Il valore dei biomarcatori: l esempio della diidropirimidina deidrogenasi e del CYP2D6

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1 Periodico della Società Italiana di Farmacologia - fondata nel ANNO IX n. 34 Giugno 2013 Riconosciuto con D.M. del MURST del 02/01/ Iscritta Prefettura di Milano n. 467 pag. 722 vol. 2 ISSN Il valore dei biomarcatori: l esempio della diidropirimidina deidrogenasi e del CYP2D6 Marzia Del Re, Irene Del Re, Francesca Belcari, Romano Danesi Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Università degli Studi di Pisa La farmacogenetica in campo oncologico: validazione e costo-efficacia L introduzione di nuovi farmaci a bersaglio molecolare specifico nella terapia dei tumori e il perfezionamento delle conoscenze scientifiche su quelli di vecchia generazione hanno favorito la creazione di una nuova area di sviluppo ed innovazione rappresentata dalla personalizzazione delle terapie. La stratificazione dei pazienti sulla base delle caratteristiche somatiche (profilo molecolare del tumore) e germinali (caratteristiche metaboliche e farmacocinetiche del soggetto) comporterebbe un rapporto costo/beneficio migliore per i farmaci in generale e una maggiore utilità per quei chemioterapici che hanno efficacia in popolazioni limitate di pazienti oncologici. Tuttavia affiché questa stratificazione sia attuabile sono necessari: 1) studi clinici sufficientemente validati per questa stratificazione; 2) infrattutture tecnologiche e competenze professionali in grado di eseguire i test e fornire le informazioni necessarie al clinico; 3) valutazioni farmaco-economiche che dimostrino l efficacia di questa strategia. Una strada percorribile per intraprendere questa innovazione dovrebbe prevedere poche Unità dislocate sul territorio, che siano in grado di: 1) eseguire standard e procedure comuni di analisi molecolare (genomica e proteomica); 2) identificare le firme molecolari predittive di risposta e/o tossicità; 3) fare riferimento ad esperienze consolidate evitando una eccessiva diffusione di tests non sufficientemente validati e non accuratamente interpretabili; 4) sviluppare programmi di studio e di servizio in stretta collaborazione con l oncologo, il terapista del dolore e l anatomo patologo. 2. Il ruolo dei biomarkers: aspetti generali I biomarcatori possono essere distinti in: diagnostici: sviluppati per identificare una malattia ad uno stadio subclinico (es. antigene specifico prostatico [PSA] carcinoma prostatico); di suscettibilità/rischio: utilizzati per identificare il rischio di sviluppare una specifica malattia nella popolazione generale (es. BRCA1 carcinoma della mammella); prognostici: indicativi dell aggressività biologica di malattia (es. HER-2 carcinoma della mammella); predittivi di attività (mutazioni di EGFR-NSCLC/gefitinib, BRAF-melanoma/vemurafenib e CYP2D6/tamoxifene) o tossicità del trattamento (diidropirimidina deidrogenasi [DPD] tossicità delle fluoropirimidine). Il problema maggiore relativo all applicazione clinica dei biomarcatori è il trasferimento dei dati dal laboratorio alla clinica. Prima di potere essere utilizzato nel paziente, il biomarcatore deve essere validato nell ambito di studi clinici; tuttavia, gli studi pubblicati nella letteratura scientifica sul tema dei biomarcatori mostrano frequentemente problemi Quaderni della SIF (2013) vol

