Cellule impiegate nell Ingegneria dei tessuti

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1 Cellule impiegate nell Ingegneria dei tessuti

2 La cellula La cellula è l unità strutturale e funzionale più piccola degli esseri viventi capace di esistenza indipendente. La cellula in genere interagisce con le altre strutture a lei contigue servendosi di un complesso sistema di membrane e reazioni chimiche

3 La cellula I tessuti Gli organi Le cellule sono organizzate in tessuti (gruppi di cellule che adempiono una medesima funzione). Diversi tipi di tessuti, uniti strutturalmente e coordinati nelle loro attività, formano gli organi. Il corpo umano è composto da 100 mila miliardi di cellule, di oltre 200 tipi diversi, classificate in quattro tipi di tessuti T. Epiteliale T. Connettivo T. Muscolare T. Nervoso

4 Esistono due tipi di cellule, fondamentalmente distinte per il loro diverso grado di complessità organizzativa Cellule procariotiche Cellule eucariotiche Queste cellule rappresentano i costituenti di tutti gli organismi viventi raggruppati nei 5 Regni

5 Cellule eucariotiche Le cellule eucariotiche costituiscono tutti gli altri organismi viventi (i protisti, le piante, i funghi e gli animali) Sono molto più grandi (solitamente il loro asse maggiore è compreso fra i 10 e i 50 µm); In esse, il DNA è racchiuso da una membrana, formando così un particolare organulo chiamato nucleo. Queste cellule possiedono organuli immersi nel citoplasma, ognuno deputato a svolgere una particolare funzione. Gli organismi formati da cellule eucariotiche sono detti eucarioti.

6 Quanto è grande una cellula? centimetri micron UNA CELLULA NON PUO CRESCERE A DISMISURA, QUESTO HA PORTATO L EVOLUZIONE VERSO GLI ORGANISMI PLURICELLULARI. ALLA PLURICELLULARITA E SEGUITA SUBITO LA SPECIALIZZAZIONE.

7 Vari tipi di cellule e loro dimensioni

8 Le dimensioni di una cellula Una cellula è di norma sufficientemente grande da poter essere visibile al microscopio ottico (dove si potranno distinguere membrane e nucleo) Microscopio ottico: ha un limite di risoluzione di circa 200 nm (0.2 µm). Le cellule osservate al microscopio ottico possono essere vive, o fissate e colorate. Mentre per osservare le microstrutture è necessario il microscopio elettronico Microscopio Elettronico: ha un limite di risoluzione di circa 2 nm. Osserva una replica delle cellule morte, dopo la fissazione e la colorazione con ioni metallici.

9 Le dimensioni di una cellula Rapporto superficie - volume Cellula piccola Es.cellula batterica ~2µm Cellula grande Cellula animale ~10-30µm Perchè le cellule non sono più piccole o più grandi di come le conosciamo? Non possono essere più piccole perchè le molecole costitutive che formano la loro sostanza organica hanno dimensioni ben definite e determinate dalla grandezza degli atomi di C, H, O, N. D altra parte le cellule non possono essere più grandi perchè la velocità del loro metabolismo verrebbe limitata dalla velocità di diffusione delle molecole di nutrienti (ricordiamo che il volume di una cellula sferica aumenta col cubo, la superficie disponibile per l assunzione di sostanze nutritive, scambio di gas e secrezione di prodotti di rifiuto col quadrato del raggio! Questo principio è noto come effetto scala)

10 Legge di Driesch Il volume delle cellule è approssimativamente costante per ciascun tipo cellulare nell ambito della stessa specie o di specie affini ed è indipendente dalle dimensioni dell organismo. La diversa dimensione degli organismi è dovuta al numero e non al volume delle cellule

11 LA CELLULA E LE SUE FUNZIONI STRUTTURE SUB-CELLULARI nucleo citoscheletro MENBRANA CELLULARE enzimi reticolo Endoplasmico mitocondri Canali ionici e recettori Vescicole

12 IL NUCLEO LA MENBRANA NUCLEARE IL CITOPLASMA ialoplasma Il citoscheletro organuli con funzioni di sintesi organuli con funzioni energetiche LA MENBRANA CELLULARE

