stessa specie. 25
26 Procedura di misurazione di riferimento primaria VIM (Vocabolario Internazionale di Metrologia) 3 edizione dicembre recepito come UNI CEI : Procedura di misurazione di riferimento impiegata per ottenere un risultato di misura senza effettuare un confronto con un campione di misura di una grandezza della stessa specie. 26
27 MATERIALE DI RIFERIMENTO (RM) Secondo GUIDA ISO 35 (2006) e Am. GUIDA ISO 30 (2007) Materiale, sufficientemente omogeneo e stabile rispetto a una o più proprietà specificate, che è stato ritenuto idoneo all impiego previsto in un procedimento di misurazione. Nota 1: RM è un termine generico. Nota 2: Le proprietà possono essere quantitative o qualitative. Nota 3: Gli impieghi possono comprendere la taratura di un sistema di misura, la valutazione di un procedimento di misurazione, l assegnazione di valori ad altri materiali, e il controllo di qualità. Nota 4: Un RM può essere usato solo per un unico scopo in un data misurazione. 27
28 MATERIALE DI RIFERIMENTO CERTIFICATO(CRM) Secondo GUIDA ISO 35 (2006) e Am. (2007) GUIDA ISO 30 Materiale di riferimento, caratterizzato per una o più proprietà specificate attraverso un procedimento metrologicamente valido, accompagnato da un certificato che fornisce il valore della proprietà specificata, la sua incertezza associata, ed una dichiarazione sulla riferibilità metrologica. Nota 1: Il concetto di valore comprende attributi qualitativi quali l identità o la sequenza. Le incertezze per tali attributi possono essere espresse come probabilità. Nota 2: Procedimenti metrologicamente validi per la produzione e la certificazione dei materiali di riferimento sono riportati, tra altre pubblicazioni, nelle Guide ISO34 34e 35. Nota 3: La Guida ISO31 contiene indicazioni sui contenuti dei certificati. 28
29 29
30 ISO Guide 34 ISO Guide 34:2009 General requirements for the competence of reference material producers 30
31 TARATURA Definizione secondo VIM 3 edizione dicembre Operazione eseguita in condizioni specificate, la quale in una prima fase stabilisce una relazione tra i valori di una grandezza, con le rispettive incertezze di misura, forniti da campioni di misura, e le corrispondenti indicazioni, comprensive delle incertezze di misura associate e, in una seconda fase, usa queste informazioni per stabilire una relazione che consente di ottenere un risultato di misura a partire da una indicazione. Nota 1: Una taratura può essere espressa da una dichiarazione, da una funzione, da un diagramma, o da una tabella. In alcuni casi può consistere in una correzione additiva o moltiplicativa dell indicazione con l associata incertezza. Nota 2: La taratura non va confusa né con l aggiustamento del sistema di misura, spesso erroneamente chiamato autotaratura, né con la verifica dello stato di taratura. Nota 3: Spesso, solo la prima fase della definizione sopra riportata viene interpretata come taratura. 31
32 TARATURA Qualificazione della strumentazione Equipment qualification(eq) Si articola in tre momenti Qualificazione dell installazione (Installation qualification, IQ) Installazione dello strumento nel luogo in cui è destinato ad operare Qualificazione dell operatività (Operation qualification, OQ) Verifica, nel luogo d installazione, delle prestazioni dello strumento garantite dal costruttore Qualificazione delle prestazioni(performance qualification, PQ) Verifica delle prestazioni dello strumento relative all uso a cui è destinato 32
33 CONFERMA METROLOGICA Insieme di operazioni richieste per assicurare che una funzione o l intera apparecchiatura di misurazione sia in stato di conformità ai requisiti per l utilizzazione prevista Nota : la conferma metrologica normalmente include, fra l altro, la taratura, ogni regolazione o riparazione necessaria e la successiva ritaratura come pure qualsiasi sigillatura o etichettatura richiesta 33
34 Processo di conferma metrologica di un'apparecchiatura di misurazione Riferimento : NORMA UNI EN ISO 10012:
35 L ANALISI CHIMICA E LA RIFERIBILITA METROLOGICA DEI SUOI RISULTATI L analisi chimica è un processo comprendente Preparazione del campione Misurazione finale La riferibilità dei risultati deve tener conto di entrambe le fasi del processo 35
