Scienze Tecniche di Medicina e di Laboratorio
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1 Scienze Tecniche di Medicina e di Laboratorio Fulvio Prof. Magni Corso di laurea di Tecnici di Laboratorio BioMedico III anno Fulvio.magni@unimib.it
2 Scienze Tecniche di Medicina e di Laboratorio
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5 Scienze Tecniche di Medicina e di Laboratorio Idrofobicita Affinità Dimensione Carica
6 Scienze Tecniche di Medicina e di Laboratorio Polarità Carica Dimensione Affinità Idrofobicità
7 TLBM Oggetto: Uomo Aspetti: Normale (sano) Patologia (malato) Obiettivi: Salute Modalità: Prevenzione Diagnosi - Terapia Modalità di raggiungimento Valutazioni tramite indagine per: -Definire la condizione di normalità -Rilevazione di differenze: - Qualitative - Quantitative
8 Valutazioni tramite indagine: analisi Analisi: processo avente come scopo finale quello di ottenere informazioni sulla composizione di un campione attraverso una serie di livelli di progettazione, misura ed interpretazione. Procedura analitica: è l'insieme di tali livelli caratterizzata da figure di merito quali sensibilità, specificità/selettività, accuratezza, precisione e limite di rilevabilità.
9 Chimica Analitica Analita: composto di interesse di cui vogliamo ottenere informazioni qualitatitive e/o quantitative. Informazioni ottenibili utilizzando le proprietà chimico-fisiche dell analita in grado di generare segnali rilevabili da appositi strumenti.
10 Metodiche analitiche per analisi Quali-Quantitative Analisi qualitativa: risponde alla domanda cosa è? L elemento caratterizzante è la Specificità Analisi quantitativa: risponde alla domanda quanto? L elemento caratterizzante è la Accuratezza / Precisione /.
11 Metodiche analitiche per analisi Quali-Quantitative Gli elementi caratterizzanti l analisi quantitativa sono: Accuratezza Precisione: Riproducibilità Ripetibilità Specificità Linearità Intervallo di lavoro Sensibilità: Limite di rilevabilità (LOD) Limite di quantificazione (LOQ) Robustezza
12 ANALISI QUALITATIVA Permette di identificare i singoli componenti presenti in una miscela. Il risultato di un analisi qualitativa è la risposta ad un quesito del tipo: Nella miscela c è una sostanza che, sottoposta al trattamento descritto, dà una risposta uguale a quella che darebbe il prodotto di riferimento X? La risposta dovrebbe essere: Nel campione in esame è presente il composto X L elemento che qualifica un analisi qualitativa è la SPECIFICITA definita come la capacità di un indagine di fornire dati utili ad una corretta identificazione di una sostanza
13 ANALISI QUANTITATIVA Procedimento di confronto tra due segnali: quello derivante dalla miscela in esame con l analogo segnale ottenuto da una eguale miscela contenente una concentrazione nota dell analita da valutare. SEGNALE: variazione chimico-fisica rilevabile in seguito ad un procedimento analitico, a causa della presenza della sostanze in esame nella miscela studiata. Il CONFRONTO fra la risposta della miscela in esame e quella di riferimento, contenente una concentrazione nota di analita è reso possibile dalla identificazione e verifica preliminare di una funzione matematica che leghi il segnale alla concentrazione.
14 Dato analitico quantitativo Valore Vero Grandezza di una quantità, riferita ad un analita, composta da un numero e da una unità di misura. Tale valore caratterizza una quantità perfettamente definita, nelle condizioni esistenti al momento dell osservazione. Viene stimato mediante valutazioni ripetute basate su applicazioni di procedure sperimentali (misure di posizione). MEDIA DI PIU MISURAZIONI SULLO STESSO CAMPIONE Incertezza Parte dell espressione del risultato di una misurazione che stabilisce l intervallo di valori entro il quale è stimato cadere il valore vero con una probabilità prefissata. MISURE DI DISPERSIONE
15 Misure di posizione Media (aritmetica): somma delle osservazioni / n. delle osservazioni = (65/5) = 13 Mediana: valore centrale tra le osservazioni ordinate in modo crescente E utile: - per distribuzioni non simmetriche in presenza di valori errati
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17 Come esprimiamo la correttezza del nostro metodo nel fornire il dato quantitativo?