2 metodologici che possono essere riassunti come segue: numerosità del campione di pazienti insufficiente per identificare differenze tra le varianti di uno specifico gene associato al biomarcatore; scelta del polimorfismo genetico non sempre chiara; problema della rilevanza del polimorfismo germinale rispetto al somatico non sempre affrontata sistematicamente; correlazione del biomarcatore con endpoints clinici inadeguati (es. sopravvivenza globale vs. sopravvivenza libera da progressione); validazione del biomarcatore nell ambito di studi clinici retrospettivi invece che prospettici; ruolo della variabilità etnica non sempre affrontata; erronea attribuzione di valore prognostico/predittivo ad un biomarcatore. Un metodo preclinico/clinico per la validazione di un biomarcatore genetico è basato sui seguenti passaggi successivi: identificazione della variabilità della sequenza nel/i gene/i candidato/i; studi funzionali in vitro; studi clinici proof of concept ; studi di simulazione della pratica clinica; documentazione di variabilità sufficiente a predire l utilità clinica del biomarcatore; documentazione della superiorità della terapia selezionata con biomarcatore in confronto con il trattamento scelto con criteri tradizionali. Il ruolo dei biomarker: l esempio delle fluoropirimidine e della tossicità da carenza di enzima DPD Come esempio di biomarcatori predittivi di tossicità può essere ricordato il caso delle fluoropirimidine. Il 5-fluorouracile ed i suoi profarmaci sono comunemente utilizzati nella terapia di vari tumori solidi, come quello della mammella. Mentre i benefici della terapia con fluoropirimidine sono ben noti, la tossicità grave rimane uno dei maggiori problemi in clinica, in quanto, seppur raramente, può essere letale. Le tossicità associate al trattamento con fluoropirimidine sono di tipo gastrointestinale, cutaneo ed ematologico. Tuttavia, in circa lo 0,1-0,5% dei casi la combinazione di questi eventi tossici può essere letale. La diidropirimidina deidrogenasi (DPD) svolge un ruolo fondamentale nella via catabolica delle fluoropirimidine, in quanto trasforma il 5-fluorouracile in 5-diidrofluorouracile (metabolita inattivo) e costituisce l unica via di eliminazione del farmaco. Una carenza di DPD può causare un mancato metabolismo del 5-fluorouracile e lo sviluppo di tossicità (Fig. 1). L analisi della struttura del gene DPD ha consentito l identificazione di mutazioni che possono interferire con la regolare espressione ed attività catalitica dell enzima (Del Re et al, 2010). Sono state caratterizzate molte varianti del gene DPD, ma molte di queste sembrano non avere conseguenze funzionali sull attività enzimatica. Nel 40-50% dei pazienti con parziale o completa riduzione dell attività enzimatica della DPD è stato identificato il polimorfismo IVS14+1G>A che consiste in una mutazione puntiforme con sostituzione della guanina (G) in posizione 1986 con una adenina (A). La mutazione, che si localizza nella sequenza GT all estremità 5 dell introne 14, non permette il riconoscimento del sito di splicing del pre-mrna Fig. 1. Schema di attività enzimatica DPD e conseguenza della sua carenza sul metabolismo e tollerabilità delle fluoropirimidine. 5-FU, 5-fluorouracile; 5-FDHU, 5-fluorodiidrouracile; DPD, diidropirimidinadeidrogenasi; 5-FdUMP, 5-fluorodeossiuridina monofosfato; TS, timidilato sintetasi Quaderni della SIF (2013) vol. 34

3 e causa la delezione dell intero esone che precede la mutazione con conseguente delezione di 55 residui aminoacidici nella proteina DPD che risulta inattiva. Nella condizione di eterozigosi si riscontra una riduzione dell attività DPD che diventa completa nei soggetti omozigoti e tale da determinare lo sviluppo di una tossicità letale da somministrazione di fluoropirimidine. Questo polimorfismo sembra non essere molto frequente nella popolazione, a differenza di altri polimorfismi che potrebbero essere correlati a tossicità comunque rilevanti. Altre mutazioni associate a tossicità, sebbene non sempre gravi, sono le seguenti: 496A>G, 1601G>A, 1627A>G, 