bioelisa VEDI CAMBI RISALTATI

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1 VEDI CAMBI RISALTATI bioelisa HIV tests tests Test ELISA per la determinazione degli anticorpi contro i virus dell immunodeficienza umana (HIV) tipo 1 (gruppo M-O) o tipo 2 nei campioni di siero o plasma umani a uso dei laboratori clinici e come screening di prima linea nelle banche del sangue. Sommario L evidenza sierologica dell infezione da HIV si può ottenere mediante analisi finalizzate alle ricerca della presenza di antigeni o anticorpi HIV nel siero di soggetti in cui si sospetta un infezione da HIV. In genere, l antigene può essere individuato solo durante la fase acuta o la fase sintomatica dell AIDS. Gli anticorpi contro l HIV-1 e/o l HIV-2 possono essere determinati durante l intero periodo dell infezione, a partire dalla fase acuta, o appena dopo, e fino alla fase terminale dell'aids. Quindi, l'impiego di test per anticorpi altamente sensibili è l'approccio principale nella sierodiagnosi dell'infezione da HIV. Oltre alla trasmissione sessuale, la principale via di infezione è rappresentata dalle trasfusioni di sangue. L'HIV può essere presente sia nelle frazioni cellulari sia in quelle acellulari del sangue umano. Quindi, tutto il sangue o il plasma proveniente da donazioni deve essere analizzato a causa del rischio di trasmissione dell HIV attraverso sangue contaminato. Tale obiettivo può essere perseguito in modo efficace ricercando gli anticorpi contro l HIV-1 e l'hiv-2 con test ELISA altamente sensibili. Principio Il bioelisa HIV è un metodo immuno-enzimatico di tipo sandwich, in cui i pozzetti di una micropiastra sono stati ricoperti con antigeni ricombinanti di HIV espressi in E. coli (ricombinanti di HIV-1 gp41 e gp120, e ricombinante di HIV-2 gp-36). I campioni di siero o plasma da analizzare vengono aggiunti in questi pozzetti. Se nel campione sono presenti anticorpi specifici anti-hiv1/2, essi formeranno complessi stabili con gli antigeni HIV ricombinanti. I micropozzetti vengono quindi lavati per rimuovere le proteine sieriche non legate. Nei pozzetti viene aggiunta una seconda serie di antigeni ricombinanti coniugati con perossidasi che esprimono gli stessi epitopi. Durante la seconda fase di incubazione, questi antigeni si legheranno agli specifici anticorpi di cattura. Dopo un secondo lavaggio per rimuovere il coniugato non legato, vengono aggiunte soluzioni di cromogeno nei pozzetti. Nei pozzetti contenenti l mmunocomplesso a sandwich antigene-anticorpo-antigene, i cromogeni incolori vengono idrolizzati da parte del coniugato legato, dando origine ad un prodotto di colore blu. Il colore blu virerà al giallo dopo l arresto della reazione con acido solforico. L intensità del colore può essere misurata e sarà proporzionale alla concentrazione di anticorpi anti-hiv 1/2 presente nel campione. I pozzetti contenenti campioni negativi rimarranno incolori. Componenti 1. MCPL MICROPIASTRA: 12 x 8 pozzetti rivestiti con antigeni HIV 1/2 ricombinanti (HIV-1 gp41 e gp120 ricombinanti, e HIV-2 gp36 ricombinante). 2. CONTROL + 1 CONTROLLO POSITIVO HIV-1: Anticorpi anti-hiv-1 diluiti in un tampone proteico stabilizzato. Contiene 0,1% di ProClin TM conservante e colorante rosso. Pronto all uso. 3. CONTROL + 2 CONTROLLO POSITIVO HIV-2: Anticorpi anti-hiv-2 diluiti in un tampone proteico stabilizzato. Contiene 0,1% di ProClin TM conservante e colorante rosso. Pronto all uso. 300 come 300 come 4. CONTROL CONTROLLO NEGATIVO: Tampone proteico stabilizzato negativo rispetto agli anticorpi anti-hiv-1 e anti-hiv-2. Contiene 0,1% di ProClin TM 300 come conservante e colorante giallo. Pronto all uso. 5. CONJ CONIUGATO: Antigeni HIV-1 e HIV-2 ricombinanti coniugati con perossidasi. Contiene 0,1% di ProClin TM conservante e colorante rosso. Pronto all'uso. 300 come 6. WASH SOLN 20x SOLUZIONE DI LAVAGGIO CONCENTRATA: Tampone PBS concentrato ph 7,4 (20x). Contiene Tween-20 come detergente. Da diluire 1/20 in acqua distillata o acqua deionizzata prima dell uso.

