Polifenoli: da problematica ambientale a risorsa da valorizzare per lo sviluppo sostenibile Giancarlo Dondo - Active cells S.r.l.

Transcript

1 Polifenoli: da problematica ambientale a risorsa da valorizzare per lo sviluppo sostenibile Giancarlo Dondo - Active cells S.r.l. La ricerca che crea innovazione per un futuro sostenibile Genova, 20 febbraio 2015 Con il patrocinio di Tecnologie innovative per il Controllo Ambientale e lo Sviluppo Sostenibile Soggetto gestore del Polo Regionale di Ricerca e Innovazione Tecnologica EnergiaAmbiente Con il contributo di

2 ACQUE DI VEGETAZIONE OLIVE Stima Liguria tonnellate Acqua di vegetazione delle olive In Italia si calcola la produzione di AV in circa 4 milioni di ton/anno Isolation and screening of microorganisms: during the years a collection of microorganisms was isolated from several ecosystems that can be used for operations of biodegradation and biotransformation Multi-kilo lab: production of microorganism according to customer specifications Upstream and downstream process: industrial microbiology, fermentation technology and process development 12

3 UNITÀ OPERATIVE DEL PROGETTO POR Regione Liguria Posizione n 49 Produzione di idrossitirosolo e derivati fenolici da acque di vegetazione di olive mediante biotecnologie e studi preliminari in campo farmacologico. Unità Operativa: DCCI ; Dipartimento di Chimica e Chimica Industriale (DCCI) dell Università degli studi di Genova, Responsabile: Prof. Gustavo Capannelli Componenti: Gustavo Capannelli, Bottino Aldo, Ferrari Fiorenza, Antonio Comite, Mauro Michetti Via Dodecaneso 31, Genova Unità Operativa: AC ; Analisi & Controlli S.p.A. Via dei Reggio, Genova Responsabile Dr. Attilio Carmagnani Componenti: Giancarlo Dondo, Antonella Scattina, Dott. Luigi Costantini, Paolo Parodi, Valeria Rebora. Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro, Largo R.Benzi 10, Genova Unità Operativa: IST1 ; S.S. Tumori Polmonari Responsabile del progetto : Dr.ssa Angela Alama Unità Operativa: IST2 ; S.C. Trasferimento Tecnologico e Coordinamento Core Facilities, Animal Facility Responsabile del progetto: Dr. Michele Cilli Unità Operativa: IST3 ; S.C. Trasferimento Tecnologico & Coordinamento Core Facilities Responsabile del progetto: Dr.ssa Elisabetta Vitiello

4 Produzione di idrossitirosolo e derivati fenolici da acque di vegetazione di olive mediante biotecnologie e studi preliminari in campo farmacologico. Il progetto s è articolato tecnicamente in tre fasi: Sviluppo di procedura di concentrazione/prepurificazione mediante membrane Sviluppo di procedure biotecnologiche di conversione e purificazione della componente polifenolica Analisi degli effetti farmacologici in vitro ed in vivo con particolare attenzione agli effetti antiossidanti e antitumorali

5 Sviluppo di procedura di concentrazione/prepurificazione mediante membrane 1. Indagini mirate alla individuazione dei parametri di processo e alla selezione delle membrane più idonee per trattamento dell acqua di vegetazione e il recupero dei polifenoli. 2. Prove mirate alla produzione di frazioni concentrate ad alto contenuto di polifenoli da distribuire alle altre unità operative Schema dell impianto di laboratorio utilizzato per le prove di microfiltrazione Schema dell'impianto utilizzato per le prove di osmosi inversa

6 Sviluppo di procedura di concentrazione/prepurificazione mediante membrane Confronto tra campioni di acqua di vegetazione Microfiltrato e Permeato dell osmosi inversa Impianti di microfiltrazione e di osmosi inversa installati presso il frantoio per il trattamento dell acqua di vegetazione e per la produzione delle frazioni concentrate in polifenoli

7 Sviluppo di procedure biotecnologiche di conversione e purificazione della componente polifenolica Retentato Osmosi Idrolisi / enzimatica chimica Estrazione /Concentrazione

