PREMIO TESI S.I.P.I. 2012

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1 PREMIO TESI S.I.P.I Indagine sulla presenza di larve di nematodi Anisakidae in alici e sardine del Mar Adriatico settentrionale: una possibile mappatura del rischio per il consumatore Survey of the presence of anisakid nematodes larvae in anchovies and sardines from Northern Adriatic Sea in order to map the potential zoonotic risk for consumers Giuseppe Scaturro 1, Andrea Gustinelli 1, Monica Caffara 1, Marino Prearo 2, Maria Letizia Fioravanti 1* 1 Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie, Alma Mater Studiorum Università di Bologna, Ozzano Emilia (BO); 2 Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d Aosta, Torino. RIASSUNTO Gli stadi larvali (L3) dei nematodi della famiglia Anisakidae appartenenti al genere Anisakis sono parassiti zoonotici trasmessi da pesci e cefalopodi marini che ne rappresentano i principali ospiti paratenici. Il consumo accidentale di pesci crudi o poco cotti parassitati può causare malattie gastroenteriche e fenomeni allergici nell uomo. Lo scopo del presente studio è stato quello di mappare il "rischio Anisakis" nelle popolazioni di alici (Engraulis encrasicolus) e sardine (Sardina pilchardus) pescate nel Mare Adriatico settentrionale. A questo fine sono stati condotti campionamenti periodici in tre diversi areali di pesca (Cesenatico, Caorle e Rimini) raccogliendo per ogni campione i dati relativi alle coordinate geografiche di pesca, alla distanza dalla costa e alla batimetria. Da novembre 2010 a febbraio 2012, pesci sono stati campionati e sottoposti ad esami parassitologici volti ad individuare ed identificare larve di nematodi Anisakidae. Sono stati determinati i valori di prevalenza, intensità media e abbondanza media. Nelle alici è stata rilevata una prevalenza totale del 23,4% per Hysterothylacium sp. e dello 0,2% per Anisakis sp., mentre per quanto riguarda le sardine è stata riscontrata una positività per Hysterothylacium sp. del 30,2% e per Anisakis sp. dello 0,2%.Tutte le larve di anisakidi rinvenute sono risultate vitali ed erano sempre localizzate a livello viscerale. Le larve di Anisakis isolate sono state identificate sulla base delle caratteristiche morfologiche come appartenenti al "tipo I" e mediante analisi molecolari come A. pegreffii, ad eccezione di una larva identificata come ibrido A. pegreffii/a. simplex. Le larve del genere Hysterothylacium sono risultate tutte appartenenti alla specie H. aduncum. I risultati di questa ricerca hanno evidenziato valori di prevalenza ed intensità media molto bassi per Anisakis sia in alici che sardine provenienti da zone di pesca del Mar Adriatico nord-occidentale, diversamente da quanto osservato in altri areali di pesca del medio e basso Adriatico. Nel lavoro i risultati vengono discussi prendendo in considerazione i diversi fattori ambientali, ecologici e idrogeografici che possono influenzare le infestazioni da larve Anisakidae in alici e sardine pescate in diversi areali geografici. SUMMARY - Anisakis spp. larvae (L3) are parasitic and potentially zoonotic nematodes transmitted by marine fish and cephalopods, which are the main paratenic hosts of the third larval stage. The accidental consumption of infected raw or undercooked fish may cause gastroenteric diseases and allergies in humans. The aim of the present study was to map the "Anisakis risk" in populations of anchovies (Engraulis encrasicolus) and sardines (Sardina pilchardus) caught in the northern Adriatic Sea. For this purpose, periodic samples were carried out in three different fishing areas (Cesenatico, Caorle and Rimini) collecting data on geographic coordinates, distance from the coast and bathymetric depth for each sample. From November 2010 to February 2012 a total of 3287 fish were sampled and subjected to parasitological exams aimed at detect and identify Anisakidae larvae. Prevalence, mean intensity and mean abundance were determined. An overall prevalence of 23.4% for Hysterothylacium sp. and of 0.2% for Anisakis sp. was detected in anchovies, while 30.2% of sardines resulted positive for Hysterothylacium sp. and 0.2% for Anisakis sp. respectively. The anisakid larvae were always found viable in the body cavity. All the isolated Anisakis larvae were identified as type I on the basis of morphological features. Molecular analyses allowed to identify them as A. pegreffii, with the exception of a specimen identified as a hybrid A. pegreffii/a. simplex, and to ascribe all the Hysterothylacium larvae to the species H. aduncum. The results of this survey showed very low values of prevalence and mean intensity of 25

2 Anisakis larvae both in anchovies and sardines from north-western Adriatic Sea fishing grounds. Considerations on different environmental, ecological and hydrogeographical factors influencing anisakid infections in anchovies and sardines caught in different marine areas are given. Key Words: Anisakidae; Larvae; Anisakis sp.; Hysterothylacium sp.; anchovy; Engraulis encrasicolus; sardine; Sardina pilchardus; Northern Adriatic Sea; Italy. * Corresponding Author: c/o Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie, Alma Mater Studiorum Università di Bologna, Via Tolara di sopra, Ozzano Emilia (BO); Tel ; Fax: ; marialeti.fioravanti@unibo.it.. INTRODUZIONE L Anisakiasi è una zoonosi parassitaria di origine ittica sostenuta da stadi larvali di nematodi della famiglia Anisakidae appartenenti al genere Anisakis. Questi parassiti presentano un ciclo biologico molto complesso all interno del quale pesci teleostei marini e cefalopodi si inseriscono come ospiti paratenici, i crostacei come ospiti intermedi ed i mammiferi marini come ospiti definitivi idonei (Audicana & Kennedy, 2008). L uomo può rappresentare un ospite accidentale qualora dovesse assumere le larve del parassita in seguito al consumo di pesci o cefalopodi parassitati crudi, poco cotti o sottoposti a preparazioni a rischio (es. marinatura o affumicatura a freddo) che non sono in grado di devitalizzare il parassita. Sebbene le larve nell ospite umano vadano incontro a morte nel giro di poche ore o pochi giorni, talvolta riescono a penetrare nella mucosa gastrica o intestinale, causando sindromi di tipo invasivo e/o allergico di intensità variabile (Lymbery & Cheah, 2007). La crescente importanza dell Anisakiasi quale zoonosi parassitaria ha indotto l EFSA ad emettere nel 2010 il documento Scientific opinion on risk assessment of parasites in fishery products (EFSA, 2010), dove si raccomanda di incrementare la raccolta di dati epidemiologici su scala europea al fine di fornire una migliore comprensione dell impatto delle infestazioni ittiche da larve di Anisakis (in particolare A. simplex) sulla salute umana. Inoltre nei Regolamenti CE che compongono il cosiddetto Pacchetto Igiene, oltre all indicazione dei trattamenti di bonifica da effettuare sui prodotti ittici da consumare sotto forma di preparazioni a rischio per ridurre il pericolo di trasmissione all uomo, si evidenzia la possibilità di andare in deroga a tali trattamenti, con indubbi vantaggi di ordine economico, qualora esistano riscontri epidemiologici a supporto dell assenza di questi parassiti zoonotici in determinati areali di pesca. Nei casi di Anisakiasi umana descritti in Italia fino ad oggi, l anamnesi dei pazienti riportava sempre il frequente o recente consumo di pesce crudo e, in particolare, di alici e/o sardine marinate, piatto tradizionale diffuso soprattutto negli areali costieri nazionali e spesso oggetto di preparazioni casalinghe su cui non viene applicato il congelamento preventivo del prodotto, trattamento previsto altrimenti dalla normativa vigente. 26