2 7. CHROM A SOLUZIONE DI CROMOGENO A: Soluzione di perossido di urea. Pronta all uso. 8. CHROM B SOLUZIONE DI CROMOGENO B: Soluzione TMB (tetrametilbenzidina dissolta in acido citrico). 9. H 2 SO 4 2M SOLUZIONE BLOCCANTE: Acido solforico 2M. Pronta all uso. 10. SEALS FOGLI ADESIVI: Per coprire la micropiastra durante le incubazioni. 11. BAG SACCHETTO DI PLASTICA: Per conservare le strisce non adoperate. Precauzioni Il bioelisa HIV è per uso diagnostico IN VITRO. Solo per uso professionale. ATTENZIONE: per la preparazione del controllo negativo di questo kit possono essere stati utilizzati materiali di origine umana. Questi materiali sono stati testati utilizzando kit con prestazioni accettate e sono risultati negativi per gli anticorpi contro HIV 1/2, HCV, TP e HBsAg. Tuttavia, poiché non esiste un metodo analitico che possa garantire la totale assenza di agenti infettivi nei campioni o nei reagenti, occorre trattare reagenti e campioni con estrema cautela, come se fossero in grado di trasmettere malattie infettive. Per stabilizzare i controlli positivi e negativi sono stati utilizzati sieri di derivazione bovina. L albumina sierica bovina (BSA) e il siero fetale di vitello (FCS) derivano da animali provenienti da aree geografiche dove non è presente BSE/TSE. Controllo negativo, controllo positivo HIV-1, controllo positivo HIV-2 e coniugato contengono lo 0,1% di ProClin TM come conservante. Di seguito sono riportate le indicazioni di rischio (R) e sicurezza (S) appropriate: R43 Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle. S26 In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. S28 In caso di contatto con la pelle lavarsi immediatamente con abbondante acqua. S36/37/39 Usare indumenti protettivi e guanti adatti e proteggersi gli occhi/la faccia. S45 In caso di incidente o di malessere consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli l'etichetta). S60 Questo materiale e il suo contenitore devono essere smaltiti come rifiuti pericolosi. S61 Non disperdere nell'ambiente. Riferirsi alle istruzioni speciali/ schede informative in materia di sicurezza. La soluzione bloccante 2M H 2 SO 4 è un acido potente. Di seguito sono riportate le indicazioni di rischio (R) e sicurezza (S) appropriate: R35 Provoca gravi ustioni. S26 In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare un medico. S30 Non versare acqua sul prodotto. S45 In caso di incidente o di malessere consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli l'etichetta). I test ELISA sono sensibili al trascorrere del tempo e alla temperatura. Per evitare risultati non corretti, seguire rigorosamente le fasi della procedura senza apportare alcuna modifica. 1. Non scambiare i reagenti provenienti da lotti differenti o impiegare reagenti di altri kit in commercio. I componenti del kit sono abbinati con precisione al fine di assicurare un ottimale esecuzione dei test. 2. Assicurarsi che tutti i reagenti siano entro la data di validità riportata sulla scatola del kit e che appartengano allo stesso lotto. Non usare mai reagenti oltre la data di scadenza indicata sulle etichette o sulle scatole. 3. ATTENZIONE! Prima dell uso, attendere che i reagenti e i campioni raggiungano la temperatura ambiente (18-30 C). Agitare con delicatezza il reagente prima dell'uso. Riportare ad una temperatura di 2-8 C subito dopo l uso.

3 4. Usare solo la quantità di campione indicata nella procedura. La mancata osservanza di questa indicazione può far diminuire la sensibilità del test. 5. Non toccare la parte inferiore esterna dei pozzetti: impronte o graffi possono interferire con la lettura dei risultati. Quando si leggono i risultati, assicurarsi che il fondo della piastra sia asciutto e che non vi siano bolle d'aria all'interno dei pozzetti. 6. Evitare che i pozzetti della micropiastra si asciughino dopo il lavaggio. Passare immediatamente alla fase successiva. Evitare la formazione di bolle d aria quando si aggiungono i reagenti. 7. Evitare lunghi intervalli tra le varie fasi del test. Assicurare le stesse condizioni di lavoro per tutti i pozzetti. 8. Calibrare frequentemente le pipette per assicurare che la distribuzione di campioni/reagenti avvenga in modo preciso. Usare un puntale per pipette monouso diverso per ciascun campione e reagente, onde evitare contaminazioni crociate. 9. Assicurarsi che la temperatura di incubazione all interno dell incubatore sia di 37 C. 10. Quando si aggiungono i campioni, non toccare il fondo del pozzetto con il puntale della pipetta. 