18 Accuratezza (Bias) E un indice del grado di concordanza tra il valore vero e il valore misurato. Descrive la correttezza di un risultato sperimentale. L accuratezza viene descritta in termini di errore assoluto o relativo (bias). Errore assoluto (Ea) della media X di un piccolo insieme di analisi ripetute. Ea = X-Xv Dove Xv è il valore accettato come vero. Errore relativo (Er) espresso come percentuale Er = [(X-Xv) / Xv ] x 100% Gli errori relativi ed assoluti sono dotati di segno
19 Come valutureste la correttezza del vostro metodo nel fornire il dato quantitativo?
20 VALUTAZIONE DELL'ACCURATEZZA DEL METODO L'accuratezza del metodo può essere valutata misurando due campioni uguali ad uno dei quali si è aggiunta una quantità nota di analita. A = campione B = campione + analita aggiunto La differenza B - A darà il valore sperimentale dell'analita aggiunto. Quanto più questo valore sperimentale si avvicina al valore della quantità aggiunta tanto più accurato sarà il metodo.
21 Precisione E un indice del grado di concordanza tra i valori ottenuti in una serie di misurazioni ottenute applicando diverse volte la stessa procedura sperimentale nelle condizioni prescritte. Non potendosi esprimere in termini numerici il grado di precisione di un risultato si preferisce perciò parlare di IMPRECISIONE. La precisione descrive la riproducibilità dei risultati, vale a dire l accordo tra i valori numerici di due o più misure ripetute o di misure che sono state condotte esattamente nello stesso modo. Si ottiene ripetendo la valutazione quantitativa di un dato parametro. Per descrivere la precisione di un insieme di dati ottenuti da misurazioni ripetute si utilizzano tre termini: 1. DEVIAZIONE STANDARD (assoluta, relativa, delle medie), 2. COEFFICIENTE DI VARIAZIONE
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23 Misure di dispersione Deviazione standard assoluta (SD) s = [Σ (x-x) 2 / N-1] Dove x = media aritmetica N = n. osservazioni X = osservazione Deviazione standard relativa (RSD) RSD= s / x Deviazione standard della media (errore standard - ES) s m = s / N Coefficiente di variazione (CV%) CV = [ s / x] x 100
24 VALUTAZIONE DELLA PRECISIONE DEL METODO Per valutare la precisione del metodo si utilizzano i coefficienti di variazione CV% = SD X x 100 CV% intra-assay: CV% inter-assay: è il coefficiente di variazione calcolato analizzando lo stesso campione più volte nello stesso giorno è il coefficiente di variazione calcolato analizzando lo stesso campione più volte in giorni diversi
25 Valore vero Valore vero
26 Tipi di errore Errore sistematico Errore che, nel corso di una serie di misurazioni del valore di una data quantità effettuate nelle stesse condizioni analitiche, o resta costante in valore assoluto o varia in accordo ad una legge definita allorchè variano le condizioni. Errore casuale Errore che varia in modo non prevedibile, sia in valore assoluto che in segno, allorchè un largo numero di misurazioni dello stesso valore di una quantità sono effettuate in condizioni essenzialmente identiche.
27 Ripetibilità e Riproducibilità Ripetibilità (Precision under the same operating conditions over a short interval of time) E un indice del grado di concordanza tra i risultati di successive misurazioni della stessa quantità, condotte con lo stesso metodo dallo stesso osservatore con lo stesso strumento di misura nello stesso laboratorio a brevi intervalli di tempo. Riproducibilità (between laboratories) E un indice del grado di concordanza tra i risultati di misurazioni di una stessa quantità ove: - le singole misurazioni sono effettuate con differenti strumenti di misura da diversi osservatori in differenti laboratori su intervalli di tempo abbastanza lunghi rispetto alla durata della singola misura in condizioni ordinarie di utilizzo della strumentazione.
