Caratteristiche strutturali e funzionali della cellula procariotica 3. MICROBIOLOGIA GENERALE C. Mazzoni 05/5

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1 Caratteristiche strutturali e funzionali della cellula procariotica 3

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3 Vescicole gassose Le vescicole gassose sono state trovate nei cianobatteri, che sono microrganismi fotosintetici e vivono in sistemi acquatici. Nei laghi e negli oceani, i cianobatteri possono controllare la loro posizione nella colonna d'acqua per ottenere la migliore quantità di luce e di nutrienti. Sono presenti anche in alcuni batteri fototrofi purpurei e verdi, in alcuni batteri non fototrofi che vivono nei laghi ed in alcuni Archea. Struttura Le vescicole gassose sono aggregati di strutture cilindriche cave composte da proteine rigide; essi sono impermeabili all'acqua, ma permeabili ai gas atmosferici. La composizione dei gas nella vescicola è funzione dei gas disciolti nell ambiente circostante. Gli aggregati di vescicole gassose costituiscono il vacuolo gassoso Funzione Le vescicole gassose regolano la capacità di galleggiamento dei microbi mediante cambiamento della quantità di gas in esse contenute. Il rilascio di gas dalle vescicole causa la discesa lungo la colonna d'acqua mentre il riempimento delle vescicole con il gas incrementa l'altezza nella colonna d'acqua.

4 nm 97% piccola, idrofobica, rigida nm 2 nm La vescicola ha una densità che è circa il 5-20% di quella della cellula rafforza l involucro della vescicola

5 Carbossisomi (corpi poliedrici) Presenti nei cianobatteri, batteri nitrificanti e tiobacilli; sono corpi poliedrici di circa 100nm e contengono l'enzima ribulosio-1,5-difosfato-carbossilasi in forma paracristallina; costituiscono la riserva di questo enzima e il principale sito di fissazione della C0 2

6 Sostanze di riserva Glicogeno e amido Il glicogeno e l amido sono prodotti di stoccaggio di energia e carbonio. Anche gli esseri umani sintetizzano ed utilizzano il glicogeno, il quale è un polimero costituito dalla ripetizione di unità di glucosio.

7 poli-beta-idrossialcanoati (PHA) Sono uno dei corpi di inclusione di riserva più comuni. Il PHA è un lungo polimero di ripetizioni di unità idrofobiche che hanno attaccate varie catene di carbonio. La forma più comune tra questa classe di polimeri è il poli-beta-idrossibutirrato (PHB), che possiede un gruppo metilico come catena laterale della molecola. Alcuni polimeri PHA hanno delle proprietà simili alla plastica ed è di un certo interesse il loro uso per la produzione di plastica biodegradabile. La funzione dei PHA nei batteri è di riserva di prodotti energetici e di carbonio: come noi accumuliamo il grasso, i batteri accumulano PHA. In alcune specie vengono accumulati quando le cellule si trovano in condizioni di carenza di azoto, ma hanno ancora disponibile una fonte di carbonio e di energia. In altre specie vengono accumulati in fase esponenziale. Costituisce un meccanismo per accumulare una fonte di carbonio osmoticamente inerte. La degradazione del polimero richiede l attivazione di un enzima Ca ++ dipendente La PHA depolimerasi sono delle serina-idrolasi e la loro sequenza proteica contiene 4 domini: una sequenza segnale, un dominio catalitico contenente la lipase-box, un dominio di legame con il substrato e un dominio che lega il sito catalitico al sito di legame per il substrato. Carbonio!

8 Granuli di cianoficina Presenti nei cianobatteri, sono strutture formate da grossi polipeptidi contenenti approssimativamente in quantità uguale gli amminoacidi arginina ed acido aspartico. Sono abbastanza grandi da essere osservati al microscopio ottico e rappresentano una riserva aggiuntiva di azoto. La sintesi non avviene secondo i normali meccanismi di sintesi proteica. Granuli di fosfato e zolfo Molti organismi accumulano granuli di polifosfato (granuli di volutina o granuli metacromatici) in quanto esso è un nutriente limitato in natura. I granuli sono formati da lunghe catene di fosfato. I batteri fotosintetici che non producono ossigeno spesso usano lo zolfo come fonte di elettroni e quindi alcuni di loro accumulano globuli di zolfo.