13 Per rigenerare un tessuto si possono utilizzare: 13 Cellule primarie differenziate Cellule staminali indifferenziate Cellule geneticamente modificate Fonti cellulari Banche di cellule staminali Prelievo di cellule da tessuti: allotrapianti, autotrapianti, xenotrapianti. Mantenimento in vita delle cellule in vitro e in vivo

14 Recupero, espansione e coltura cellulare Le cellule estratte dai tessuti vengono congelate conservate in azoto liquido espansione Le cellule vengono scongelate e piastrate Le cellule a confluenza vengono staccate (tripsinizzate) e passate in altre piastre Le cellule crescono in terreno di coltura Le piastre vengono trasferite nell incubatore 14

15 Terreno di coltura

16 Cappa per colture cellulari: È necessario lavorare in condizioni di assoluta sterilità. La cappa possiede un flusso laminare discendente che limita l ingresso di microorganismi.

17 Sterilità Bisogna lavorare sempre in condizioni sterili Tutte le soluzioni, mezzi di coltura e piastre per la coltivazione, devono essere sterili Soluzioni non sterili devono essere filtrate o autoclavate (20 min a 120 C) Alcuni oggetti possono essere sterilizzati agli UV L alcool va bene come batteriostatico, ma non è efficace sulle spore.

18 Il microscopio ottico consente di osservare le cellule vive mentre sono in crescita

19 Che cosa si va ad osservare in un bio-ibrido per TE in vitro? Morfologia cellulare Vitalità Adesione Proliferazione Apoptosi Differenziamento Produzione di matrice extracellulare

20 Numero di cellule Proliferazione cellulare CURVA DI CRESCITA Giorni di coltura

21 Come si controlla il differenziamento? Markers di differenziamento Produzione di matrice Le proteine di membrana possono essere identificate con anticorpi specifici fluorescenti (immunofluorescenza) interazione antigene-anticorpo ACTINA

22 Vitalità cellulare MTT: metodo indiretto per valutare crescita e proliferazione cellulare. Si basa sulla capacità dei mitocondri di ossidare la soluzione di MTT, dando un prodotto finale di colore blu-violetto. Si usa moltissimo in ingegneria dei tessuti per valutare, per esempio, la citotossicità di un materiale Altri metodi: - calceina-am + etidio bromuro -Fluoresceina diacetato + bromuro d etidio -Trypan blu -Alamar blu MTT

23 Colture cellulari in 3D Le cellule in 3D cellule in 2D sotto molti aspetti: 1. Adesione e Migrazione 2. Forma della cellula 3. Produzione di ECM 4. Fisiologia 5. Sensibilità ai fattori Svantaggi Difficoltà nella diffusione dei nutrienti. Più difficile l osservazione. In alcuni casi, le cellule si possono osservare solo alla fine dell esperimento.

24 24 Cellule primarie Sono cellule normali, prese direttamente dal tessuto. Hanno il vantaggio di conservare i parametri di differenziamento tipici del tessuto da cui provengono. Hanno lo svantaggio di potere essere espanse solo un numero finito di passaggi.

25 25 Cellule staminali Non sono differenziate. Quando si divide, ogni cellula figlia ha 2 possibilità: rimanere staminale o differenziarsi. Possono dividersi senza limite. Sotto certe condizioni hanno la capacità di RIPRODURSI indefinitamente Nel caso delle cellule staminali adulte, durante tutta la vita dell organismo.

26 26 Tipi di cellule staminali CELLULE STAMINALI EMBRIONALI CELLULE STAMINALI ADULTE dall embrione TOTIPOTENTI PLURIPOTENTI dal feto dall adulto MULTIPOTENTI (N.B.: un embrione umano è considerato feto a partire da 8 settimane di gestazione)

27 Cellule staminali embrionali Le CELLULE STAMINALI EMBRIONALI derivano da un gruppo di cellule detto massa cellulare interna, che fa parte dell embrione (blastocisti) in fasi molto precoci di sviluppo (4-5 giorni). Una volta rimosse dalla blastocisti, le cellule della massa cellulare interna possono essere coltivate in vitro.

28 Cellule staminali embrionali In laboratorio, le CELLULE STAMINALI EMBRIONALI possono proliferare indefinitamente ed essere indotte a differenziare in vari tipi cellulari A meno che le cellule staminali embrionali non vengano combinate con embrioni, non possono dare origine ad un intero organismo. Queste cellule embrionali non sono esse stesse embrioni.