11. Quando si esegue una misurazione con un lettore di micropiastre, determinare l assorbanza a 450 nm o a 450/ nm. 12. L attività enzimatica del coniugato potrebbe essere influenzata da polvere, reattivi chimici e sostanze come ipoclorito di sodio, acidi, alcali, ecc. Non eseguire il test in presenza di queste sostanze. 13. Se si impiega un attrezzatura completamente automatica, durante l incubazione, non coprire le piastre con il foglio adesivo. Dopo il lavaggio, si può anche evitare di estrarre i residui all interno della piastra. 14. Tutti i campioni di origine umana devono essere considerati come potenzialmente infettivi. Una stretta osservanza delle norme di buona pratica di laboratorio può garantire la sicurezza delle persone. 15. Non mangiare, bere, fumare o usare cosmetici nel laboratorio di analisi. Non aspirare mai le soluzioni con la bocca direttamente dalla pipetta. 16. Le sostanze chimiche devono essere maneggiate e smaltite in conformità con le norme di buona pratica di laboratorio vigenti e con le normative locali o nazionali. 17. I puntali delle pipette, le fiale, le strisce ed i contenitori dei campioni, devono essere raccolti e sterilizzati in autoclave per almeno 2 ore a 121 C o trattati con ipoclorito di sodio al 10% per 30 minuti per decontaminarle prima di ogni ulteriore fase di smaltimento. Le soluzioni contenenti ipoclorito di sodio non devono MAI essere sterilizzate in autoclave. Le Schede di Sicurezza dei Materiali (MSDS) sono disponibili su richiesta. 18. Alcuni reagenti allo stato grezzo possono causare tossicità, irritazione, ustioni o avere un effetto cancerogeno. Evitare il contatto di cute e mucose con i seguenti reagenti (in via esemplificativa, ma non esaustiva): soluzione bloccante, cromogeni e tampone di lavaggio. INDIZI DI INSTABILITÀ E DETERIORAMENTO DEL REAGENTE: i valori dei controlli positivo o negativo al di fuori del range del controllo di qualità indicato, sono indicatori di un possibile deterioramento dei reagenti e/o di errori dell operatore o dell attrezzatura. In tal caso, i risultati devono essere considerati non validi e i campioni devono essere nuovamente testati. In caso di risultati erronei costanti e di provato deterioramento o instabilità dei reagenti, sostituire immediatamente il reagente con uno nuovo o contattare il distributore locale o il supporto tecnico Biokit per ottenere assistenza. Conservazione e stabilità I componenti del kit si manterranno stabili fino alla data di scadenza indicata sull etichetta e sulla confezione, se conservati a 2-8 C. Non congelare. Per assicurare le massime prestazioni del kit bioelisa HIV , durante la conservazione proteggere i reagenti dalla contaminazione da parte di microrganismi o agenti chimici. Le strisce di micropozzetti si possono rompere ed essere utilizzate separatamente. Conservare i pozzetti o le strisce non utilizzati nel sacchetto di plastica richiudibile ermeticamente insieme al deumidificante e riportare a 2-8 C. Una volta aperta, la micropiastra è stabile per un mese a 2-8 C. Dopo l apertura, il controllo negativo, il controllo positivo HIV-1, il controllo positivo HIV-2, il coniugato, la soluzione di cromogeno A, la soluzione di cromogeno B e la soluzione bloccante sono stabili per un mese a 2-8 C. La soluzione di lavaggio, una volta diluita, è stabile per una settimana a temperatura ambiente o per due settimane a 2-8 C.

4 Confezioni disponibili - Kit da 1 piastra (96 test), REF Contiene: 1 piastra, 1 x 1 ml controllo negativo, 1 x 1 ml controllo positivo HIV-1, 1 x 1 ml controllo positivo HIV-2, 1 x 13 ml coniugato, 1 x 50 ml soluzione di lavaggio, 1 x 8 ml soluzione di cromogeno A, 1 x 8 ml soluzione di cromogeno B, 1 x 8 ml soluzione bloccante, 1 sacchetto di plastica e fogli adesivi. - Kit da 5 piastre (5 x 96 test), REF Contiene: 5 piastre, 3 x 1 ml controllo negativo, 3 x 1 ml controllo positivo HIV-1, 3 x 1 ml controllo positivo HIV-2, 5 x 13 ml coniugato, 2 x 125 ml soluzione di lavaggio, 1 x 60 ml soluzione di cromogeno A, 1 x 60 ml soluzione di cromogeno B, 1 x 60 ml soluzione bloccante, 1 sacchetto di plastica e fogli adesivi. Materiale necessario non incluso - Acqua distillata o deionizzata. - Guanti monouso e timer. - Contenitori adeguati per lo smaltimento di materiali potenzialmente contaminati. - Condotti a V monouso. - Sistema di distribuzione e/o pipetta (singola o multicanale) e puntali per pipetta monouso. - Carta assorbente o