3 Sebbene in Italia siano state effettuate numerose indagini sulla diffusione di larve di nematodi anisakidi in specie ittiche d interesse commerciale, la maggior parte di questi studi si è limitata a raccogliere informazioni su campioni prelevati al mercato, senza precise indicazioni sugli areali di pesca e spesso utilizzando campioni di scarso peso statistico senza effettuare quindi una vera e propria mappatura degli areali di pesca al fine di ottenere una georeferenziazione del rischio Anisakis come raccomandato dall EFSA (2010). Obiettivo principale di questa tesi è stato quello di definire il rischio Anisakis in popolazioni di alici e sardine pescate nel Mar Adriatico settentrionale, conducendo campionamenti periodici in areali di pesca di cui venivano rilevati coordinate geografiche, distanza dalla costa e batimetria. MATERIALI E METODI Da novembre 2010 a febbraio 2012, un totale di alici e sardine è stato campionato e sottoposto ad esame parassitologico rivolto specificatamente alla ricerca di larve Anisakidae. Ogni campione, costituito da almeno 150 esemplari di ciascuna specie, veniva prelevato con cadenza trimestrale o quadrimestrale direttamente dalle imbarcazioni di pesca al loro arrivo presso i mercati ittici di Cesenatico, Caorle e Rimini. Nella tabella 1 è riportato il totale dei soggetti esaminati per località e specie ittica. Provenienza Specie ittica Alice Sardina Cesenatico Caorle Rimini TOTALE Tabella 1 - Numero totale di alici e sardine campionate a Cesenatico (FC), Caorle (VE) e Rimini (RN). Table 1 - Total number of anchovies and sardines sampled in Cesenatico (Forlì-Cesena Province), Caorle (Venice Province) and Rimini (Rimini Province). Per ciascun campione venivano rilevate, al momento della pesca, le coordinate geografiche per mezzo del GPS in dotazione all imbarcazione di pesca, la distanza dalla costa e la batimetria. Nella figura 1 sono indicate le località di campionamento di alici e sardine. 27

4 Figura 1 - Località di campionamento (Cao = Caorle; Ces = Cesenatico; Rim = Rimini). Figure 1 Sampling sites (Cao = Caorle; Ces = Cesenatico; Rim = Rimini). Nelle tabelle 2, 3 e 4 vengono riportati nel dettaglio i dati relativi ai campioni esaminati nel corso dell indagine. Cesenatico Ces1 Ces2 Ces3 Ces4 Ces5 Ces6 Ces7 Ces8 Data 04/11/10 17/11/10 17/11/10 02/03/11 02/03/11 08/06/11 08/06/11 22/06/11 Specie Alice Alice Sardina Sardina Alice Alice Sardina Sardina N. esaminati Lunghezza cm (min-max) 9, ,5 11, ,5 9, Longitudine N N N N N N N N Latitudine E E E E E E E E Batimetria (m) Distanza dalla costa (NM) 4, ,6 5,6 13,7 15,3 8,1 Tabella 2 - Campioni di alici e sardine prelevati a Cesenatico con indicazione di data di pesca, entità numerica, lunghezza, coordinate geografiche, batimetria (m = metri) e distanza dalla costa (NM = miglia nautiche). Table 2 - Samples of anchovies and sardines from Cesenatico with sampling date, number of fish, length, geographical coordinates, bathymetry (m = meters) and distance from the coast (NM = nautical miles). 28

5 Caorle Cao1 Cao2 Cao3 Cao4 Cao5 Cao6 Data 11/11/10 11/11/10 02/02/11 09/02/11 06/05/11 06/05/11 Specie Alice Sardina Sardina Alice Alice Sardina N. esaminati Lunghezza cm (min-max) 10, ,5 10, ,5-14,5 12,5-17 Longitudine N N N N N N Latitudine E E E E E E Batimetria (m) Distanza dalla costa (NM) 3,6 3, ,6 8,6 Tabella 3 - Campioni di alici e sardine prelevati a Caorle con indicazione di data di pesca, entità numerica, lunghezza, coordinate geografiche, batimetria (m = metri) e distanza dalla costa (NM = miglia nautiche). Table 3 - Samples of anchovies and sardines from Caorle with sampling date, number of fish, length, geographical coordinates, bathymetry (m = meters) and distance from the coast (NM = nautical miles). Rimini Rim1 Rim2 Rim3 Rim4 Data 12/10/11 12/10/11 17/02/12 17/02/12 Specie Alice Sardina Alice Sardina N. esaminati Lunghezza cm (min-max) 9, ,5-15, Longitudine N N N N Latitudine E E E E Batimetria (m) Distanza dalla costa (NM) Tabella 4 - Campioni di alici e sardine prelevati a Rimini con indicazione di data di pesca, entità numerica, lunghezza, coordinate geografiche, batimetria (m = metri) e distanza dalla costa (NM = miglia nautiche). Table 4 - Samples of anchovies and sardines from Rimini with sampling date, number of fish, length, geographical coordinates, bathymetry (m = meters) and distance from the coast (NM = nautical miles). I pesci, una volta prelevati allo sbarco, venivano trasportati in laboratorio all interno di appositi contenitori refrigerati al fine di mantenere una temperatura idonea alla loro conservazione. All arrivo presso il Laboratorio di Ittiopatologia del Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie, i pesci venivano misurati considerando la lunghezza totale dall estremità anteriore al termine della pinna caudale e successivamente sottoposti ad esame parassitologico per la ricerca di larve di nematodi Anisakidi. Dopo un esame visivo della superficie esterna, si passava all apertura della cavità addominale e ad un esame visivo della stessa. Si procedeva poi all asportazione del pacchetto viscerale da ogni soggetto. Il pacchetto viscerale veniva posto in capsula petri con soluzione fisiologica (0,85% NaCl) e, dopo aver atteso circa 15 minuti per 29