29 Le cellule staminali embrionali sono PLURIPOTENTI Una cellula staminale si dice PLURIPOTENTE se ha la capacità di dare origine a tipi di cellule che si sviluppano da tutti e tre i foglietti embrionali (mesoderma, endoderma ed ectoderma).

30 Coltivazione di cellule staminali embrionali morula blastocisti in coltura massa cellulare interna isolata strato feeder di fibroblasti di topo bloccati cellule staminali dissociate e ripiastrate nuovo strato feeder coltura stabile di cellule staminali

31 Cellule staminali embrionali in coltura strato feeder di fibroblasti cellule staminali indifferenziate Le cellule ES possono essere mantenute nello stato indifferenziato

32 Embrione sviluppato in vitro a partire da cellule staminali embrionali di topo o essere indotte a differenziare, cambiando le condizioni di coltura

33 Nel 1998, i ricercatori sono stati per la prima volta capaci di isolare CELLULE STAMINALI PLURIPOTENTI DA EMBRIONI UMANI (blastocisti) e di crescerle in coltura. Usando 14 blastocisti ottenute da embrioni soprannumerari prodotti da fecondazione in vitro, un gruppo di biologi dell Università di Wisconsin- Madison ha stabilito 5 linee indipendenti di cellule staminali. Blastocisti umana con massa cellulare interna e trofoectoderma.

34 Gli embrioni usati alla Università di Wisconsin-Madison erano stati prodotti originariamente per trattare casi di infertilità e vennero donati, dopo consenso informato, da coppie che non volevano più che gli embrioni venissero impiantati. In tutte le cliniche dove viene attuata la fecondazione in vitro, gli embrioni soprannumerari, se non vengono donati ad altre coppie sterili o per scopi di ricerca, vengono distrutti.

35 In pochi anni dalla scoperta delle cellule embrionali staminali umane, sono emerse numerose evidenze della loro capacità di dare origine a quasi tutte le cellule specializzate del corpo e, pertanto, di generare cellule per sostituire un ampia gamma di tessuti e organi, quali cuore, pancreas e sistema nervoso. Pertanto, le cellule staminali umane fanno sperare nella possibilità di riparare o sostituire cellule o tessuti danneggiati da varie patologie.

36 Perchè le cellule staminali embrionali sono importanti? -Interesse per la clinica -In test farmacologici -In studi sullo sviluppo

37 - IN CLINICA: per la loro capacità di svilupparsi in tutti i tipi cellulari, rappresentano una sorgente potenzialmente illimitata di tessuti. - IN TEST FARMACOLOGICI: per lo studio di nuovi farmaci. La capacità di crescere specifici tipi cellulari offre la possibilità di testare composti chimici e farmaci. Ciò rappresenterebbe una scorciatoia per testare rapidamente centinaia di migliaia di molecole che oggi richiedeno tempi molto lunghi.

38 -IN STUDI SULLO SVILUPPO: le fasi più precoci dello sviluppo embrionale dell uomo sono state difficili o impossibili da studiare. Le cellule embrionali staminali umane offrono la possibilità di conoscere eventi dello sviluppo che non possono essere studiati direttamente nell uomo. La conoscenza di questi eventi ha importanza clinica, per la prevenzione o il trattamento di difetti dello sviluppo. Per esempio, test farmacologici su cellule staminali embrionali umane potrebbe aiutare a ridurre il rischio di difetti congeniti causati da farmaci.

39 Fino ad oggi nessuna malattia è mai stata curata con le cellule staminali embrionali umane La sperimentazione con le hesc (human embryonic stem cells) è cominciata solo nel Inoltre i fondi Federali per ricerche sulle hesc sono stati messi a disposizione solo a partire dal 2001, dopo la decisione del presidente Bush di finanziare tale tipo di ricerche. Pertanto, la ricerca sulle hesc è ancora nelle sue prime fasi.