asciugamano pulito. - Incubatore a secco o bagno d acqua, 37 ± 1 C. - Microagitatore per sciogliere e mescolare il coniugato con i campioni. - Lettore di micropiastre con filtro da 450 nm. Raccomandabile un filtro di riferimento da 620 nm o 630 nm. - Sistema di lavaggio manuale o automatico. Raccolta, trasporto e conservazione del campione 1. Non è necessaria una particolare preparazione del paziente. Prelevare il campione secondo la normale pratica di laboratorio. Per il test possono essere utilizzati campioni di siero o plasma freschi. Il sangue prelevato mediante venipuntura deve essere lasciato coagulare completamente e in modo naturale (il siero/plasma deve essere separato dal coagulo il più presto possibile per evitare l emolisi). Prestare particolare attenzione per assicurarsi che i campioni di siero siano limpidi e non contaminati da microrganismi. Tutte le particelle di materia visibili nel campione devono essere rimosse mediante centrifugazione a 3000 RPM (giri al minuto) per 20 minuti a temperatura ambiente o mediante filtraggio. 2. È possibile utilizzare campioni di plasma prelevati in EDTA, citrato di sodio o eparina, ma non si devono impiegare campioni altamente lipemici, itterici o emolitici poiché possono dare risultati falsi. Non inattivare a caldo i campioni in quanto ciò potrebbe causare il deterioramento dell analita bersaglio. Non si devono mai utilizzare campioni con contaminazione microbica visibile. 3. Il bioelisa HIV è pensato SOLO per l analisi di campioni di siero o plasma. Non eseguire il test su campioni prelevati da cadavere, saliva, urina o altri fluidi corporei, o sangue accumulato (mescolato). 4. Trasporto e conservazione: conservare i campioni a 2-8 C. I campioni che non devono essere analizzati entro 3 giorni devono essere congelati (-20 C o temperatura inferiore). Evitare ripetuti cicli di congelamento/scongelamento del campione. Per il trasporto, i campioni devono essere imballati ed etichettati secondo la vigente normativa locale e internazionale per il trasporto di campioni clinici e agenti etiologici. Trattamento automatico Questo test è utilizzabile con vari strumenti. È molto importante validare qualsiasi sistema automatico per dimostrare che i risultati ottenuti con i campioni sono equivalenti a quelli del test manuale. È raccomandabile validare periodicamente lo strumento. In caso di difficoltà nella programmazione e regolazione dei processori automatici Biokit, contattare il proprio distributore. PROCEDURA (vedere schema del procedimento) Operazioni preliminari Tutti i reagenti devono essere a temperatura ambiente (20-25 C) prima di cominciare il test. Controllare il tampone di lavaggio concentrato per determinare la presenza di cristalli di sale. Se si sono formati cristalli, solubilizzare riscaldando a 37 C finché i cristalli non si dissolvono. Diluire il tampone di lavaggio 1:20, come indicato nelle istruzioni per il lavaggio. Utilizzare acqua distillata o deionizzata e solo recipienti puliti per diluire il tampone. Tutti gli altri reagenti sono PRONTI ALL USO. Istruzioni per il lavaggio Una buona procedura di lavaggio è essenziale per ottenere dati analitici corretti e precisi. Si raccomanda di utilizzare un lavatore per micropiastre ELISA di buona qualità, mantenuto al miglior livello delle prestazioni di lavaggio. Generalmente sono necessari almeno 5 cicli di lavaggio automatico da µl/pozzetto per evitare false reazioni positive ed un rumore di fondo elevato.

5 Per evitare contaminazioni crociate della piastra con campione o coniugato, dopo l incubazione non eliminare il contenuto dei pozzetti ma lasciare che il lavatore per micropiastre lo aspiri automaticamente. Assicurarsi che i canali dispensatori del liquido del lavatore per micropiastre non siano ostruiti o contaminati e che una quantità sufficiente di tampone di lavaggio venga ogni volta distribuita nei pozzetti. In caso di lavaggio manuale, si suggerisce di eseguire 5 cicli di lavaggio dispensando µl/pozzetto e aspirando il liquido per 5 volte. Se si osservano scarsi risultati (rumore di fondo più elevato), aumentare i cicli di lavaggio o il tempo di ammollo dei pozzetti. In ogni caso, prima che possa essere smaltito in modo adeguato, il liquido aspirato dalle strisce deve essere trattato con una soluzione di ipoclorito sodico a una concentrazione finale di 2,5% per 24 ore. Il tampone di lavaggio concentrato deve essere diluito a 1:20 prima dell uso. Se non si usa tutta la piastra, preparare