9 Magnetosomi Alcuni batteri, quando messi in un campo magnetico, si orientano verso uno dei poli grazie alla presenza di magnetosomi (cristalli di magnetite (Fe3O4) disposti in forma di collana). I magnetosomi orientano la cellula e ne determinano la direzione di avanzamento, per collocarsi in regioni favorevoli alla crescita. In genere i microrganismi che li possiedono sono acquatici e microaerofili o anaerobi Magnetite Fe 3 O 4

10 Il citoplasma Il citoplasma, o protoplasma, è quella porzione di cellula racchiusa dalla membrana citoplasmatica. La matrice citoplasmatica è definita come quella sostanza, escluso il materiale genetico, all'interno della membrana citoplasmatica. Il suo aspetto al microscopio elettronico non fornisce molte informazioni (a parte la presenza di qualche granulo). Ciononostante, il citoplasma svolge delle funzioni molto importanti per la cellula.

11 Caratteristiche Consistenza gelatinosa Compartimentalizzazione Tutti gli enzimi glicolitici sono organizzati in una unità Molti enzimi deputati alla sintesi del DNA si trovano sulla forca di replicazione Costituenti Proteine (inclusi gli enzimi) Vitamine Ioni Acidi nucleici e loro precursori Amino acidi e loro precursori Zuccheri, carboidrati e loro derivati Acidi grassi e loro derivati

12 Funzioni Racchiude tutti i costituenti cellulari, incluso il pool cellulare (vedi sopra). E' all'interno del citoplasma che sono svolte le maggiori attività cellulari quali la crescita, il metabolismo e la replicazione del cromosoma.

13 Materiale genetico Nei batteri il materiale genetico non è racchiuso in un nucleo. Comunque, esiste all'interno della cellula una regione, definita nucleoide, in cui è confinato il DNA e che è distinguibile tramite microscopia elettronica. La maggior parte delle cellule batteriche possiede un solo cromosoma costituito da una molecola circolare di DNA. Il cromosoma batterico di E. coli contiene circa 4,6X10 6 coppie di basi (4300) geni. Nei batteri la neutralizzazione delle cariche è attuata da poliammine come la spermina e spermidina, Mg ++ e proteine basiche. Durante la replicazione il cromosoma batterico è legato alla membrana. Sebbene le cellule batteriche posseggano un unico cromosoma, possono presentare altri pezzi di materiale genetico. Questi pezzi di DNA sono chiamati PLASMIDI e sono definiti come frammenti di DNA extracromosomali capaci di replicazione autonoma.

14 Caratteristiche dei plasmidi Sono molto simili al cromosoma batterico in quanto spesso sono delle molecole di DNA circolari (in alcune specie sono stati trovati plasmidi lineari). Hanno una taglia variabile (da 1 a più di 1000 kilobasi) e sono presenti in un numero che varia da 1 a 700 copie per cellula. La funzione dei plasmidi non è sempre nota; spesso non sono essenziali per la vita della cellula, sebbene la loro presenza generalmente fornisce all'ospite qualche vantaggio Curing: perdita del plasmide. Può avvenire spontaneamente o può essere indotta. Paragrafo 10.8

15 Vantaggi conferiti all'ospite dalla presenza di plasmidi Scambio di DNA. I plasmidi coniugativi consentono lo scambio di DNA tra cellule batteriche. Resistenza agli antibiotici (plasmidi R); alcuni plasmidi codificano per proteine che degradano gli antibiotici; questo è un grande vantaggio per i microrganismi patogeni. Fattori di virulenza. Per esempio il plasmide EntP307 codifica per una tossina che rende E. coli patogeno. Capacità di degradare sostanze particolari come i composti aromatici (toluene) oppure i pesticidi (acido 2-4diclorofenossiacetico). Capacita di competere all interno del mondo microbico (plasmidi Col).