6 consentire la eventuale mobilizzazione delle larve, veniva attentamente esaminato, talvolta con l ausilio dello stereo microscopio. Si procedeva quindi alla sfilettatura del muscolo laterale per mezzo di un bisturi ed all ispezione delle porzioni muscolari in buone condizioni di luminosità, talvolta previo schiacciamento tra vetri compressori e quando ritenuto opportuno con l ausilio del transilluminatore. I parassiti riferibili a nematodi Anisakidi venivano isolati, contati, esaminati in via preliminare allo stereo microscopio e fissati in alcool etilico 70 al fine di ottenerne un ottimale conservazione. Tutti i dati reperiti nel corso delle operazioni appena descritte venivano annotati in apposite schede approntate per questo progetto contenenti le informazioni relative alla specie, alla data dell esame, al sito di provenienza del campione, alla lunghezza di ogni singolo pesce ed al numero di parassiti rilevati. Inoltre per ogni parassita reperito veniva annotata la localizzazione (cavità addominale o porzione muscolare), le dimensioni, distinguendo tra larve grandi se di lunghezza superiore ad 1 cm e larve piccole se di lunghezza inferiore e la vitalità. L identificazione degli stadi larvali dei nematodi reperiti è stata condotta a livello di genere mediante osservazione microscopica, previa chiarificazione con lattofenolo di Amman (fenolo 10 g + glicerolo 10,6 ml + acido lattico 8,2 ml + acqua distillata 10 ml) e studio morfologico, seguendo gli schemi classificativi tratti da Berland (1961), Möller & Anders (1986) e Moravec (1994). Le caratteristiche morfologiche considerate utili all identificazione del genere parassitario di appartenenza sono state le seguenti: - dimensioni del corpo; - conformazione del ventricolo; - presenza o meno dell appendice ventricolare; - presenza o meno del cieco intestinale; - localizzazione del poro escretore; - presenza e morfologia del mucrone. Per quanto riguarda il calcolo dei dati quantitativi di infestazione, quali prevalenza (P), intensità (I), intensità media (IM) ed abbondanza media (A), ci siamo basati sul lavoro di Bush et al. (1997). Il Test χ 2 è stato utilizzato per valutare l esistenza di una possibile differenza significativa tra le prevalenze osservate nelle diverse classi di taglia di alici (<11 e >11 cm) e sardine (<13,5 e >13,5 cm). Sono stati considerati significativi valori p<0,05. RISULTATI Delle alici esaminate, 401 (23,6%) sono risultate positive per larve di nematodi anisakidi ed in particolare il 23,4% per Hysterothylacium sp. e lo 0,2% per Anisakis sp. Delle sardine esaminate, 484 (30,4%) sono risultate positive per larve di nematodi anisakidi ed in particolare il 30,2% per Hysterothylacium sp. e lo 0,2% per Anisakis sp. 30

7 Vengono di seguito riportati nel dettaglio i risultati ottenuti dalla ricerca di larve di nematodi Anisakidi in alici e sardine in rapporto al periodo di campionamento ed alle diverse zone di pesca (Tabelle 5, 6 e7). Cesenatico Ces1 Ces2 Ces3 Ces4 Ces5 Ces6 Ces7 Ces8 Data 04/11/10 17/11/10 17/11/10 02/03/11 02/03/11 08/06/11 08/06/11 22/06/11 Specie Alice Alice Sardina Sardina Alice Alice Sardina Sardina 49/309 11/200 10/200 95/172 35/160 9/150 37/150 30/159 N. pos./esaminati (%) (15,8%) (5,5%) (5%) (55,2%) (21,9%) (6%) (24,6%) (18,9%) N. pos Hysterothylacium (%) (15,8%) (5,5%) (5%) (55,2%) (21,9%) (6%) (24%) (18,2%) Intensità media 1,5 1,18 7,4 3,44 1,6 1,1 1,24 1,73 (I min-max) (1-5) (1-2) (1-60) (1-38) (1-8) (1-2) (1-4) (1-10) Abbondanza media 0,24 0,065 0,37 1,9 0,35 0,06 0,31 0,32 (A) 1 1 N. pos. Anisakis (%) (0,6%) (0,6%) Intensità media (I min-max) (1) (1) Abbondanza media ,006 0,006 (A) Tabella 5 - Risultati della ricerca di larve di nematodi Anisakidi in alici e sardine pescate a Cesenatico con indicazione della prevalenza, dell intensità media (intensità min-max) ed abbondanza media. Table 5 - Occurrence of Anisakid nematode larvae in anchovies and sardines from Cesenatico with values of prevalence, mean intensity (intensity min-max) and mean abundance. Per quanto riguarda le 819 alici provenienti da Cesenatico, 104 sono risultate positive per la presenza di larve di nematodi Anisakidi con una prevalenza totale del 12,7% ed un intensità media di 1,47 larve per pesce, con un minimo di 1 ed un massimo di 8 larve per ospite. Tutte le larve riscontrate appartenevano al genere Hysterothylacium. Invece per quanto concerne le sardine pescate negli areali di Cesenatico, su un totale di 681 soggetti esaminati, in 172 è stata riscontrata la presenza di larve Anisakidi con una prevalenza totale del 25,2% ed un intensità media di 2,9 larve per pesce, con un minimo di 1 ed un massimo di 60 larve per ospite. Due esemplari (0,3%) sono risultati positivi per larve di Anisakis sp. (1 larva/soggetto) e 170 (25%) per larve di Hysterothylacium sp. (1-60 larve/ospite). 31