1896T>C, IVS14+1G>A, 2194G>A, and 2846T>C (Del Re et al, 2010). La loro influenza sullo sviluppo di reazioni avverse dipende da una serie di fattori, tra cui lo stato allelico (omozigote/eterozigote) e la combinazione con altri polimorfismi. Nonostante queste evidenze, non sono ancora stati stabiliti protocolli condivisi per l identificazione dei pazienti a rischio. Sono stati applicati tests di fenotipizzazione per la misurazione dell attività enzimatica DPD; tuttavia si tratta di metodi complessi e fortemente influenzati dalla modalità di conservazione del campione di cellule su cui eseguire l analisi. Altri metodi misurano la concentrazione di metaboliti finali del 5-fluorouracile nel plasma, o valutano la concentrazione diidrouracile/uracile, ma anche questi metodi risultano poco affidabili e di difficile diffusione nella pratica clinica in quanto le modalità di conservazione del campione di sangue possono alterare il risultato finale dei test (Di Paolo et al, 2005; Bocci et al, 2006). A differenza di questi, la stabilità del DNA offre indubbi vantaggi e per questa ragione si ritiene che l approccio ottimale al problema consista nella genotipizzazione del gene DPD sia per i pazienti candidati al trattamento con fluoropirimidine sia in coloro che hanno manifestato tossicità avendo già ricevuto una terapia con 5-fluorouracile o capecitabina. Il ruolo dei biomarker: l esempio del tamoxifene e del ruolo del CYP2D6 sull efficacia del trattamento antiestrogeno Gli isoenzimi del citocromo P450, localizzati nel reticolo endoplasmico, sono espressi principalmente nel fegato, ma anche a livello della mucosa gastrointestinale, del sistema nervoso centrale ALLELI CYP2D6 *1, *2, *33 e *35 Normale *3, *4, *5, *6, *7, *8, *11, *16, *18, *19, *20, *21, *36, *38, *40, *42, *44, *56, *62 e del rene. Questi enzimi utilizzano l ossigeno per trasformare numerosi farmaci in composti più polari che possono poi essere eliminati attraverso le urine o ulteriormente metabolizzati attraverso il fegato. La superfamiglia CYP è divisa in famiglie e sottofamiglie di enzimi sulla base dell omologia nella sequenza aminoacidica; gli isoenzimi presenti nell uomo appartengono alle famiglie CYP 1-4. Tra i numerosissimi isoenzimi identificati, i citocromi CYP1A2, CYP2C9/19, CYP2D6, e CYP3A4 sono particolarmente importanti nel metabolismo di farmaci appartenenenti praticamente a tutte le categorie terapeutiche (Bevera- ATTIVITÀ ENZIMATICA Assente *9, *10, *17, *29, *41, *69 Ridotta *1xn, *2xn, *35xn Aumentata Tabella 1. Alleli CYP2D6 ed effetto sul fenotipo enzimatico. POTENTI MODERATI DEBOLI POTENZA INCERTA Fluoxetina Paroxetina Bupropione Chinidina Cinacalcet Ritonavir Sertralina Duloxetina Terbinafina Buprenorfina Amiodarone Tabella 2. Alcuni farmaci inibitori di CYP2D6. Antipsicotici Aloperidolo Risperidone Clorpromazina Antiistaminici Prometazina Clorfenamina Difenidramina SSRI Citalopram Escitalopram Clomipramina Doxorubicina Metoclopramide Metadone Ticlopidina Quaderni della SIF (2013) vol

4 ge et al, 2007). Un esempio di test predittivo si riferisce al CYP2D6, un enzima che trasforma il farmaco tamoxifene nella sua forma attiva endoxifene, che mostra un elevata attività antagonista per il recettore dell ormone estrogeno (Del Re et al, 2012). Il tamoxifene è il farmaco utilizzato per il trattamento ormonale adiuvante e della malattia metastatica nelle pazienti in premenopausa con neoplasia mammaria positiva al recettore estrogeno. Sono state identificate molte varianti genetiche dell enzima CYP2D6 (Tabella 1) che, funzionalmente, qualificano i pazienti in base alla loro attività metabolica, come di seguito specificato: metabolizzatore lento: omozigote per allele inattivo (es.: *4/*4); metabolizzatore