8 Sviluppo di procedure biotecnologiche di conversione e purificazione della componente polifenolica 3-idrossitirosolo tirosolo

9 Analisi preliminari degli effetti farmacologici in vitro ed in vivo con particolare attenzione agli effetti antiossidanti e antitumorali E stata eseguita la valutazione dell attività citotossica dell idrossitirosolo da acque di vegetazione di olive in vitro, ed inoltre la verifica di un possibile potenziamento antiproliferativo in associazione a farmaci antitumorali comunemente impiegati in clinica. A questo proposito il nostro interesse si è concentrato principalmente su una patologia ad andamento quasi sempre infausto e i cui effetti antiossidanti indotti da idrossitirosolo potevano contribuire ad una interessante risposta terapeutica: il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) Due linee cellulari tumorali umane di NSCLC, Il carcinoma squamoso SK-MES1 e l adenocarcinoma A549, sono state scelte nel presente lavoro in quanto rappresentano i due più frequenti tipi istologici di NSCLC. Si è s valutata l attività antiproliferativa di Idrossitirosolo (HT), di una miscela di derivati fenolici da acque di vegetazione di olive (OMW) e del cisplatino (CDDP).

10 Analisi preliminari degli effetti farmacologici in vitro ed in vivo con particolare attenzione agli effetti antiossidanti e antitumorali Concentrazioni scalari dei composti in esame sono state impiegate nel trattamento di SK-MES1 e A549 esponendo le colture per 72h. Entrambe HT e OMW hanno mostrato una significativa attività antiproliferativa specialmente in A549 a concentrazioni intorno a 200µM. Inoltre l individuazione delle IC 50 del CDDP, in entrambi i tipi tumorali, hanno determinato valori che si attestavano tra 5 e 10µM con SK-MES1 meno sensibile di A549. Analoghe valutazioni sono state condotte su altre due linee di NSCLC: CALU1 (carcinoma squamoso) e CALU6 (adenocarcinoma). In questo caso è stata riscontrata una maggiore sensibilità ad HT rispetto alle linee cellulari precedenti. Infatti valori di IC 50 di HT intorno a 30µM e 75µM sono stati identificati in CALU1 e CALU6, rispettivamente, mentre valori di IC 50 relativi a CDDP oscillavano in un range di µM in entrambe le linee tumorali.

11 Analisi preliminari degli effetti farmacologici in vitro ed in vivo con particolare attenzione agli effetti antiossidanti e antitumorali Successivamente possibili effetti citotossici additivi o sinergici tra HT e CDDP, sono stati determinati mediante esperimenti di associazione. A questo proposito, concentrazioni sub-tossiche di CDDP e HT sono state identificate ed impiegate per verificare questa ipotesi. I risultati emersi hanno mostrato che sia nelle CALU1 che nelle CALU6 la combinazione dei due farmaci era in grado di inibire la crescita cellulare dal 40 al 60% mentre le singole concentrazioni risultavano scarsamente efficaci. Un approfondimento su tempi e modalità di trattamento (es: dosi ripetute, somministrazioni successive vs concomitanti, tempi di trattamento prolungati) si renderanno necessari per migliorare ulteriormente l indice terapeutico ed identificare lo schema di somministrazione più appropriato.

12 Analisi degli effetti farmacologici evidenziati su modelli animali

13 - Analisi degli effetti farmacologici evidenziati su modelli animali Le proprietà farmacologiche che caratterizzano l'idrossitirosolo e l'elevatissimo potere antiossidante consentono di ipotizzare scenari terapeutici quali un diretto effetto antitumorale, una possibilità di impiego come adiuvante di farmaci tradizionali ed un largo uso come chemioprevenzione. A tal scopo è stato utilizzato un modello murino transgenico del tumore della mammella, il topo MMTVneu Per testare il potenziale preventivo nei confronti della comparsa del processo neoplastico, 12 femmine sono state sottoposte a trattamento chemopreventivo, con mangime addizionato di idrossitirosolo (concentrazione 3,3 gr/kg). Le femmine di prima generazione derivate da queste nidiate sono state sottoposte allo stesso regime alimentare medicato. Al raggiungimento dei 4 mesi di vita nessuna ha sviluppato tumore Un altro gruppo sperimentale è costituito da femmine pluripare appartenenti alla colonia transgenica che sono state inserite nel protocollo di trattamento a differenti età. Tali soggetti, a seguito della loro storia riproduttiva, hanno mostrato un comportamento di sviluppo neoplastico conforme al modello descritto. Pertanto il trattamento nell alimento, iniziato in età adulta, a sviluppo della ghiandola mammaria ultimato e dopo lattazione non sembra influenzare la storia di sviluppo neoplastico.