36 RIFERIBILITA METROLOGICA NEL PROCESSO DI MISURAZIONE FINALE Dipende dal suo grado di specificità. La specificità è l abilità caratteristica di un processo di misurazione finale di misurare soltanto ciò che si vuole misurare anche in presenza di molti composti affini dal punto di vista chimico-fisico fisico; composti che, prevedibilmente, possono ancora essere presenti nel materiale da esaminare dopo l opportuna fase di preparazione. Il grado di specificità dipende dal livello di concentrazione sopportabile per ciascuno delle sostanze potenzialmente interferenti considerate 36
37 Risposta del procedimento retta 2 : materiali di taratura aggiunti al campione + + retta 2 + retta 1 A retta 1 : materiali di taratura ed eventuale solvente puro + + B Quantità di materiali di taratura Valutazione della specificità del procedimento (metodo delle aggiunte note) 37
38 LA RIFERIBILITA METROLOGICA NEL PROCESSO DI PREPARAZIONE DEI MATERIALI DA ESAMINARE Questo processo può comprendere, ad esempio : dissoluzione estrazione reazioni chimiche diluizione o concentrazione La riferibilità di questo processo è la risultante della riferibilità di ciascuna fase La riferibilità di ciascuna fase è provata dal fattore di recuperoverificato con l impiego di materiali di riferimento 38
39 CRM con matrice Vantaggi semplice e diretto Svantaggi non sempre disponibile e costoso più o meno diverso rispetto al materiale da esaminare la riferibilità di altre fasi del processo analitico è data per scontata Surrogati dell analita nativo Vantaggi più facile reperibilità ed impiego Svantaggi RECUPERO valutato mediante comportamento chimico-fisico inadeguato crescente: - stessi analiti a concentrazione nota - isotopi - riferimenti interni difficoltà a raggiungere un effettivo equilibrio con la matrice 39
40 CORREZIONE DEL RISULTATO FINALE Ragioni a favore Fornisce una stima del suo valore effettivo Rende possibile il suo confronto ed il suo trasferimento universale Consente di tener conto anche dell incertezza di recupero Ragioni contrarie Correzione insufficiente perché il recupero del surrogato può essere maggiore di quello dell analita nativo I recuperi possono variare con la concentrazione dell analita e con il tipo di matrice rendendo necessario restringere il campo di applicazione del metodo. L incertezza del recupero può essere importante e tale da rendere troppo diverse le incertezze dei risultati con o senza recupero La legislazione può essere stata formulata facendo riferimento ai risultati tal quali 40
41 CORREZIONE DEL RISULTATO FINALE Un suggerimento per decidere Il metodo è razionale la correzione è opportuna affinchèil il risultato sia confrontabile Il metodo è empirico la correzione non deve essere eseguita Raccomandazioni Eseguire la correzione a meno che esistano ragioni specifiche per non farla Valutare il recupero nella convalida di un metodo razionale indipendentemente dal suo utilizzo Riportare chiaramente il fattore di recupero se si esegue la correzione 41
42 LA RIFERIBILITA METROLOGICA DEL RISULTATO FINALE E la risultante della riferibilità della misurazione finale e di quella di preparazione Possono sorgere difficoltà nello stabilire con un accettabile margine di incertezza l una o l altra riferibilità (specialmente quella di preparazione) Si ricorre allora a modalità indirette per acquisire la riferibilità. In pratica, si può : partecipare a prove interlaboratorio (proficiencytests) confrontare i risultati con quelli di un metodo normato esaminare materiali di riferimento certificati con matrice 42
43 RIFERIBILITA METROLOGICA AL PROCEDIMENTO ANALITICO Analita di natura chimica non definita esempi: grasso in tessuto animale, COD Analita definito dal metodo esempio, COD Impossibilità di avere a disposizione campioni primari dell analita in entrambi i casi Importanza di partecipare a prove interlaboratorio condotte con il metodo in questione 43
44 CAMPO DI APPLICAZIONE PUO ESSERE INTESO COME INTERVALLO DI CONCENTRAZIONE NEL QUALE TUTTI I PARAMETRI CARATTERISTICI DEL METODO HANNO VALORI ACCETTABILI. PER QUESTO ASPETTO : CRITERI DI ACCETTABILITA IL CAMPO DI APPLICAZIONE SPERIMENTALE DEVE ESSERE COMPATIBILE CON QUELLO IPOTIZZATO LE CONCENTRAZIONI DEI CAMPIONI ROUTINARI DEVONO TROVARSI VERSO IL SUO CENTRO O COMUNQUE LONTANI DAGLI ESTREMI PUO ESSERE INTESO COME INSIEME DELLE MATRICI ALLE QUALI IL METODO CONVENIENTEMENTE SI APPLICA E PER LE QUALI E STATA ESEGUITA LA SUA CONVALIDA 44