8 Caorle Cao1 Cao2 Cao3 Cao4 Cao5 Cao6 Data 11/11/10 11/11/10 02/02/11 09/02/11 06/05/11 06/05/11 Specie Alice Sardina Sardina Alice Alice Sardina N. pos./esaminati (%) 54/200 21/ / /157 71/150 79/150 (27%) (10,5%) (55%) (70,1%) (47%) (52,6%) N. pos. Hysterothylacium (%) 54 (27%) 21 (10,5%) 110 (55%) 110 (70,1%) 71 (47%) 79 (52,6%) Intensità media (I min-max) 2,72 (1-20) 1,05 (1-2) 2,3 (1-8) 2,68 (1-11) 1,84 (1-6) 2,7 (1-23) Abbondanza media (A) 0,73 0,11 1,26 1,88 0,87 1,45 N. pos. Anisakis (%) Intensità media (I min-max) Abbondanza media (A) Tabella 6 - Risultati della ricerca di larve di nematodi Anisakidi in alici e sardine pescate a Caorle con indicazione della prevalenza, dell intensità media (intensità min-max) ed abbondanza media. Table 6 - Occurrence of Anisakid nematode larvae in anchovies and sardines from Caorle with values of prevalence, mean intensity (intensity min-max) and mean abundance. Delle 507 alici campionate a Caorle, 235 sono risultate positive per la presenza di larve Anisakidae, con una prevalenza totale del 46,3% ed un intensità media di 2,43 larve per pesce, con un minimo di 1 ed un massimo di 20 larve/pesce. Tutte le larve di nematodi riscontrate nelle alici provenienti da Caorle sono state identificate come Hysterothylacium sp. Delle 550 sardine provenienti da areali antistanti Caorle, invece, sono risultati positivi per larve di nematodi anisakidi 210 soggetti, con una prevalenza del 38,2% ed un intensità media di 2,34 larve per soggetto, con un minino di 1 ed un massimo di 23 larve/ospite. Tutte le larve rinvenute appartenevano al genere Hysterothylacium. Rimini Rim1 Rim2 Rim3 Rim4 Data 12/10/11 12/10/11 17/02/12 17/02/12 Specie Alice Sardina Alice Sardina N. pos./esaminati (%) N. pos. Hysterothylacium (%) Intensità media (I min-max) 23/200 (11,5%) 22 (11%) 1,21 (1-3) 47/200 (23,5%) 47 (23,5%) 1,25 (1-3) 39/170 (22,9%) 37 (21,8%) 1,38 (1-5) 55/160 (34,3%) 54 (33,7%) 2,25 (1-19) Abbondanza media (A) 0,14 0,3 0,31 0,77 N. pos. Anisakis (%) Intensità media (I min-max) 1 (0,5%) 1 (1) (1,17%) 1 (1) 1 (0,6%) 1 (1) Abbondanza media (A) 0, ,01 0,006 Tabella 7 - Risultati della ricerca di larve di nematodi Anisakidi in alici e sardine pescate a Rimini con indicazione della prevalenza, dell intensità media (intensità min-max) ed abbondanza media. Table 7 - Occurrence of Anisakid nematode larvae in anchovies and sardines from Rimini with values of prevalence, mean intensity (intensity min-max) and mean abundance. 32

9 Per quanto concerne i campioni provenienti da Rimini, su 370 alici, 62 (16,7%) sono risultate positive per la presenza di larve di nematodi anisakidi, con un intensità media di 1,32 larve (da un minimo di 1 ad un massimo di 5 larve/ospite). Larve di Anisakis sp. sono state reperite in 3 esemplari (0,8% - 1 larva/ospite) mentre larve di Hysterothylacium sp. sono state osservate in 59 soggetti (16% larve/ospite). Delle 360 sardine provenienti da Rimini, 103 (28,6%) sono risultate positive per nematodi anisakidi con un intensità media di 1,79 larve (da un minimo di 1 ad un massimo di 19 larve/ospite); in particolare 1 esemplare di sardina (0,3%) è risultato parassitato da un unica larva di Anisakis sp. e 102 (28,3%) da larve di Hysterothylacium sp. (1-19 larve/ospite). Analizzando i dati in relazione alla specie ittica possiamo osservare come le alici provenienti da Caorle abbiano mostrato prevalenze maggiori (46,3%) rispetto a quelle provenienti da Cesenatico (12,7%) e da Rimini (16,7%), ma sempre e solo per larve di Hysterothylacium. Fanno eccezione 3 esemplari di alice pescati a Rimini in cui è stata rinvenuta una larva di Anisakis/ospite. Anche per quanto riguarda le sardine, le prevalenze riscontrate nei soggetti provenienti da Caorle (38,2%) sono risultate superiori rispetto a quelle rilevate nelle sardine provenienti da Cesenatico (25,2%) e da Rimini (28,6%), ma anche in questo caso la percentuale di positività era ascrivibile esclusivamente a larve di Hysterothylacium sp. La presenza di larve di Anisakis sp. (1 larva/ospite) è stata rilevata solo in due esemplari pescati a Cesenatico e in un soggetto pescato a Rimini, mentre in tutte le altre sardine pescate negli areali di Cesenatico e Rimini le larve sono risultate sempre appartenere al genere Hysterothylacium. In totale nel corso dell indagine sono state reperite 6 larve di Anisakis sp. in 3 sardine (0,2%) ed in 3 alici (0,2%), con un intensità pari a 1. Per quanto concerne l andamento dei valori di prevalenza per larve di nematodi Anisakidae in relazione ai diversi mesi di indagine, nelle tabelle 8 e 9 vengono riportate le percentuali di positività riscontrate rispettivamente in alici e sardine pescate nelle diverse località prese in considerazione. Prevalenza di larve Anisakidae in alici nei diversi mesi di campionamento Provenienza Mesi d indagine N alici Soggetti positivi % di positività 11/ ,8 Cesenatico 03/ ,9 06/ / Caorle 02/ / Rimini 10/ ,5 02/ ,5 Tabella 8 - Percentuali di positività per larve di nematodi Anisakidae riscontrati nelle alici in relazione a località e mese di campionamento. Table 8 - Percentage of positivity for Anisakid nematode larvae found in anchovies with regard to sampling sites and sampling months. 33

10 Prevalenza di larve Anisakidae in sardine nei diversi mesi di campionamento Provenienza Mesi d indagine N alici Soggetti positivi % di positività 11/ Cesenatico 03/ ,2 06/ ,7 11/ ,5 Caorle 02/ / ,6 Rimini 10/ ,5 02/ ,3 Tabella 9 - Percentuali di positività per larve di nematodi Anisakidae riscontrati nelle sardine in relazione a località e mese di campionamento. Table 9 - Percentage of positivity for Anisakid nematode larvae found in sardines with regard to sampling sites and sampling months. Le percentuali di positività delle alici per larve del genere Anisakis sono state evidenziate soltanto nell areale di pesca di Rimini in entrambi i mesi di campionamento (ottobre e febbraio), sempre con intensità pari a 1 larva/ospite, mentre la positività delle sardine per larve di Anisakis sp. è stata evidenziata a Cesenatico nel mese di giugno ed a Rimini nel mese di febbraio. Anche nel caso delle sardine si è osservata un intensità d infestazione pari a 1 larva/ospite. Nel complesso si è osservata coinfestazione da larve di Hysterothylacium e di Anisakis solo nei due soggetti di sardina provenienti da Cesenatico, mentre negli altri casi di positività per Anisakis non si è riscontrata la concomitante presenza di larve di Hysterothylacium. Per quanto concerne la presenza di larve di Anisakis sp. in relazione a distanza dalla costa e profondità del fondale, si è riscontrato come gli esemplari di alice e sardina positivi fossero stati pescati, a parte un unica eccezione, in località di pesca ad oltre 15 miglia nautiche dalla costa e a profondità >30 metri (Tabella 10). Località Distanza dalla costa (NM) Batimetria (m) Specie ittica Ces7 15,3 54 Sardina (1 soggetto) Ces8 8,1 15 Sardina (1 soggetto) Rim1 15,3 55 Alice (1 soggetto) Rim3 21,8 32 Alice (2 soggetti) Rim4 21,8 32 Sardina (1 soggetto) Tabella 10 - Distanza dalla costa e batimetria relative ai siti di pesca dove alici e sardine sono risultate positive per larve di Anisakis sp. (NM = miglia nautiche). Table 10 - Distance from the coast and bathymetry of sampling sites where anchovies and sardines were found positive for Anisakis sp. larvae (NM = nautical miles). 34