un volume di soluzione proporzionale all uso. Fase 1 Fase 2 Fase 3 Fase 4 Fase 5 Fase 6 Preparazione: contrassegnare tre pozzetti come controllo negativo (ad es. B1, C1, D1), due pozzetti come controllo positivo (ad es. E1 per HIV-1 e F1 per HIV-2) e uno come bianco (ad es. A1, nel pozzetto del bianco non vanno aggiunti né campioni né coniugato). Se i risultati saranno determinati mediante l uso di un lettore di piastra a lunghezza d onda doppia, si può evitare l'impiego del pozzetto del bianco. Utilizzare solamente il numero di strisce necessario per il test. Aggiunta del Campione: aggiungere 100 μl di campioni e 100 μl di controlli positivo e negativo nei rispettivi pozzetti. NOTA: usare un puntale monouso per pipetta diverso per ciascun campione, controllo negativo e positivo per evitare contaminazioni crociate. Incubazione del campione: coprire la piastra con il foglio adesivo ed incubare a 37 C per 30 ± 1 minuti. È consigliabile utilizzare un recipiente con acqua controllata con termostato per assicurare che temperatura e umidità rimangano stabili durante l incubazione. Se viene utilizzato un incubatore a secco, non aprire lo sportello frequentemente. Lavaggio (1): al termine dell incubazione, rimuovere ed eliminare il foglio adesivo. Lavare ciascun pozzetto 5 (cinque) volte con tampone di lavaggio diluito. Lasciare ogni volta i micropozzetti in ammollo per secondi. Dopo l ultimo ciclo di lavaggio, capovolgere la piastra su carta assorbente o su un asciugamano pulito e asciugarla per rimuovere eventuali residui. Aggiunta del coniugato: aggiungere 100 μl di reagente coniugato in ciascun pozzetto, tranne che in quello del bianco. Incubazione del coniugato: coprire la piastra con il foglio adesivo ed incubare a 37 C per 30 ± 1 minuti. Fase 7 Lavaggio (2): come nella Fase 4. Fase 8 Fase 9 Fase 10 Colorazione: aggiungere 50 μl di soluzione di cromogeno A e 50 μl di soluzione di cromogeno B in ciascun pozzetto, incluso il bianco. Incubare la piastra a 37 C per 15 minuti al riparo dalla luce. La reazione enzimatica tra le soluzioni di cromogeno ed il coniugato dà luogo a una colorazione blu nei pozzetti del controllo positivo e dei campioni positivi HIV 1/2. Reazione bloccante: aggiungere 50 µl di soluzione bloccante in ciascun pozzetto manualmente o impiegando una pipetta multicanale e mescolare delicatamente. Nei pozzetti del controllo positivo e dei campioni positivi HIV 1/2 si sviluppa un colore giallo intenso. Misurazione dell assorbanza: calibrare il lettore di piastra con il pozzetto del bianco e leggere l assorbanza a 450 nm. Se viene impiegato uno strumento a doppio filtro, regolare la lunghezza d onda di riferimento a 620 nm o 630 nm. Calcolare il valore di soglia e valutare i risultati. (NOTA: leggere l assorbanza entro un massimo di 15 minuti dall arresto della reazione.) Controllo di qualità Ciascun laboratorio dovrebbe definire un adeguato sistema di controllo di qualità con materiali di controllo della qualità simili o identici a quelli del campione dei pazienti analizzato.

6 - Il valore di assorbanza del pozzetto del bianco, che contiene solo soluzioni di cromogeno e bloccante, deve essere inferiore a 0,080 a 450 nm. - Il valore di assorbanza del controllo positivo deve essere 0,800 a 450/ nm o a 450 nm dopo la sottrazione del bianco. - Ogni singolo valore di assorbanza del controllo negativo deve essere inferiore a 0,100 a 450/ nm o a 450 nm dopo aver sottratto il bianco. Se uno dei valori del controllo negativo non rientra nei criteri del controllo di qualità, deve essere scartato e il valore medio va ricalcolato utilizzando i due valori rimanenti. Se più di un valore di assorbanza del controllo negativo non rientrano nell intervallo del controllo di qualità, il test non è valido e deve essere ripetuto. Risultati Ciascuna micropiastra deve essere considerata separatamente quando si calcolano e si interpretano i risultati del test, indipendentemente dal numero di piastre processate contemporaneamente. I risultati vengono calcolati mettendo in relazione il valore di assorbanza (S) di ciascun campione con il valore di soglia (CO) della piastra. Se la lettura del valore di soglia si basa su un lettore di piastra a filtro singolo, i risultati vanno calcolati sottraendo il valore A del pozzetto del bianco dai valori stampati dei campioni e dei controlli. Nel caso di un lettore di piastra a doppio filtro, non si deve sottrarre il valore A del pozzetto del bianco dai valori stampati