16 I ribosomi I ribosomi procariotici sono più piccoli di quelli delle cellule eucariotiche, sono definiti ribosomi 70S e sono costituiti da due subunità asimmetriche 50S e 30S. La sigla S significa "unità Svedberg" e corrisponde alla misura della velocità di sedimentazione di una particella nel campo gravitazionale di un'ultracentrifuga. Particelle più pesanti e più compatte presentano un valore S più elevato. Comunque, i valori svedberg non sono proporzionali al peso molecolare. Il peso di un ribosoma 70S eguaglia la somma dei pesi delle subunità 50S e 30S, anche se il totale tra 50 e 30 è 80 e non 70. I ribosomi eucariotici possono trovarsi liberi nel citoplasma oppure essere associati a strutture di membrane interne note come reticolo endoplasmatico. Ribosomi simili a quelli procariotici si trovano all'interno dei mitocondri e dei cloroplasti, ciò supporta la teoria dell'endosimbionte per l'evoluzione degli eucarioti.

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18 Polisomi

19 Spora batterica (endospora)

20 Spora batterica (endospora) Alcuni batteri gram+ (Bacillus Clostridium, Sporasarcina etc..) sono in grado di formare spore (endospore CARATTERISTICHE Resistenza a : Calore, UV, disinfettanti, essiccamento Rimangono vitali per oltre 500 anni. Spesso patogeni La dislocazione nella cellula madre (sporangio), differisce tra le specie.; possono essere centrali, subterminali o terminali

21 Quanto può sopravvivere un endospora? Spore batteriche risalenti a milioni di anni fa ritrovate nell intestino di un ape intrappolata in un ambra, sono state capaci di germinare e crescere. Batteri alofili isolati da cristalli di sale di inclusioni fluide risalenti a 250 milioni di anni fa (Permiano).

22 Costituenti della spora Esosporio: strato lasso che circonda la spora Tunica sporale: spessa struttura composta da strati proteici; rappresenta dal 30 al 60% del peso secco della spora ed è costituita da proteine che rappresentano l 80% delle proteine della spora; tali proteine sono molto resistenti e hanno un contenuto molto alto di cisteina e aminoacidi idrofobi. E responsabile della resistenza sporale Corteccia: formato da peptidoglicano particolare un po più lasso di quello cellulare. Può rimuovere, con un meccanismo di osmosi, l acqua dal protoplasma, fornendo così una protezione nei confronti dei danni da calore e irradiazione. Parete sporale: situata sulla faccia interna della corteccia, a circondare il nucleo (protoplasto) core (protoplasto): contiene citoplasma, ribosomi e materiale nucleare Acido dipicolinico: complessato con ioni calcio, costituisce il 15% del peso secco della spora. Si ritiene che il complesso calcio-dipicolinato stabilizzi gli acidi nucleici sporali

23 Elettromicrofotografia di una sezione sottile di una spora di Bacillus megaterium. da notare le seguenti strutture: tunica sporale, germinal groove (G) strato esterno della corteccia (OCL) e corteccia (Cx) parete del nucleo (GCW), membrana del protoplasto (PM), nucleoide (n). corteccia strato esterno della corteccia Membrana del protoplasto tunica parete del nucleo

24 Tabella 4.2 vegetative Differenze tra l endospora e cellule SASP: Small Acid-soluble Spore Protein Legano il DNA e lo proteggono da radiazioni, UV, essiccazione, calore Caracteristiche Cell. Vegetativa Endospora Aspetto microscopico Non rifrangente Rifrangente Contenuto di Ca basso alto Acido basso alto Dipicolinico Attività alto basso enzimatica Metabolismo presente basso o assente (assunzione O 2 ) Sintesi presente assente macromolecole mrna presente basso o assente Resist. calore basso alto Resistenza basso alto radiazioni Resistenza acidi basso alto agenti chimici Colorazione possibile Solo con metodi specifici Azione del sensibile resistente lisozima Contenuto H 2 O alto, 80-90% basso, 10-25% Piccole proteine assente presente acide solubili ph Citoplasma ~