11 Tutte le larve rinvenute apparivano vitali ed erano localizzate a livello della cavità corporea. Nei soggetti esaminati non sono mai state reperite larve anisakidi nel tessuto muscolare. Analizzando le percentuali di positività per larve di nematodi anisakidi nelle due specie ittiche suddivise per taglia, si può osservare come i valori di prevalenza, intensità media ed abbondanza abbiano mostrato valori molto diversi (Tabella 11), con una differenza significativa tra le prevalenze osservate nelle diverse classi di taglia (p<0,001). Specie ittica Alice Sardina Taglia N. esaminati Prevalenza (%) Intensità media Abbondanza (min-max) media < (8,4%) 1,35 (1-4) 0,11 > (35,3%) 2,16 (1-20) 0,76 <13, (17,7%) 1,92 (1-60) 0,34 >13, (39,9%) 2,6 (1-38) 1,07 Tabella 11 - Valori di prevalenza, intensità media (intensità min-max) ed abbondanza media di larve di nematodi Anisakidae riscontrate in alici e sardine in relazione alla taglia. Table 11 - Prevalence, mean intensity (intensity min-max) and mean abundance of Anisakid nematode larvae found in anchovies and sardines with regard to the size. Va evidenziato in particolare come le larve di Anisakis sp. fossero presenti solo in 3 soggetti di alice di lunghezza >11 cm ed in 3 soggetti di sardina >13,5 cm. Le 6 larve di Anisakis reperite nel corso di questa ricerca sono state tutte riferite, in base ai caratteri morfologici, ad Anisakis sp. tipo I (Figura 2). L identificazione molecolare dei nematodi Anisakidi reperiti nel corso di questa ricerca è stata eseguita dal Dott. Menconi Vasco nell ambito di una tesi sperimentale dal titolo Caratterizzazione molecolare di stadi larvali di nematodi Anisakidae isolati da pesce azzurro del Mare Adriatico (Laurea Magistrale in Biotecnologie Animali, A.A. 2010/2011, Università di Bologna). Visto l elevato numero di nematodi anisakidi ritrovati, è stata eseguita l identificazione molecolare solo di un campione statisticamente significativo di esemplari morfologicamente riferiti al genere Hysterothylacium, mentre per le larve classificate morfologicamente come appartenenti al genere Anisakis è stata eseguita l identificazione molecolare di tutti gli esemplari recuperati. In base ai risultati delle analisi molecolari, le larve del genere Hysterothylacium (Figura 3) sono risultate tutte appartenenti alla specie H. aduncum, mentre dei sei nematodi del genere Anisakis, cinque sono stati identificati come A. pegreffii ed uno è risultato essere un ibrido A. pegreffii/a. simplex. 35

12 ITTIOPATOLOGIA, 2013, 10: D P V b) a) M c) Figura 2 - Larva di Anisakis sp. tipo I: a) estremità anteriore con dente perforatore (D) e poro escretore (P); b) ventricolo retto (V) con inserzione obliqua nell intestino; c) estremità caudale dotata di mucrone (M). Figure 2 - Larva of Anisakis sp. type I: a) anterior end with boring tooth (D) and excretory pore (P); b) straight and simple ventricle (V) with oblique insertion in the intestine; c) posterior end with mucron (M). D CI CI a) b) c) AV M V P d) CI e) Figura 3 - Larva di Hysterothylacium sp.: a e b) esemplari in toto (freccia: cieco intestinale, CI); c) estremità anteriore con dente perforatore (D); d) porzione anteriore con poro escretore (P) arretrato; e) cieco intestinale (CI), ventricolo (V) e appendice ventricolare (AV); f) estremità caudale dotata di mucrone (M). Figure 3 - Larva of Hysterothylacium sp.: a and b) in toto specimens (arrow: intestinal cecum, CI); c) anterior end with boring tooth (D); d) anterior tract with excretory pore (P); e) intestinal cecum (CI), ventricle (V) and ventricular appendix (AV); f) posterior end with mucron (M). 36 f)

13 DISCUSSIONE Numerosi sono i dati epidemiologici disponibili sulla diffusione di larve della famiglia Anisakidae in diverse specie ittiche dei mari nazionali, anche se solo negli ultimi anni l attenzione delle ricerche si è focalizzata in modo più specifico sui piccoli clupeiformi, quali alici e sardine, che vengono spesso consumati sotto forma di preparazioni a crudo e rappresentano quindi una potenziale fonte di infestazione per il consumatore. In linea generale, per quanto concerne gli studi condotti sulla diffusione di larve anisakidi in alici e sardine del Mar Mediterraneo, i risultati hanno evidenziato una notevole variabilità in relazione ai siti di campionamento. Riassumiamo nelle seguenti tabelle (Tabelle 12 e 13), quanto riscontrato dagli studi effettuati da diversi autori, incentrando l attenzione sulla situazione epidemiologica nel Mar Adriatico ed inserendo a titolo comparativo i risultati ottenuti con le ricerche oggetto di questa tesi. PREVALENZA DI LARVE ANISAKIDAE IN ALICI DEL MAR ADRIATICO AUTORE Percentuale di N. ALICI Percentuale di positività per ESAMINA- PERIODO positività per Hysterothylacium TE Anisakis sp. sp. PROVENIENZA 101 0% 8% Chioggia Losito et al., 6/ /2002 0% 60% Pedaso 175 0% 25% Mola di Bari Fioravanti et 6/ al., / ,7% 4,1% Medio Adriatico ,9% 0,2% Cesenatico % 7,8% Ancona Fioravanti et 181 6/ ,9% 3,9% Giulianova al., / ,9% 3,5% Vasto 843 9,8% 0% Manfredonia 25 8% 0% Taranto Ciccarelli et 7/ al., /2006 1,2% 4,79% Medio Adriatico Ricerche ,7% 0% Cesenatico 10/2009- oggetto della / ,3% 0% Caorle presente tesi ,9% 0,8% Rimini Tabella 12 - Dati epidemiologici sulla prevalenza di larve di nematodi Anisakidae in alici del Mar Adriatico (fonti bibliografiche e risultati delle ricerche oggetto della presente tesi). Table 12 - Epidemiological data on prevalence of nematode Anisakid larvae in anchovies of Adriatic Sea (bibliographic references and results of this research). 37