28 Specificità Specificità: capacità di discriminare (rilevare inequivocabilmente la presenza di) un analita in presenza di altri composti (interferenti). Ability to assess unequivocally the analyte in the presence of the components which may be expected to be present (impurity, degradation products, matrix components). Specificità - Proprietà di uno strumento di misura valutata in relazione alla capacità di discriminare dalle altre le unità che possiedono un dato attributo. Si misura con la frazione di unità che, possedendo l'attributo, sono classificate correttamente (in rapporto al totale delle unità nelle quali l'attributo è assente). I casi che, pur non possedendo l'attributo, sono classificati come portatori dello stesso si dicono falsi positivi.
29 Selettività Selettività: capacità di discriminare un analita in presenza di altri composti (interferenti). Ability to measure accurately an analyte in the presence of interferences synthetic precursor, excipients, enantiomers and known degradation products that may be expected to be present in the sample matrix.
30 Sensibilità????
31 Limite di determinazione (LOD) e Limite di quantificazione (LOQ)
32 LOD (Limit of Detection) Qual è il segnale Cos è il rumore di fondo Con Noise Senza Noise
33 LOD (Limit of Detection) Qual è il segnale - cos è il rumore di fondo
34 LOD (Limit of Detection) Definizione di: X Q = segnale generato dall analita. X B = rumore di fondo (segnale di sottofondo interferente con il segnale dell analita. Segnale (X Q ) Noise Rumore di fondo X B + σ B X B min
35 LOD (Limit of Detection) LOD= quantità di analita che fornisce un segnale (area/altezza) misurato sopra la linea di base (X Q -X B ) e che supera la variabilità del fondo (σ B ). (X Q -X B ) = K Q σ B K Q = 3 X Q = X B + 3 σ B Oppure. S / N (σ B ) = 3 Segnale (X Q ) Noise Rumore di fondo X B + σ B X B min
36 LOD (Limit of Detection) LOD= quantità di analita che fornisce un segnale (area/altezza) misurato sopra la linea di base (X Q -X B ) e che supera la variabilità del fondo (σ B ). (X Q -X B ) = K Q σ B K Q = 3 X Q = X B + 3 σ B Cioè S/N = 3 Quale sarà il valore di S/N? S/N = 1 S/N = 1 S/N > 10 min min min
37 LOQ (Limit of Quantification) E la minor concentrazione di analita rilevabile con una metodica Si determina sperimentalmente per ogni analita (X Q -X B ) = K Q σ B K Q = 3 K Q = consigliata >3 ( 10) X Q = segnale della quantità minima di campione X B = segnale del bianco (rumore di fondo) σ B = variabilità del rumore di fondo
38 (LOD - LOQ) LOQ = Limit of Quantification Concentrazione o quantità minima di analita che può essere rilevata ad un livello di confidenza noto sopra il segnale del bianco (sensibilità del metodo). K Q = 10 X Q X B = K Q σ B S:N = 10:1 Segnale dell analita Considerazione <3σ Analita non rilevabile 3σ to 10σ Analita rilevabile >10σ Analita quantificabile
39 Segnale Sensibilità (LOD LOQ) Sensibilità: di uno strumento o di un metodo indica la capacità di discriminare fra piccole differenze di concentrazione dell analita. A B x x 1 Concentrazione
40 Segnale Sensibilità (LOD LOQ) Due fattori limitano la sensibilità: la pendenza della curva di calibrazione e la riproducibilità o precisione del dispositivo di misura. Sensibilità: metodo A > metodo B Piccole variazioni di conc. Elevate variazioni di segnale A Concentrazione B Metodi con uguale precisione: più sensibile quello con la curva più ripida. Metodi con curve di calibrazione di eguale pendenza: più sensibile quello con la migliore precisione.
41 Segnale Sensibilità (LOD LOQ) Quale metodo sarà più sensibile (rileva piccole concentrazioni di analita). A B Concentrazione Sensibilità: A > B Limite di rilevabilità: A < B
42 Linearità Capacità (entro un intervallo definito) di ottenere dei risultati analitici (segnali) che sono direttamente proporzionali alla concentrazione dell analità nel campione allo studio. Metodo: Almeno 5 concentrazioni Ispezione visiva del digramma ed analisi statistica Coeff. di correlazione, intercetta sull asse y, inclinazione analisi dei residui.