40 Problemi di base da superare per l utilizzo delle cellule staminali embrionali COME DIRIGERE IL DIFFERENZIAMENTO DELLE CELLULE SECONDO VIE SPECIFICHE DI DIFFERENZIAMENTO? per es. tutte le cellule in cellule muscolari o tutte in cellule nervose; uso di diversi cocktail di fattori di crescita. COME SUPERARE IL RIGETTO IMMUNITARIO? per es. alterando i geni di istocompatibilità; clonaggio terapeutico. COME CREARE UN ORGANO? Cioè come combinare tipi cellulari diversi in strutture tridimensionali?

41 Tuttavia, l uso di hesc a scopo terapeutico presenta molti problemi etici ed è ritenuta illegale. Un alternativa è l uso di cellule staminali o di cellule progenitrici presenti negli organi adulti.

42 42 Cellule staminali adulte Sono cellule indifferenziate (non specializzate) che si trovano in un tessuto adulto differenziato (specializzato). Tali cellule si rinnovano (proliferano) e si specializzano in tutti i tipi cellulari che compongono il tessuto da cui sono originate. Sono capaci di generare copie identiche per tutta la durata della vita di un individuo. Questa proprietà è detta auto-rinnovamento (SELF-RENEWAL).

43 CELLULE STAMINALI ADULTE vengono messe da parte in un tessuto quando questo differenzia durante l embriogenesi (cellule staminali di RISERVA) Le cellule staminali ematopoietiche e mesenchimali del midollo osseo, le cellule satellite del muscolo scheletrico e le cellule staminali della pelle sono esempi di cellule staminali di riserva.

44 La differenza tra PRECURSORI e CELLULE STAMINALI ADULTE è che quando una cellula staminale si divide, una delle due cellule figlie è una cellula staminale, ancora capace di dividersi. Al contrario, quando una cellula precursore si divide può generare più precursori o due cellule specializzate, nessuna delle quali è capace di replicare se stessa.

45 45 Dove si trovano le cellule staminali adulte? Midollo osseo Retina Polpa dei denti Cervello Sangue Cornea Muscolo scheletrico Fegato Tratto gastrointestinale Pelle Pancreas Tessuto adiposo

46 Da quali tessuti si possono prelevare le cellule staminali adulte? cordone ombelicale tessuto adiposo pannicolo adiposo infrapatellare del ginocchio midollo osseo

47 PLASTICITÀ La PLASTICITÀ è la capacità di una cellula staminale adulta di un tessuto di generare tipi cellulari specializzati di altri tessuti. Un esempio di plasticità è quello di cellule staminali adulte di midollo osseo, che, sotto particolari condizioni sperimentali, generano cellule neuronali e altri tipi di cellule che si trovano nel cervello.

48 Il concetto di PLASTICITÀ delle cellule staminali adulte è un concetto nuovo e il fenomeno non ancora completamente compreso. Alcuni dati sperimentali suggeriscono che, dato un ambiente appropriato, alcune cellule staminali adulte sono capaci di venire riprogrammate a generare cellule specializzate caratteristiche di tessuti differenti. Le maggiori informazioni sulle cellule staminali adulte vengono da studi sulle cellule staminali emopoietiche isolate dal midollo osseo e dal sangue. Queste cellule sono state ampiamente studiate ed applicate terapeuticamente per varie patologie.

49 Le cellule staminali adulte, come quelle del midollo osseo, che danno origine alle cellule del sangue (chiamate hematopoietic stem cells o HSCs), sono al momento attuale, le uniche cellule comunemente usate per scopi terapeutici. Il trasferimento di HSCs tramite trapianti di midollo osseo è una pratica clinica che viene applicata da 40 anni. Oggi si usano tecniche più avanzate per prelevare le HSCs e per trattare patologie quali leucemie, linfomi e anemie. L utilità clinica delle cellule staminali adulte è stata dimostrata anche nel trattamento di altre patologie, tra le quali il diabete e tumori del rene. Tuttavia, questi studi sono stati condotti su di un numero abbastanza limitato di pazienti.

50 Le cellule staminali adulte devono essere isolate dalle cellule differenziate dello stesso tessuto Marcatura attraverso anticorpi fluorescenti

51 vantaggi svantaggi cellule staminali embrionali pluripotenti proliferazione illimitata sviluppo di tumori problemi etici cellule staminali adulte facili da maneggiare non tumorigeniche non presentano problemi etici proliferazione limitata potenziale differenziativo più limitato (?) sono poche

52

53 53 Terapia con cellule staminali Trapianto di cellule staminali nell area danneggiata Stimolazione delle cellule staminali del paziente Fino ad oggi, questa è la terapia che ha dato maggiore successo Recentemente si sta cercando di sviluppare nuove strategie per il recruitment delle cellule staminali del paziente.