dei campioni e dei controlli. Calcolare il valore di soglia aggiungendo 0,120 all assorbanza media del controllo negativo. Valore di soglia = CNx + 0,120 Esempio: Valore di assorbanza del pozzetto del bianco: A1= 0,025 a 450 nm (NOTA: il pozzetto del bianco è necessario solo per la lettura con filtro singolo a 450 nm). Pozzetto n.: B1 C1 D1 Ctrl Neg: 0,012 0,010 0,011 Pozzetto n.: E1 F1 Ctrl Pos: 2,363 2,436 Tutti i valori dei controlli sono entro il range del controllo di qualità stabilito. Calcolo del CNx = (0, , ,011)/3 = 0,011 Calcolo del valore di soglia: (CO) = 0, ,120 = 0,131 Interpretazione dei risultati Dividere l assorbanza del campione per il valore di soglia. (S/CO) Risultati negativi (S/CO < 1): i campioni con un assorbanza inferiore al valore di soglia sono negativi per questo test: ciò significa che non sono stati determinati anticorpi anti-hiv 1/2 con il kit bioelisa HIV Un risultato negativo non esclude la possibilità di esposizione o infezione da HIV. Risultati positivi (S/CO 1): i campioni con un assorbanza uguale o maggiore al valore di soglia sono considerati inizialmente reattivi: ciò indica che, probabilmente, impiegando bioelisa HIV sono stati rilevati anticorpi anti-hiv 1/2. Prima dell interpretazione finale dei risultati del test, tutti i campioni inizialmente reattivi devono essere testati nuovamente in duplicato con bioelisa HIV I campioni ripetutamente reattivi possono essere considerati positivi per gli anticorpi anti-hiv 1/2 con bioelisa HIV Dubbi (S/CO = 0,9-1,1): i campioni con un rapporto assorbanza / valore di soglia compreso tra 0,9 e 1,1 sono considerati dubbi ed è necessario un nuovo test in duplicato di questi campioni per confermare i risultati iniziali. Sono necessari follow-up, conferma e test supplementari dei campioni positivi con altri sistemi di analisi (ad es. WB, PCR). La diagnosi clinica non deve essere stabilita basandosi sul risultato di un singolo test, ma deve integrare i dati clinici con altri dati e reperti di laboratorio.

7 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI INIZIALI E FOLLOW-UP DI TUTTI I CAMPIONI INIZIALMENTE REATTIVI O DUBBI Rip. in duplicato,+,+,+,-,-,- Interpretazione + S/CO 0,9 S/CO < 0,9 Follow-up Interpretazione IND - IND = non interpretabile - Se, dopo la ripetizione del test dei campioni inizialmente reattivi, entrambi i pozzetti danno risultati negativi (S/CO < 0,9), questi campioni devono essere considerati positivi non ripetibili (o falsi positivi) e registrati come negativi. Come per molti test ELISA molto sensibili, i falsi positivi possono verificarsi per svariate ragioni, la maggior parte delle quali connesse, ma non limitate, ad un lavaggio inadeguato. Per maggiori informazioni relative alla risoluzione dei problemi del test bioelisa, fare riferimento alla Guida per la soluzione dei problemi. - Se dopo la ripetizione del test in duplicato, uno o entrambi i pozzetti danno risultati positivi, il risultato finale di questo test ELISA deve essere registrato come ripetutamente reattivo. I campioni ripetutamente reattivi possono essere considerati positivi per gli anticorpi anti-hiv 1/2 e quindi il paziente presenta probabilmente infezione da HIV 1/2 e l unità di sangue deve essere smaltita. - Dopo la ripetizione del test in duplicato, campioni con valori prossimi al valore di soglia dovranno essere interpretati con cautela e considerati come campioni in zona "dubbia" o non interpretabili al momento del test. Limitazioni della procedura 1. I risultati positivi devono essere confermati con un altro metodo disponibile e interpretati congiuntamente alle informazioni cliniche del paziente. 2. È possibile che durante la fase iniziale della malattia e in alcuni soggetti immunodepressi gli anticorpi non siano determinabili. Pertanto, i risultati negativi ottenuti con il test bioelisa HIV indicano soltanto che il campione non contiene un livello rilevabile di anticorpi anti-hiv 1/2 e che ogni risultato negativo non va considerato come un evidenza conclusiva di infezione da HIV-1 o HIV Gli errori più comuni relativi al test sono: impiego di kit scaduti, procedure di lavaggio non corrette, reagenti contaminati, fasi della procedura non corrette, aspirazione insufficiente durante il lavaggio, mancata aggiunta di campioni o reagenti, utilizzo inadeguato dell attrezzatura del laboratorio, errore nel calcolo dei tempi, uso di campioni altamente emolizzati o di campioni contenenti fibrina, campioni di siero non completamente coagulati. 