43 Segnale Segnale Curve di calibrazione concentrazione concentrazione
44 Segnale Segnale Curve di calibrazione concentrazione concentrazione
45 Intervallo analitico Intervallo compreso tra il limite di concentrazione, dell analita nel campione, superiore ed inferiore di cui è stato dimostrato che la procedura ha un adeguato livello di precisione, accuratezza e linearità.
46 Range di linearità Range dinamico
47 Robustezza Misura della capacità di un metodo di rimanere non affetto da piccole variazioni dei parametri del metodo stesso.
48 Classificazione in base a figure di merito (accuratezza-precisione) Gerarchia dei metodi di misura Tipologia Bias Metodi di routine ca. 10% Metodi di Riferimento ca. 3% Metodi Definitivi ca. 1% SI-Units 0 % Accuratezza Eur. J. Clin. Chem. Biochem :
49 METODI DEFINITIVI (MD) METODI di RIFERIMENTO (MR) METODI di ROUTINE
50 Metodi Definitivi Un metodo definitivo è un metodo analitico che è stato sottoposto ad una approfondita indagine e valutazione per ciò che riguarda le fonti di inaccuratezza, compresa la non-specificità. La stima dell imprecisione finale e della inaccuratezza, espresse nel livello di incertezza, sono di un ordine di grandezza compatibile con lo scopo prefissato del metodo. Il valore medio ottenuto con un MD è assunto come valore vero.
51 METODI DEFINITIVI Metodi analitici in cui l'errore sistematico (bias) è trascurabile (valore "misurato"= "valore vero") o comunque è individuato e corretto. Precisione elevata così da non mascherare gli errori sistematici Ripetibilità della determinazione a distanza di tempo. Imprecisione (RSD) < 0.5% NCCLS 2(15):451 ID-MS La tecnica della diluizione isotopica in Spettrometria di Massa è in grado di soddisfare i requisiti dei Metodi Definitivi.
52 Metodi di Riferimento Un metodo di riferimento è un metodo per la misura di uno o più analiti adeguatamente studiato, descrivendone chiaramente ed esattamente le condizioni necessarie al raggiungimento dello scopo e le procedure per la sua realizzazione. L accuratezza e la precisione sono state dimostrate essere commisurate con l uso proposto. Tale metodo può essere utilizzato per stabilire l accuratezza di altre metodiche per lo stesso tipo di analita.
53 Si dividono in MR di classe A: Metodi analitici la cui accuratezza e precisione sono sufficienti, come dimostrato per comparazione diretta con un metodo definitivo, e la cui bassa incidenza di suscettibilità ad interferenti noti è così approfonditamente documentata da permettere di raggiungere l obbiettivo proposto per un metodo di riferimento. MR di classe B: Metodo analitici considerati, per consenso comune tra gli esperti, all altezza di un metodo di riferimento, eccetto che la valutazione rispetto ad un metodo assoluto non è stata ancora completata. MR di classe C: Metodi analitici considerati, per consenso comune tra gli esperti, all altezza di un metodo di riferimento pur non essendo ancora disponibile un metodo definitivo su cui valutarli.
54 Metodo di Routine E un metodo la cui accuratezza e precisione è stata valutata rispetto a un metodo di riferimento o con un materiale di riferimento secondario. Metodi analitici impiegati ogni giorno in laboratori di analisi.
55 SI Calibratore(Analita puro) METODO DEFINITIVO Scopo: Valutazione dei metodi di Riferimento e preparazione di materiali di riferimento. Materiale di riferimento primario Uso:Sviluppo e valutazione dei metodi di riferimento. Produzione di materali di riferimento secondari METODO di RIFERIMENTO Scopo: Valutazione dei metodi di routine e preparazione dei materiali di riferimento secondari e materiali di controllo. Materiali di riferimento secondari Uso: Standard di calibrazione per i metodi di routine e per assegnare valori ai materiali di controllo. METODO di ROUTINE Scopo: Determinazione della quantità di analita presente nei reperti dei pazienti. Materiali di controllo Uso: Controllo di qualità
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