14 BIOTRASFORMAZIONE TIROSOLO Selezione ceppi proprietari sviluppo di processo verifica prodotto

15 SINTESI DERIVATI DELL IDROSSITIROSOLO Assegno TICASS. Gruppo di Lavoro: Erika Tassano,(1) Angela Alama,(2) Andrea Basso,(1) Giancarlo Dondo,(3) Ivan La Manna,(4) Renata Riva,(1) Valeria Rocca,(1) Simone Stasi,(3) Luca Banfi(1) 1)Dip. di Chimica e Chimica Industriale, Università di Genova. 2)IRCCS San Martino. 3) Active Cells. srl 4)Fratelli Parodi s.p.a.

16 Analisi HPLC di Olive Mill Waste Water 1 2 Campione: OMWW concentrato λ: 280nm 3 1 3,4-diidrossifenilglicol 2 Idrossitirosolo 3 Tirosolo I dati si riferiscono a mg fenolo /1 kg OMWW Gly (3,4-diidrossifenilglicol) HT (idrossitirosolo) Tyr (tirosolo) OMWW 2421 mg 1599 mg 968 mg OMWW (ph=2) 2472 mg (+2%) 1725 mg (+8%) 1077 mg (+11%) ph acido per idrolizzare glicosidi ed esteri oleuropeina

17 Estrazione dei polifenoli I dati si riferiscono a mg fenolo /1 kg OMWW Estrazione con solventi organici Cromatografia a scambio ionico Gly (3,4-diidrossifenilglicol) HT (idrossitirosolo) Tyr (tirosolo) 241 mg (10%) 486 mg (28%) 277 mg (26%) 1362 mg (56%) 904 mg (52%) 290 mg (28%) Problemi dell'estrazione: Recupero inadeguato Procedura lunga Difficile scale-up Grosse quantità di solvente organico Vantaggi delle resine: Miglior recupero Più facile scale-up La resina è ricicalbile Poco solvent organico (alcool)

18 Sintesi di derivati dell'idrossitirosolo HO OH Protezione selettiva delle funzioni fenoliche (P)O OH HO Idrossitirosolo (P)O varie metodologie sintetiche brevi ed efficienti HO LINKER deprotezione R 1 (P)O LINKER R 1 HO R 2 (P)O R 2 Collezione di derivati polifenolici dell'idrossitirosolo R 1, R 2 = OH, OMe

19 Valutazione dell'attività Attività antiossidante (metodo del DPPH) DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl) è un radicale libero stabile di colore violetto. Le sostanze anti-ossidati (scavenger di radicali) reagiscono con DPPH trasformandolo in DPPHH. La diminuzione di assorbanza è proporzionale al potere di scavenging di radicali. Sono state analizzate sia le cinetiche di scavenging che le stechiometrie. I nuovi composti mostrano attività paragonabili o migliori rispetto ad HT. Composti con due gruppi catecolici mostrano stechiometria circa doppia. Attività farmacologica In collaborazione con IRCCS-AOU San Martino Alcuni dei nuovi derivati testati per la tossicità su differenti line di NSCLC (Non Small Cells Lung Cancer). L'attività a 10 μmol di alcuni di essi è superiore a quella di HT.

20 COME UTILIZZARE COMPLESSIVAMENTE I POLIFENOLI DA ACQUE DI VEGETAZIONE? 1. Farmaceutica /nutraceutica/cosmesi 2. Antiossidanti industriali 3. Biocidi/conservanti 4. Raw material bioplastiche 12