4. La prevalenza del marker inciderà sui valori predittivi del test. 5. Questo test non può essere utilizzato per analizzare plasma accumulato (mescolato). Il test bioelisa HIV è stato validato solo per l analisi di campioni di siero o plasma singoli. 6. bioelisa HIV è un test qualitativo ed i risultati non possono essere impiegati per misurare la concentrazione degli anticorpi. Questo test non consente di effettuare una distinzione tra infezioni da HIV-1 e da HIV-2. Caratteristiche di funzionalità Lo studio di valutazione condotto ad Alkmaar, Paesi Bassi, tra aprile e novembre 2005, ha dimostrato le seguenti caratteristiche di funzionalità di bioelisa HIV La specificità diagnostica del kit è stata del 99,85% come determinato su tutti i campioni negativi analizzati (5471). Quando la specificità è stata studiata solo su donatori non selezionati (donatori casuali e alla prima donazione), è risultata del 99,92% (IC 95%, 99,84-100%). Risultati del test bioelisa HIV su donatori non selezionati: Pannello Numero Positivo (S/CO 1) Negativo (S/CO < 1) testati Numero % Numero % Donatori casuali siero , ,92 Donatori casuali plasma , ,93 Donatori alla prima donazione , ,90 Totale , ,92

8 Tutti i pannelli di campioni positivi confermati per gli anticorpi anti-hiv-1, HIV-1 sottotipo O e HIV-2 utilizzati in questo studio, sono anche risultati reattivi con il test bioelisa HIV , determinando una sensibilità diagnostica del 100%. È stato testato un totale di 25 pannelli di sieroconversione con bioelisa HIV Tra i 23 pannelli impiegati per comparare la sensibilità del test rispetto ad un altro test ELISA per gli anticorpi anti-hiv disponibile in commercio, un pannello ha reagito prima, 13 pannelli sono stati determinati in modo sovrapponibile in entrambi i test e in 9 pannelli il test bioelisa HIV ha reagito più tardi. Nel complesso, bioelisa HIV ha dimostrato una sensibilità pari a quella di altri test ELISA di tipo sandwich a doppio antigene. La sensibilità analitica è stata valutata su pannelli anti-hiv PeliCheck. La sensibilità analitica di bioelisa HIV sulle diluizioni standard anti-hiv PeliCheck è risultata comparabile a quella di altri test anti-hiv. Specificità analitica: I risultati del test bioelisa HIV su campioni prelevati da pazienti ospedalizzati e su campioni con possibile reattività crociata: Numero di Tipo di campione campioni Positivi (S/CO 1) Negativi (S/CO <1) testati Numero % Numero % Mononucleosi , ,65 Donna in gravidanza RF Anti-TPO Anti- muscolo liscio Livelli di IgG elevati Totale , ,07 In un altro studio, sono stati ottenuti i seguenti risultati di specificità: - Non è stata osservata interferenza dei fattori reumatoidi fino a 2000 U/ml. - Il possibile effetto gancio alle alti dosi viene eliminato a causa dell esecuzione di una procedura a due fasi. - Le caratteristiche delle prestazioni del test non sono influenzate da concentrazioni elevate di bilirubina (fino a 210 mg/l), emoglobina (fino a 25 mg/l) e albumina (fino a 100 g/l). - Sono stati analizzati campioni positivi/negativi congelati per verificare le interferenze dovute al prelievo e alla conservazione. Non sono stati osservati effetti sulle caratteristiche delle prestazioni di bioelisa HIV per almeno 3 cicli di congelamento/scongelamento. - Pannelli di campioni con elevati livelli di anticorpi anti-e. coli: non sono stati osservati effetti sulle caratteristiche delle prestazioni di bioelisa HIV Sono stati testati campioni prelevati da pazienti con virus dell epatite A, B, C ed E, nonché campioni prelevati da pazienti con infezione da Treponema pallidum, e non è stata osservata alcuna reattività crociata. Precisione: Le seguenti tabelle riportano i risultati della sensibilità analitica e della riproducibilità di bioelisa HIV con run control PeliSpy Multi-Marker e con campione QC interno testato in ciascuna piastra; la diluizione 1:2048 dello standard anti-hiv in questo campione PeliSpy è stata rilevata in modo coerente in tutte le piastre. In tutte le piastre è stato sempre determinato un campione QC interno. Risultati con PeliSpy Multi-Marker: Percentili Misurati Diluizione n Media 5 95 Min Max 1: ,08 1,76 4,39 1,70 4,96 Risultati con campione QC interno: Percentili Misurati n Media 5 95 Min Max 160 7,71 5,32 10,10 4,37 10,89