14 PREVALENZA DI LARVE ANISAKIDAE IN SARDINE DEL MAR ADRIATICO N. Percentuale di Percentuale di SARDINE positività per AUTORE PERIODO positività per PROVENIENZA ESAMINA- Hysterothylacium Anisakis sp. TE sp. Fioravanti et al., 2003 Fioravanti et al., 2006 Ricerche oggetto della presente tesi 360 6/ / ,9% 3,1% Medio Adriatico ,5% 0% Cesenatico ,7% 0,3% Ancona 6/ / ,9% 0% Giulianova ,3% 0,2% Manfredonia 32 0% 0% Taranto ,9% 0,3% Cesenatico 10/ / ,2% 0% Caorle 28,3% 0,3% Rimini Tabella 13 - Dati epidemiologici sulla prevalenza di larve di nematodi Anisakidae in sardine del Mar Adriatico (fonti bibliografiche e risultati delle ricerche oggetto della presente tesi). Table 13 - Epidemiological data on prevalence of nematode Anisakid larvae in sardines of Adriatic Sea (bibliographic references and results of this research). I risultati conseguiti con la presente ricerca hanno evidenziato in generale una bassissima prevalenza di Anisakis in alici (0,2%) e sardine (0,2%) pescate in areali di pesca dell Adriatico nord-occidentale, confermando quanto già ipotizzato da altri autori sulla bassa circolazione di nematodi Anisakidae del genere Anisakis nelle popolazioni di piccoli clupeiformi presenti lungo le zone nazionali costiere dell Adriatico settentrionale. In particolare la presenza di Anisakis non è stata evidenziata a Caorle, mentre gli areali di Cesenatico e Rimini sono risultati positivi per Anisakis seppur con bassi valori di prevalenza pari a 0,1% e 0,5% rispettivamente. E stata inoltre evidenziata una bassa intensità di larve di Anisakis sp. sia nelle alici (1 larva/ospite) che nelle sardine (1 larva/ospite), come già osservato nel corso di indagini condotte in precedenza sugli stessi ospiti (Fioravanti et al., 2003; Anastasio et al., 2009). Il numero sempre basso di larve di Anisakis/ospite sarebbe da ricondurre in termini generali all attitudine zooplanctofaga di queste specie ittiche, che comporterebbe un loro coinvolgimento nel ciclo biologico di Anisakis solo al livello post-crostaceo, ingerendo le larve L3 contenute nei crostacei ospiti intermedi. Pur potendo essere considerati a tutti gli effetti ospiti paratenici, le alici e le sardine non avrebbero quindi la capacità, tipica dei pesci predatori, di accumulare grandi quantità di larve nel proprio organismo ingerendo un numero elevato di prede ittiche già parassitate da larve di Anisakis sp. Rispetto alle indagini condotte in passato nel Mar Adriatico, le ricerche oggetto di questa tesi hanno voluto raccogliere informazioni sui dati quantitativi relativi alla 38

15 infestazione da larve Anisakidi in alici e sardine dell alto Adriatico parallelamente al rilievo dei dati geografici relativi al sito di pesca, in particolare coordinate geografiche, distanza dalla costa e profondità del fondale, in modo da fornire indicazioni precise sul rischio Anisakis in relazione all areale di pesca, come suggerito dalle raccomandazioni EFSA (2010) e indicato nel Pacchetto Igiene. Una mappatura georeferenziata della diffusione di Anisakis in relazione a specie ittica ed area di pesca potrebbe infatti essere molto importante ai fini ispettivi e commerciali permettendo di definire con più precisione il rischio o l assenza di rischio zoonosico correlabile al consumo di preparazioni a rischio quali tipicamente le alici o le sardine marinate. I dati da noi ottenuti, che confermano una scarsa circolazione di Anisakis nelle popolazioni di alici e sardine del Mar Adriatico nord-occidentale, potrebbero essere posti in relazione con le condizioni idrogeografiche del Mar Adriatico il quale può essere diviso in due fasce, una orientale ed una occidentale ed in tre zone, settentrionale, centrale e meridionale anche grazie alla presenza della fossa Jabuka, che divide il nord dal centro e del trench del sud Adriatico, che divide il centro dal sud. La zona nord-occidentale è caratterizzata dalla presenza di acque eutrofiche e poco profonde (<50 m), molto influenzate dalle immissioni fluviali ed in particolar modo dagli effluenti del Po, che rendono le acque poco saline, ma ricche di alimento, permettendo la formazione di zone di risalita dove si concentra il plancton quando le acque fredde e poco saline settentrionali incontrano quelle più calde e salate del centro. La zona centrale e quella meridionale presentano acque più profonde (>75 m) ed oligotrofiche, influenzate dagli scambi col Mar Ionio (Bembo et al., 1996). Inoltre gli stessi dati possono essere posti in relazione anche con le conoscenze riguardanti la struttura delle popolazioni e l ecologia di sardine e alici nel Mar Adriatico. Sarebbero infatti presenti distinte popolazioni (nel caso delle alici con strutturazione anche su base genetica, nelle sardine solo su base ecologicoambientale) (Bembo et al., 1996; Tinti et al., 2002) negli areali del nord Adriatico ed in quelli dell Adriatico centro-meridionale (indicativamente a sud di Ancona). La fossa ed il trench sembrerebbero quindi agire da barriere nei confronti di fenomeni di migrazione di diverse popolazioni di alici e sardine. Questo porterebbe alla formazione di due stock separati, distinguibili anche per la presenza di caratteri fenotipici e meristici diversi, negli areali adriatici settentrionali ed in quelli centromeridionali, suddivisione supportata anche da differenti flussi migratori e diverse aree di riproduzione. Di conseguenza gli stock settentrionali, poco parassitati da Anisakis, sarebbero distinti rispetto a quelli delle zone centro meridionali che invece presentano, in base ai dati esistenti in letteratura, prevalenze maggiori per questo parassita. In linea generale la strutturazione in sottopopolazioni sembra essere connessa a fattori quali le condizioni idrogeografiche e le condizioni ecologiche presenti nelle diverse zone, quali in particolare temperatura, salinità e disponibilità di cibo (Betulla Morello & Arnieri, 2009). Similmente, anche le variazioni quantitative dell infestazione dei parassiti Anisakidae non solo tra le diverse specie ittiche, ma anche nell ambito della stessa 39