25 Inizia in carenza di nutrienti Sporulazione 8 h per l intero processo Le varie tappe sono state determinate tramite l analisi di mutanti ~200 geni coinvolti Fig SASP = small acid-soluble spore proteins Cortex is composed of peptidoglycan Exosporium is a thin protein covering

26 Sporulazione di Bacillus subtilis a) crescita esponenziale b) condensazione dei nucleoidi e formazione del filamento assiale c) formazione del setto trasverso d) formazione della prespora e) spora rivestita della corteccia f) stadio terminale; oltre la corteccia è presente la tunica sporale. In alcuni casi viene formato anche l esosporio

27 Sintesi dell acido dipicolinico L acido dipicolinico si trova nella spora complessato con il calcio. Rappresenta il 15% del peso secco della spora ed è localizzato all interno del protoplasto. Si ritiene che il complesso calcio-dipicolinato sia una componente che stabilizza gli acidi nucleici sporali La presenza di dipicolinato è stata spesso messa in relazione alla termoresistenza della spora. Sicuramente ha un ruolo importante, ma non determinante. Sono stati infatti isolati mutanti termoresistenti privi di acido dipicolinico.

28 Acido Dipicolinico Fig. 4.61

29 Incrementi di rifrangenza, resistenza al calore e contenuto in dipicolinato La disidratazione del protoplasma operata dalla corteccia sembra avere un ruolo importante nell acquisizione della termoresistenza. Nella termoresistenza sono sicuramente importanti diversi fattori: la stabilizzazione esercitata dal complesso calciodipicolinato su componenti sporali come il DNA, la disidratazione del protoplasma, la maggiore stabilità delle proteine cellulari nei batteri adatti a crescere in presenza di temperature elevate e altri fattori ancora.

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31 Peptidoglicano della corteccia

32 Peptidoglicano della corteccia I legami crociati del peptidoglicano della corteccia sono molto rari. La composizione del peptidoglicano della corteccia è molto simile in specie diverse, anche quando queste hanno peptidoglicani della parete della cellula vegetativa diversi.

33 Antibiotici peptidici prodotti durante la sporulazione In molti casi la sporulazione è accompagnata dalla produzione di antibiotici peptidici. Si possono distinguere tre classi: edeine (inibiscono la sintesi del DNA) bacitracine (inibiscono la sintesi della parete cellulare) gramicidina, polimixina e tirocidina (modificano la struttura e le funzioni della membrana)

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35 Andamento nel tempo della crescita, della sintesi della bacitracina, della formazione degli sporangi e delle spore La produzione degli antibiotici peptidici avviene abbastanza precocemente nel processo di sporulazione; non partecipano alle reazioni di sintesi ne ribosomi ne trna. Nel Bacillus thuringiensis si ha la formazione di un cristallo bipiramidale con attività tossica per la larve di numerosi lepidotteri (insetticida biologico).

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37 Trasformazione delle spore quiescenti in cellule vegetative attive Il complesso processo si svolge in tre fasi: 1) attivazione: spesso la spora, anche se messa in condizioni ottimali di crescita, non è in grado di germinare. E necessaria un attivazione. esposizione a C per alcuni minuti. esposizione per lunghi periodi a bassa temperatura (5 C). condizioni di secco. Per la germinazione sono sufficienti pochi minuti

38 Trasformazione delle spore quiescenti in cellule vegetative attive 2) germinazione: è caratterizzata dal rigonfiamento della spora, riassorbimento della tunica, perdita della rifrangenza e resistenza al calore e incremento dell attività metabolica. La germinazione ha bisogno anche di uno stimolo chimico (glucosio, L-alanina, ribosidi, Ca-dipicolinato e diversi ioni inorganici). 3) esocrescita: Il protoplasma sporale sintetizza nuovi componenti, emerge dai resti della tunica sporale e si sviluppa in un batterio attivo.

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