9 Sono stati condotti studi sulla precisione inter- e intra-test con 3 campioni HIV-1 positivi e controlli positivi e negativi del test. La valutazione intra-test è stata eseguita con 10 repliche di ciascun campione con kit scelti in modo casuale da uno stesso lotto. La valutazione inter-test è stata condotta con 10 repliche di ciascun campione con kit scelti in modo casuale da 4 differenti lotti nel corso di una settimana da tecnici diversi. Intra-test Inter-test Tipo Campione N- test Media OD/CO CV% Media OD/CO CV% Debolmente pos. 10 2,76 6,2% 2,69 6,5% Moderatamente pos. 10 7,67 4,8% 6,74 5,3% Fortemente positivo 10 18,06 4,0% 17,96 4,3% Controllo positivo 10 15,74 4,1% 15,67 4,3% Controllo negativo 10 0,16 15,21% 0,17 17,43% MODELLO DI SCHEMA DELLA DISTRIBUZIONE DEI CONTROLLI/CAMPIONI A Bianco CAMP 3 B Neg C Neg D Neg E Pos (HIV-1) F Pos (HIV-2) G CAMP 1 H CAMP 2

10 bioelisa: Guida alla soluzione dei problemi Problema Possibili cause Soluzione 1. Controlli non convalidanti. 2. Senza colore o con poco colore alla fine della prova. 1a. Temperatura, incubazione o pipettaggio erronei. 1b. Preparazione erronea dei reagenti, errore nelle diluizioni, reagenti non correttamente mescolati. 1c. crociata Inquinamento incrociato dei controlli. Verificare procedimento. Verificare procedimento. Pipettare con attenzione. Non scambiare i tappi. Ripetere il test. 1d. Filtro di lettura erroneo. Controllare che il filtro di lettura sia di 450 nm. Se non si usa un filtro di riferimento di nm, le assorbanze aumentano di circa 0,050. 1e. Interferenza nella via ottica. 1f. Sono stati usati componenti di lotti diversi. Controllare il lettore. Pulire o asciugare il fondo della micropiastra. Verificare l assenza di bolle d aria. Ripetere la lettura. Non utilizzare componenti di lotti diversi dato che sono dosati per ogni singolo lotto. 1g. Reagenti scaduti. Controllare la scadenza del kit e dei suoi componenti. Non usare kit o reagenti scaduti. 2a. Uno o più reagenti non sono stati aggiunti o sono stati aggiunti in sequenza sbagliata. 2b. Coniugato inattivo: conservazione erronea. 2c. Micropiastra inattiva: conservazione erronea. 2d. Soluzioni di cromogeno A e/o B inattive: conservazione erronea. Il contenitore utilizzato influisce sulla stabilità del cromogeno, inquinamento incrociato con la soluzione bloccante. Verificare procedimento. Controllare se vi è stato inquinamento. Verificare il procedimento. Conservare sempre le strisce non utilizzate nel sacchetto ben chiuso con il deumidificante dentro. Utilizzare contenitori monouso oppure lavati con acido o etanolo e sciacquati con acqua deionizzata prima del riutilizzo. Verificare il procedimento.

11 bioelisa: Guida alla soluzione dei problemi Problema Possibili cause Soluzione 3. Troppo colore in tutti i pozzetti della micropiastra. 4. Troppo colore in tutti i pozzetti della micropiastra. 3a. Soluzioni di cromogeno A e/o B contaminate, ossidate. 3b. Reagenti contaminati o preparati in modo sbagliato. 3c. Soluzione di lavaggio (1x) inquinata. 3d. Lavaggio insufficiente o impreciso: riempimento e/o aspirazione insufficienti o non uniformi. Numero di cicli di lavaggio insufficiente, contaminato lavatore inquinato. 3e. È stata adoperata una soluzione di lavaggio di differente marca diversa. Controllare che le soluzioni di cromogeno A e B siano incolori, scartarle se sono blu. Utilizzare contenitori lavati con acido o etanolo oppure monouso. Controllare l inquinamento (aspetto torbido). Controllare le diluizioni. Controllare la qualità dell acqua distillata o deionizzata per utilizzata per preparare la diluizione. Controllare il lavatore. Riempire i pozzetti fino all orlo con la soluzione di lavaggio e aspirare completamente. Aumentare il numero dei cicli di lavaggio e il tempo di ammollo. Dopo il lavaggio, asciugare la micropiastra capovolta su carta assorbente. Utilizzare solo la soluzione di lavaggio fornita con il kit. 4a. Problemi di lavaggio. Vedere 3c, 3d, 3e. 4b. Pipette calibrate male o puntali incastrati male. Tecnica di pipetaggio erronea. 4c. Reagenti e campione non a temperatura ambiente o non mescolati correttamente prima 4d. Correnti. d aria sulla micropiastra durante le incubazioni. 4e. Tempi troppo lunghi nell aggiunta di campioni e/o reagenti. Imprecisione negli intervalli di tempo. Bolle d aria. 4f. Interferenza nella via ottica. Usare solo pipette calibrate, con puntali ben fissati e pipettare accuratamente, senza fare bolle né schizzi. Portare a temperatura ambiente i campioni e i reagenti e miscelare bene prima dell uso. Mantenere la micropiastra al riparo dalle correnti d aria. La tecnica deve essere uniforme e precisa. Vedere 1e.