45 ROBUSTEZZA DI UN METODO E il grado di insensibilità dei risultati a piccole variazioni imposte ad alcuni parametri ritenuti capaci di influire sui risultati stessi Youden ha dimostrato che sono sufficienti 8 prove per verificare l effetto delle variazioni imposte a 7 parametri 45
46 Otto prove per verificare l effetto della variazione di sette parametri di un metodo Prove Parametri A/a A A A A a a a a B/b B B b b B B b b C/c C c C c C c C c D/d D D d d d d D D E/e E e E e e E e E F/f F f f F F f f F G/g G g g G g G G g Risultati s t u v w x y z 46
47 Schema di calcolo degli effetti per verificare la robustezza di un metodo analitico secondo Youden V = 1 s + t + u + v 1 A w + x + y + z = A 4 4 a ( ) ( ) ( ) V = 1 s + t + w + x 1 B u + v + y + z = B 4 4 b ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) V = 1 s + u + w + y 1 C t + v + x + z = C 4 4 c V D ( s + t + y + z) 1 ( u + v + w + x) = ( D d ) = V = 1 s + u + x + z 1 E t + v + w + y = E 4 4 e V F ( ) ( ) ( ) ( s + v + w + z) 1 ( t + u + x + y) = ( F f ) = ( ) ( ) ( ) V = 1 s + v + x + y 1 G t + u + w + z = G 4 4 g 47
48 Esempio Si supponga di dover verificare la robustezza di un metodo colorimetrico. I dati (in %) di ripetibilità sono i seguenti (11prove): ; x = 0,7747 0,0209 Il procedimento sia caratterizzato come nella seguente tabella : Operazione Parametri Attacco Durata (A/a) s r = Estrazione Aggiunta reattivo colorimetrico ph (B/b) Durata (C/c) Quantità (D/d) Sviluppo Temperatura (E/e) Complesso Colorato Durata (F/f) Lettura spettrometrica Lunghezza d onda (G/g) 48
49 Numero combinazioni(prove) 1 Risultati(%) s = 0,75 2 t = 0, 72 3 u = 0, 78 4 v = 0, 73 5 w = 076, 6 x = 0, 71 7 y = 0, 79 8 z = 0, 83 media, x R 0 0, 7588 scartotipo, s R 0 0, 0402 F sp 2 = sr = 2 0 / sr = 3,70 > Ftab. 05 = ( 7,10; α 0, ) 3, 14 Valori assoluti degli effetti calcolati V A / a = 0,0275 V B / b = 0,0475 V C / c = 0,0225 V V D / d G / g = = 0,0275 0,0275 V E / e = 0,0175 V F / f = 0,
50 VALUTAZIONE DEGLI EFFETTI Varianza di un effetto V: s = s 2 2 sr sr + s = + = V v s r V x x Scarto tipo di un effetto V: s = V s r 2 Valore limite di un effetto V: V c t = p= 0,95; v= 10 s r 2 Criterio di accettabilità di un effetto V: V V c In questo caso deve essere: V V c = ( 0, ) 0, ,23 = 50
51 Limite di rivelabilità La valutazione del ldr richiede il confronto di segnali e quindi implica necessariamente la considerazione degli errori falsi positivi e falsi negativi. Infatti, nel decidere se il segnale della soluzione in esame, S x, è maggiore di quello del bianco,s B è possibile affermare la presenza dell'analita quando esso è assente: si commette allora un errore falso positivo (errore di prima specie o di primo tipo); è possibile affermare che l'analita è assente quando in effetti è presente: si commette allora un errore falso negativo (errore di seconda specie o di secondo tipo). 51
52 PRECISIONE : grado di accordo fra risultati analitici indipendenti ottenuti in condizioni prefissate Ripetibilità : è la precisione in condizioni di ripetibilità Riproducibilità : è la precisione in condizioni di riproducibilità Ripetibilità ristretta Ripetibilità intermedia 52
53 RIPETIBILITA STRETTA RIPETIBILITA INTERMEDIA Stesso operatore Stessa apparecchiatura Misure eseguite in tempi brevi Nessuna taratura fra le misure Operatori diversi Apparecchiature diverse Misure eseguite in tempi differenti Tarature eseguite fra le misure 53
54 RIPRODUCIBILITA è la precisione in condizioni di riproducibilità Condizioni di Riproducibilità : i risultati analitici indipendenti vengono ottenuti con lo stesso metodo su campioni identici, in diversi laboratori, con operatori, strumenti e materiali diversi. 54
55 Bibliografia Manuale UNICHIM 179/0: Criteri per la validazione di un metodo analitico (2011). Manuale UNICHIM 197: Guida alla scelta e all uso dei materiali di riferimento (2003). UNIEN ISO 10012: Requisiti per i processi e le apparecchiature di misurazione. (2004) ISO 5725: Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part 1, 2, 4, 6. Y.I. Alexandrov: Traceability of Measurements in Chemistry, Analyst (1996), 121, M. Thompson : Sense and Traceability, Analyst (1996), 121, J.M. Green: A Practical Guide to Analytical Method Validation, Anal. Chem. News and Features. May 1,
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