intermedio: omozigote per allele a ridotta attività o eterozigote per allele inattivo o a ridotta attività (es.: *9/*9, *10/*10, *4/*9, *4/*10) metabolizzatore ultra-/: omozigote per allele ad attività normale o con amplificazione genica o eterozigoti per allele ad attività normale/ridotta (es.: *1/*1, *1/*1xn, **1xn/*1xn). Sulla base di queste evidenze funzionali e del rischio di inefficacia terapeutica che può manifestarsi nei pazienti metabolizzatori lenti dalla contemporanea somministrazione di farmaci inibitori del CYP2D6 (es. antidepressivi della classe SSRI, Tabella 2) che possono ulteriormente ridurre la produzione di endoxifene al di sotto di livelli farmacologicamente attivi, può essere proposto l algoritmo clinico descritto in Tabella 3. Conclusioni I biomarcatori ad alta densità cambieranno il nostro modo di trattare i pazienti; tuttavia, per essere utilmente applicati in clinica, dovranno essere risolti i problemi di interpretazione associati all elevata complessità dei dati ottenuti con le nuove piattaforme TIPOLOGIA DI PAZIENTE Paziente in premenopausa in trattamento con tamoxifene e candidata al trattamento con farmaci inibitori di CYP2D6 Paziente nella quale sussistano incertezze cliniche per la somministrazione di tamoxifene o inibitore di aromatasi Paziente in postmenopausa in trattamento con inibitore di aromatasi e in presenza di eventi avversi gravi (es. osteoporosi, dolore articolare intenso) ESITO DELLA GENOTIPIZZAZIONE Metabolizzatore ultra-/ Metabolizzatore ultra-/ Metabolizzatore ultra-/ PROVVEDIMENTO DA ADOTTARE Continuare la terapia con tamoxifene senza variazioni Incrementare la dose di tamoxifene del 100% (es. da 20 a 40 mg/die) Evitare la somministrazione di inibitori di CYP2D6 e considerare farmaci alternativi; oppure eseguire il trattamento per il minimo tempo possibile e incrementare la dose di tamoxifene del 150% (es. da 20 a 50 mg/die) Somministrare tamoxifene Somministrare inibitore aromatasi Somministrare inibitore aromatasi Sostituire con tamoxifene Sostituire con tamoxifene a dose maggiore (es. 40 mg/die) Valutare l opportunità di sostituire con tamoxifene a dose maggiore al 150% (es. 50 mg/die) o trattamento alternativo (es. fulvestrant) Tabella 3. Algoritmo decisionale per l applicazione della genotipizzazione di CYP2D6 nella prassi clinica Quaderni della SIF (2013) vol. 34

5 tecnologiche (genomica, trascrittomica, proteomica, metabolomica) e sarà indispensabile determinare algoritmi clinici robusti per l applicazione razionale dei biomarcatori per la stratificazione dei pazienti. BIBLIOGRAFIA Beverage JN, Sissung TM, Sion AM, Danesi R, Figg WD. CYP2D6 polymorphisms and the impact on tamoxifen therapy. J Pharm Sci. 2007;96(9): Bocci G, Barbara C, Vannozzi F, Di Paolo A, Melosi A, Barsanti G, Allegrini G, Falcone A, Del Tacca M, Danesi R. A pharmacokinetic-based test to prevent severe 5-fluorouracil toxicity. Clin Pharmacol Ther. 2006;80(4): Del Re M, Di Paolo A, van Schaik RH, Bocci G, Simi P, Falcone A, Danesi R. Dihydropyrimidine dehydrogenase polymorphisms and fluoropyrimidine toxicity: ready for routine clinical application within personalized medicine? EPMA J. 2010;1(3): Del Re M, Michelucci A, Simi P, Danesi R. Pharmacogenetics of anti-estrogen treatment of breast cancer. Cancer Treat Rev. 2012;38(5): Di Paolo A, Danesi R, Ciofi L, Vannozzi F, Bocci G, Lastella M, Amatori F, Martelloni BM, Ibrahim T, Amadori D, Falcone A, Del Tacca M. Improved analysis of 5-Fluorouracil and 5,6-dihydro-5-Fluorouracil by HPLC with diode array detection for determination of cellular dihydropyrimidine dehydrogenase activity and pharmacokinetic profiling. Ther Drug Monit. 2005;27(3): Quaderni della SIF (2013) vol