54 APPLICAZIONI CLINICHE delle CELLULE STAMINALI ADULTE CURA del CANCRO (in numerosi tipi di tumori e leucemie, l uso di cellule staminali autologhe o da cordone può limitare gli effetti dannosi della chemioterapia) MALATTIE AUTOIMMUNI ICTUS IMMUNODEFICIENZE ANEMIE PATOLOGIE di CARTILAGINE e OSSA INFARTO MORBO di PARKINSON

55 APPLICAZIONI PRECLINICHE delle CELLULE STAMINALI ADULTE MIDOLLO SPINALE FEGATO VASI SANGUIGNI PANCREAS

56 STUDI CLINICI sulle CELLULE STAMINALI ADULTE Una serie di studi in animali hanno dimostrato che cellule staminali adulte possono riparare il tessuto miocardico infartuato, sviluppando nuovi vasi sanguigni e cellule muscolari cardiache.

57 Riparo del muscolo cardiaco per mezzo di cellule staminali adulte Cellule staminali adulte del topo vengono iniettate direttamente nel muscolo della parete del ventricolo sinistro infartuato le cellule staminali aiutano a rigenerare il muscolo cardiaco cellule muscolari cardiache danneggiate

58 Cellule staminali adulte umane di midollo osseo vengono iniettate nella vascolatura della coda di un ratto infartuato Le cellule staminali inducono la formazioni di nuovi vasi sanguigni nel muscolo cardiaco danneggiato e la proliferazione della vascolatura esistente. cellule muscolari cardiache danneggiate

59 Nel 2001, questo fenomeno è stato dimostrato anche nell uomo: in alcuni pazienti, l iniezione di cellule staminali autologhe ha migliorato il flusso ematico nella regione infartuata. Altri pazienti sono stati trattati con cellule prelevate da biopsie muscolari

60 Cellule staminali adulte dal midollo osseo o dal tessuto adiposo possono dare origine a muscolo, cartilagine, osso, dove si sono dimostrate capaci di riparare fratture.

61 CELLULE STAMINALI IN INGEGNERIA DEI TESSUTI epidermide scaffold cellule staminali semina con fibroblasti dermici Espansione ex vivo sostituto dermico riparo di lesioni profonde della pelle

62 CELLULE STAMINALI IN INGEGNERIA DEI TESSUTI midollo osseo cellula staminale mesenchimale espansione ex vivo adesione a scaffold di idrossiapatite/fosfato di calcio trapianto in vivo

63 CELLULE UNIVERSALI Le cellule staminali adulte possono essere derivate o dal paziente o da un donatore. Studi clinici e preclinici di medicina rigenerativa si sono focalizzati sull uso di cellule del paziente. Tuttavia, ci sono vari svantaggi nell uso di cellule prelevate dal paziente. tempi lunghi necessari per la purificazione ed espansione della popolazione cellulare le cellule staminali non possono essere utilizzate se il paziente è anziano o in caso di tumore del midollo osseo costi per isolamento, espansione e controlli di qualità a carico di un unico paziente

64 Sembra che tali cellule non inducano una risposta immunitaria. Pertanto sembra che sia possibile usare cellule di donatori. Le cellule staminali adulte possono essere congelate e conservate per più di un anno e successivamente scongelate subito prima dell uso.

65 Pertanto, sarebbe possibile usare cellule estranee, derivate da donatori, come cellule universali, come prodotti da banco, pronti per l uso. Ciò fornirebbe una serie di vantaggi: le cellule sarebbero disponibili immediatamente, perchè non sarebbe necessario il prelievo dal paziente. A partire da un singolo aspirato, si potrebbero generare migliaia di dosi di prodotto finale ed anche i costi sarebbero così ridotti. Tali prodotti da banco potrebbero rendere fattibili ed economiche le terapie con cellule staminali sia in malattie acute che croniche.

66 Terapia con cellule staminali (repubblica 29 Agosto 2010)

67 Occhio in vitro 67

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