16 specie, sembrano essere fortemente legate alle condizioni eco-ambientali ed alle attitudini trofiche dell ospite. Ad esempio, come accennato già in precedenza, a seguito delle loro abitudini alimentari i pesci predatori sono più predisposti ad accumulare larve di Anisakis al loro interno, mentre alici e sardine, prevalentemente planctofaghe, ingerendo copepodi quale alimento principale si espongono più frequentemente all assunzione di Hysterothylacium sp., presentando prevalenze ed intensità più elevate per questo parassita rispetto a quelle per Anisakis sp. Nel ciclo biologico di Hysterothylacium sp. i crostacei copepodi rappresenterebbero infatti ospiti intermedi idonei, anche se sperimentalmente è stato dimostrato che le larve di H. aduncum sono in grado di infestare molte specie di invertebrati (Køie, 1993). Sono state documentate inoltre infezioni naturali da parte di larve di H. aduncum sia in invertebrati planctonici che bentonici (Navone et al., 1998). Køie (1993) ha trovato larve di terzo stadio di H. aduncum in misidi, anfipodi e isopodi, mentre Svendsen (1990) ha osservato alti tassi d infestazione in copepodi, eufasidi e chetognati e Øresland (1986) ha trovato infestazioni larvali in chetognati. Quest ampio range di ospiti intermedi potrebbe essere, unitamente al fatto che pesci teleostei ne rappresentano gli ospiti definitivi, uno dei motivi alla base dell elevata distribuzione di Hysterothylacium in numerose specie ittiche ed in ampi areali geografici. Va evidenziato come una prevalenza di H. aduncum molto più elevata rispetto ad Anisakis sia stata evidenziata in diverse specie ittiche del Mar Mediterraneo (Amor et al., 2011) e come Rello et al. (2008) abbiano messo in evidenza la presenza di H. aduncum quale unico anisakide presente nelle sardine provenienti dalle coste spagnole. Il ciclo di Anisakis sp. sembra invece essere maggiormente collegato alla presenza di mammiferi marini, ospiti definitivi e di organismi zooplanctonici idonei quali in particolare crostacei dell ordine Euphasiacea (Sakanari & McKerrow, 1989; Audicana & Kennedy, 2008). La presenza di ospiti definitivi idonei rappresenta senz altro un importante aspetto regolatore nella diffusione di Anisakis spp., ancor più delle abitudini alimentari dei pesci che risultano legate non solo all attitudine trofica di specie, ma anche al loro stato fisiologico ed al cambiamento di temperatura delle acque. Infine, la taglia dei soggetti sembra essere correlata in maniera significativa ai tassi d infestazione, come già osservato da Fioravanti et al. (2003), Marrone et al. (2007), Rello et al. (2008) e Ciccarelli et al. (2011). Tali differenze sono presumibilmente da correlare alla crescente possibilità di rischio di assumere e/o accumulare le forme larvali di nematodi Anisakidae in animali di crescente età. Il riscontro di larve di Anisakis solo in soggetti di alici e sardine appartenenti alle classi di taglia maggiore potrebbe essere infatti spiegata da un aumentata probabilità di assumere l infestazione o, altrimenti, da una crescente attitudine ad alimentarsi di componenti dello zooplancton più idonei a rappresentare gli ospiti intermedi di Anisakis spp. In letteratura le alici sono descritte come maggiormente parassitate da Anisakis rispetto alle sardine. Ciò sembra essere legato alle caratteristiche alimentari di questi 40

17 piccoli clupeiformi i quali evidentemente si nutrono di crostacei invertebrati più idonei alla trasmissione di Anisakis. Infatti, a differenza della sardina, E. encrasicolus risulta essere una specie prettamente zooplanctivora la cui fonte principale di nutrimento è rappresentata da crostacei (Tudela & Palomera, 1997). Anche la maggiore prevalenza di Hysterothylacium nelle sardine sarebbe da correlare all attitudine trofica di questi piccoli clupeiformi, che risultano essere filtratori la cui dieta riflette la composizione del plancton (Varela et al., 1990, Bode et al., 2003; Palomera et al., 2007). Alcuni studi infatti hanno dimostrato che le sardine sono in grado di consumare sia fitoplancton che zooplancton (Cunha et al., 2005), alimentandosi principalmente di fitoplancton laddove le condizioni di upwelling rappresentano un aspetto costante ed assumendo invece prevalentemente zooplancton dove l upwelling risulta più debole e meno costante. Ad eccezione di un unica positività per Anisakis riscontrata in una sardina pescata a Cesenatico a sole 8,1 NM e a 15 metri di batimetria tutte le altre si riferiscono a profondità maggiori (>15 m) e distanza dalla costa superiori (>30 NM). Appare interessante il mancato rilievo di larve di Anisakis nelle alici e nelle sardine pescate a Caorle, che provenivano sempre da zone di pesca vicino alla costa (3,6-8,6 NM) caratterizzate da profondità comprese tra 17 e 20 metri. Per quanto concerne le specie di nematodi Anisakidae reperite, le larve del genere Hysterothylacium sono risultate appartenere tutte alla specie H. aduncum, specie considerata da diversi autori come la più diffusa nel Mediterraneo, mentre le larve del genere Anisakis sono state identificate in cinque casi come A. pegreffii, specie zoonosica e ad ampia distribuzione nel bacino del Mediterraneo (Mattiucci & Nascetti, 2008). Andrà invece meglio circostanziato il reperto di un ibrido di A. pegreffii/simplex in questi areali marini. CONSIDERAZIONI CONCLUSIVE I risultati ottenuti dalle ricerche parassitologiche condotte in piccoli clupeiformi pescati in areali di pesca del Mar Adriatico nord-occidentale confermano quanto visto in passato da altri autori, suggerendo che le alici e le sardine provenienti da queste zone potrebbero essere considerate a basso rischio nella trasmissione di Anisakis all uomo attraverso il consumo di preparazioni a crudo a base di queste specie ittiche. Questi risultati, oltre ad essere visti come un elemento rassicurante per il consumatore, risultano molto importanti anche dal punto di vista ispettivo e commerciale. Infatti il Regolamento CE 853\04 obbliga gli operatori del settore alimentare a praticare un trattamento di congelamento ad una temperatura non superiore a -20 C in ogni parte della massa per almeno 24 ore oppure, in base al recente Regolamento (UE) N. 1276/2011, anche a -35 C per 15 ore, per i prodotti della pesca che saranno consumati crudi o poco cotti, per i prodotti di alcune specie (aringhe, sgombri, spratti, salmoni selvatici dell Atlantico e del Pacifico) che devono subire un affumicatura a freddo con temperature interne che non raggiungono i 60 C, nonché per i prodotti ittici marinati e/o salati se il trattamento praticato non garantisce la distruzione delle larve di nematodi. Il trattamento di congelamento però 41

18 determina la formazione di cristalli di ghiaccio tali da danneggiare i tessuti e da alterare negativamente le caratteristiche organolettiche dell alimento, soprattutto per quel che riguarda il gusto e la consistenza, rendendo così il prodotto finale meno apprezzato dal consumatore (Gomez & Roman, 2002). Lo stesso Regolamento specifica che gli operatori del settore alimentare non sono obbligati a praticare i trattamenti di cui sopra qualora i dati epidemiologici disponibili indichino che le zone di pesca d'origine non presentano rischi sanitari riguardo la presenza di parassiti e qualora le Autorità competenti lo autorizzino. Nonostante tali provvedimenti siano di difficile attuazione in quanto non risulta comunque possibile stabilire un rischio zero in relazione alla possibile presenza, seppur sporadica, di larve di Anisakidi zoonotici in specie ittiche selvatiche, i risultati di questa indagine e nello specifico il rilevamento di valori di prevalenza ed intensità molto bassi per larve di Anisakis sp. sia nelle alici che nelle sardine pescate nel Mar Adriatico nord-occidentale possono costituire un dato rassicurante per il consumatore ed un elemento utile a valorizzare da un punto di vista sanitario i piccoli pelagici provenienti da questi areali di pesca. I risultati di questa ricerca contribuiscono quindi ad ampliare le conoscenze sull epidemiologia dei nematodi Anisakidi nelle popolazioni di alici e sardine del Mar Adriatico settentrionale, fornendo indicazioni utili alla valutazione del rischio Anisakis in queste specie ittiche in relazione agli areali di pesca presi in considerazione (Cesenatico, Caorle e Rimini). RINGRAZIAMENTI Si ringraziano per la collaborazione e per il supporto offerti nel corso dei campionamenti il dr. Rocco Marchesan del Mercato Ittico di Caorle, il dr. Luca Benedetto Baroni della Azienda USL di Rimini ed il dr. Fabio Lacchini della Cooperativa armatori e operatori della pesca di Cesenatico. BIBLIOGRAFIA Amor N., Farjallah S., Merella P., Said K. & Slimane B.B. (2011). Molecular characterization of Hysterothylacium aduncum (Nematoda: Raphidascaridae) from different fish caught off the Tunisian coast based on nuclear ribosomal DNA sequence. Parasitol. Res., 109: Anastasio A., Marrone R., Panzardi M. & Palma G. (2009). Valutazione della qualità igienicosanitaria del pesce azzurro pescato nel golfo di Napoli. Università degli Studi di Napoli Federico II con il contributo della Provincia di Napoli. Osservatorio Regionale per la Sicurezza Alimentare della Regione Campania, Audicana M. & Kennedy M.W. (2008). Anisakis simplex: from obscure infectious worm to inducer of immune hypersensitivity. Clin. Microbiol. Rev., 21: Bembo D.G., Carvalho G.R., Cingolani N., Arneri E., Giannetti G. & Pitcher T.J. (1996). Allozymic and morphometric evidence for two stocks of the European anchovy Engraulis encrasicolus in Adriatic waters. Mar. Biol., 126:

19 Berland B. (1961). Nematodes from some Norwegian marine fishes. Sarsia, 2: Betulla Morello E. & Arneri E. (2009). Anchovy and sardine in the Adriatic Sea An ecological review. Oceanogr. Mar. Biol. Annu. Rev., 47: Bode A., Carrera P. & Lens S. (2003). The pelagic foodweb in the upwelling ecosystem of Galicia (NW Spain) during spring: natural abundance of stable carbon and nitrogen isotopes. ICES J. Mar. Sci., 60: Bush A.O., Lafferty K.H., Lotz J.M. & Shostak A.W. (1997). Parasitology meets ecology on its own terms: Margolis et al. revisited. J. Parasitol., 83: Ciccarelli C., Aliventi A., Di Trani V. & Semeraro A.M. (2011). Studio della prevalenza di larve Anisakidae in alici (Engraulis encrasicolus) del medio Adriatico. A.I.V.I online, 1, 0. Cunha M.E., Garrido S. & Pissarra J. (2005). The use of stomach fullness and colour indices to assess Sardina pilchardus feeding. J. Mar. Biol. Ass. UK, 85: Di Rosa C. (2011). Una parassitosi emergente: l Anisakiasi. Tesi di laurea, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università degli Studi G. D Annunzio Chieti-Pescara, relatore Prof. Schioppa, correlatore Dr. Fazii. EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ) (2010). Scientific Opinion on risk assessment of parasites in fishery products. EFSA Journal, 8, 4: [91 pp.]. Fioravanti M.L., Caffara M., Florio D., Gustinelli A., Marcer F., Gradassi M., Gavaudan S., Paolini A., Alessi A. & Bisceglia D. (2006). Anisakiasis in anchovies (Engraulis encrasicolus) and sardines (Sardina pilchardus) caught along the Adriatic coast. Parassitologia, 48, 1-2: 285. Fioravanti M.L., Gavaudan S., Tonucci F. & Vagnini V. (2003). Indagine sulla diffusione di larve di Anisakis e Hysterothylacium (Nematoda, Anisakidae) in pesci del Mar Adriatico Centrale. Atti LVII Convegno Nazionale SISVET, Ischia giugno 2003: Gomez C. & Roman J. (2002). Los pescados azules. In: M.A. Rabadàn (ed.), Pescadosazules y corazon. Salud a mares. FROM, Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaciòn. Rabapress, Madrid: Losito P., Ianieri A. & Mattiucci S. (2003). On the occurrence of Anisakis pegreffii (Nematoda: Anisakidae) larvae in Engraulis encrasicolus (L. 1758) from Adriatic Sea. Atti LVII Convegno Nazionale SISVET, Ischia giugno 2003: Lymbery A.J. & Cheah F.Y. (2007). Anisakid Nematodes and Anisakiasis. In: Murrell K. D. & Fried B. (Eds.) Food-Borne Parasitic Zoonoses, Fish and Plant-Borne Parasites, World Class Parasites vol. 11. Springer N.Y.: Køie M. (1993). Aspects of the life cycle and morphology of Hysterothylacium aduncum (Rudolphi, 1802) (Nematoda, Ascaridoidea, Anisakidae). Can. J. Zool., 71: Marrone R., Damiano S., Panzardi M., Palma G., Mattiucci S. & Anastasio A. (2007). Occurrence of Anisakis pegreffii larvae in anchovy Engraulis encrasicolus caught off Naples Gulf (Italy). Parassitologia., 49 (suppl. 2): 225. Mattiucci S. & Nascetti G. (2008). Advances and trends in the molecular systematics of Anisakid nematodes, with implications for their evolutionary ecology and host parasite co-evolutionary processes. Adv. Parasitol., 66: