17/05/2010 BIOSENSORI

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1 17/05/010 BIOSENSORI Sono dispositivi con un elemento sensibile di origine biologico. Di solito vengono utilizzate per misurare la concentrazione di una specie chimica. In questo caso sono in contatto con un trasduttore che converte il segnale di riconoscimento in un segnale elettronico o ottico. Bioreceptor+ transducer. Nel senso piu ampio, un biosensore puo anche essere l utilizzo di un elemento biologico per effettuare un sensing di tipo biomimetico, o l utilizzo di sensori che agiscono in maniera biomimetica. Api che sentono l odori di bombe e stupefacenti Nasi e lingue artificiali Sample Enzyme antibody cell optical electrical thermal Receptor Transducer Amplifyer computer data processing 1

2 17/05/010 Molecule Example Typical physiological values Ions Na+, +, Cl-, H+ 0.1 M Gases NH3, O, CO, CO, 0.1 M Metabolitesi Glucose, urea, creatinine, lactate 10 mm Drugsi Salicylate, acetaminofin, gentamicin 0.1 mm Steroids Cortisone 1 M Antibodies IgM, IgG 100 nm Hormones Insulin, prolacin, HCG 10 nm Antigens Hepatite, HIV, alfa-feto protein 0.1 nm DNA, RNA Poco Altre Citochine, fattori di crescita, marker tumorali pm Esistono una grande varietà di sostanze che possono essere misurate -il biosensore deve avere un segnale di uscita ripetibile e preciso, ed avere una sensibilità e risoluzione adeguata per la sostanza presa in esame. --- deve avere un range dinamico tale da coprire la variabilità di tutti i casi clinici, sia normali che patologici. (glucosio mm al 0 mm, ormoni nanomolari. Deve quindi essere sintonizzato sull applicazione prevista. - il sistema di misura deve essere insensibile a variazioni termiche, essere robusto e senza necessitare di frequenti calibrazioni o interventi tecnici. Inoltre, è essenziale che il sensore sia economico, user-friendly e di dimensioni contenute. - deve essere abbastanza veloce, nell ordine di qualche minuto. - Il volume del campione prelevato (tipicamente sangue ma meglio saliva, sudore o urina) deve essere piccolo non più di alcune decine di microlitri. - per quanto riguarda i sensori impiantabili, cosa ancora molto distante dal punto di vista della loro realizzabilità, ci sono ulteriori requisiti di biocompatibilità e non-tossicità.

3 17/05/010 -monitoraggio continuo ex-vivo terapie di cura intensiva, bed-side, con l uso di tecniche di prelievo, eparinizzazione, diluzione e dialisi, ed eventuale reinfusione. eg monitoraggio dello stato immunitario di un paziente recentemente sottoposto a un trapianto d organo. -monitoraggio continuo in-vivo Eg glucosio: Un dispositivo per monitoraggio in-vivo richiede un piccolo sensore impiantabile o operante per via transcutanea con una lettura digitale, che dia un indicazione della concentrazione di glucosio almeno ogni paio di minuti. -monitoraggio ex-vivo e discontinuo Al momento attuale sono gli unici tipi di sensori disponibili a livello commerciale; nel senso più corretto della parola devono essere chiamati "saggi" anzichè sensori. Teg, DNA, glucosio, gravidanza, fertilità ecc. Generalmente sono nella forma di uno "stick" e sono di tipo "usa e getta". Evitano le procedure di analisi di laboratorio, che possono essere laboriose e complicate, e forniscono un unica lettura della concentrazione di analita (ad esempio glucosio o ormoni). Per ora rimangono comunque meno affidabili delle analisi di laboratorio perché l'accuratezza dipende sia dal paziente che da fattori fisiologici, ad esempio il livello di ematocrito e di idratazione. I biosensori DIVIDERE PER TIPO DI RECETTORE DIVIDERE PER MECCANISMO DI TRASDUZIONE 3

4 17/05/010 ENZYME BIOSENSORS Analyte Enzyme Transduction mechanism Glucose Glucose oxidase partial pressure O, dissociation HO, ph, optical (es. quenching), thermic Urea urease partial pressure NH3, ph, optical (es. quenching), thermico Amino acids Amino acid oxidase partial pressure NH3, thermic Ethanol alcohol dehydrogenase electron transfer, thermic Lactate lactate dehydrogenase electron transfer, termico Penicillin penicillinase ph, thermic Cholestorol Cholestrol oxidase Pressione parziale of O, dissociaton of HO Lactate lactate dehydrogenase Optical, ph Enzimi Anticorpo DNA/RNA Cellule Batteri Tessuti RECETTORE 4

5 17/05/010 TRASDUZIONE Ottico TIRF, assorbanza, SPR, Guide d onda Elettrico Potenziometrico, amperometrico, impedenza, Gravvimetrico: Quarzi a risonanza, punte AFM Aspetti critici dell interfaccia L orientazione - Legami non-specifici - Stabilità - Perdita o diminuzione di funzionalità - Reversibiltà 5

6 17/05/010 Assemblaggio polielettroliti Legame covalente Adsorbimento fisico entrappolamento 6

7 17/05/010 Sensori enzimatici trasduttore Enzima S P S +1 E+S ES E+P -1 V ds - dt [ ES] [ Eo][ S] m [ S] m is the Michaelis constant ( m =( -1 + )/ +1 )) and E o the initial enzyme concentration. When [S] >> m, V=V m, maximum reaction velocity so V m = [E o ]. 7

8 17/05/010 Most enzyme sesnsors measure the increase in partial pressure of a gas generated during the catalytic reaction or a ph variation through the use of electrodes. For example in the case of a urea sensor, with the enzyme urease, the reactions are : urease O=C(NH ) (urea) + H 0 CO +NH 3 At physiological ph, CO & NH 3 dissociate: CO + H O HCO H + NH 3 + H O NH OH - So urea can be detected by a sensor for CO or NH 3 partial pressures or a ph sensor. Biosensors for glucose: Sensors for diabetes control Definition of hyperglicemia: fasting glucose above 110 mg/dl. (Normal is 60) Most glucose biosensors are based on the oxidation of glucose catalysed by glucoseoxidase (GOD). The enzyme GOD, usually extracted from yeast, oxidises glucose through the following reaction C 6 H 1 O gluconic acid + H 0 The most widely studied and used glucose bisensors ( even for in-vivo use) are electric and exploit the above oxidation reduction reaction. Glucosio + GOD(FAD + ) acido gluconico + GOD (FADH ) Dove FAD è una flavina che funziona da cofattore dell'enzima GOD a cui è legato. Il GOD (FADH ) è solitamente riossidato tramite reazione con ossigeno GOD(FADH ) + 0 H 0 + GOD(FAD + ). La sequenza di reazioni enzimatiche può essere riassunta come: GOD glucosio + 0 H 0 + acido gluconico, 8

9 17/05/010 I sistemi sensoristici per la misura del glucose in applicazioni biomediche devono rispondere a particolare requisiti: Devono essere in grado di misurare concentrazioni di glucose nel sangue o tessuti interstiziali in un range da 36 a 360 mg/dl ( mm a 0 mm), con risposta ben definita e ripetibile. Il sensore deve essere estremamente specifico per il glucose - questo è il caso per l'enzima glucose-ossidasi (GOD) che è alla base di quasi tutti i sensori per il glucose. Deve avere un tempo di risposta veloce (dell'ordine di pochi minuti, tempo di risposta tipico del pancreas). Deve avere una risposta che è indipendente dalla idrodinamica dei fluidi corporei (es. al flusso di sangue) e dalla concentrazione di ossigeno. Deve essere stabile sia meccanicamente che chimicamente. Sensore potenziometrico E un elettrodo per ph, composto da una membrana di vetro permeabile agli ioni H + che costituisce l'elettrodo di misura vero e proprio, ed un elettrodo di riferimento (ad esempio di Ag/AgCl). ). Il potenziale sviluppato dalla membrana è dato dall'equazione di Nernst: RT o - ln a ZF Dove o è il potenziale standard, è la costante dei gas, T la temperatura in elvin, Z la valenza dello ione (H + nel caso di un potenziometro per ph), con attività a (sarebbe la concentrazione) ed F è la costante di Faraday. Quindi il potenziale sviluppato è proporzionale al ph. Nel caso dei sensori potenziometrici per il glucose, l elettrodo di ph viene modificato intrappolando molecole di GOD tra l'elettrodo di vetro e la soluzione da analizzare. Tale sistema è in grado di misurare la riduzione del ph locale dovuta alla produzione di acido gluconico generata dall'ossidazione del glucose. 9

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11 17/05/010 Teoria della reazione enzimatica : sensore potenziometrico Un elettrodo a enzima opera un processo a 5 passi: 1)il substrato deve essere trasportato all superficie esterna dell'elettrodo (la membrana); (x=l) )deve diffondere attraverso la membrana; (da x=l a X=0) 3)deve avvenire la reazione; 4)il prodotto formato nella reazione enzimatica deve essere trasportato fino alla superficie interna dell'elettrodo; (a x=0) 5)il prodotto deve essere misurato alla superficie dell elettrodo x x=l x=0 soluzione Enzima intrappolata elettrodo Schema di un elettrodo ad enzima potenziometrico in sezione. Si considera un sistema planare, con elettrodo posto a x=0 e la membrana a x=l. La soluzione estende fino a x=. Le assunzioni: 1)il trasferimento di massa dalla soluzione di bulk fino alla superficie esterna dell'elettrodo sia molto rapido; )la reazione enzimatica obbedisca alle cinetiche di Michaelis e Menten; 3)il raggio di curvatura dell'elettrodo sia infinito rispetto allo spessore dello strato enzimatico (L), così da considerare piano il sistema. Le equazione che descrive le velocta` di conversione del substrato S e generazione del prodotto P è: S S V S DS t x M S P P V S DP t x S M D S D P x S P x ES S ES S M M Che praticamente è l equazione di Fick combinato con la reazione enzimatica. D s e D p sono sono le costanti di diffusione rispettivamente del substrato e prodotto. 11

12 17/05/010 Consideriamo il caso limite, [S] L << M, che è un caso normalmente riscontrato. [S] L è la concentrazione del substrato a L. All equilibrio, le velocita sono uguale a zero, quindi si ottiene: x x S E P S D D S p S dove M D S Le condizioni al contorno sono: Il substrato non passa attraverso l elettrodo La concentrazione di S rimane constante da x= fino a x=l (volume infinito) Il prodotto non passa attraverso l elettrodo La concentrazione di P nel volume è trascurabile S x 0 per x 0 S S per x L P x L 0 per x 0 [P]=0 per x=l x x=l x=0 soluzione Enzima intrappolata elettrodo 1

13 17/05/010 x x S P S D D S p S S Ae X Be X 1. S x P x 0 per x 0. S S L per x L per x 0 [P]=0 per x=l X X Per 1. A=B S Ae e Acosh x Per. S X L S L AcoshL cosh quindi x S coshl S L A cosh L S L Ds x Dp x S P S Ds x V M V S S S S M D p 0 x 0 P 0 S Ds x D S D S x P x p 0 per x 0 [P]=0 per x=l x P 0 P Dp x cos tan te A x = Lsono i flussi diffusi del substrato in ingresso e del prodotto in uscita dallo strato di enzima. Il sistema è conservativo quindi la somma dei due flussi deve essere zero. 13

14 17/05/010 D S S x P Dp x P x 0 per x 0 [P]=0 per x=l D s S + D p P= Per x=l, P=0, D s [S] L = cosi P DS S L D D P S S D D S P S L S Sostituendo per [S] da cosh x S coshl S L Si ottiene D S cosh x P S L 1 DP coshl P x0 DS Dp S L 1 1 coshl 14

15 17/05/010 P x0 DS Dp S L 1 1 coshl Questa espressione mostra che per [S] L << M la concentrazione di prodotto alla superficie x=0 è direttamente proporzionale alla concentrazione di substrato nel bulk, quindi il segnale di tensione rilevato è a sua volta proporzionale a tale concentrazione. Il parametro adimensionale L incorpora tutte le variabili cinetiche importanti del sistema. Il parametro adimensionale L rappresenta il rapporto tra il tempo di diffusione e di reazione, e si chiama il numero di Thiele ( ) E M D S S P Andamento della concentrazione (normalizzata) di [P] e [S] in funzione della distanza (normalizzata in %) nel caso che sia [S] L << M. 15

16 17/05/010 Ad esempio l enzima estratta da Aspergillus niger ha una m di 0.1 M. Quindi, nel caso di glucose nel sangue, con una concentrazione di 8 mm (lieve ipoglicemia), siamo nelle condizioni [S] L << M. Per un rapporto D s /D p =1, e per L=500 m, e =1s -1, D s =10-10 s -1 m possiamo calcolare la concentrazione di acido gluconico prodotto al elettrodo. Una concentrazione tipica di glucose ossidase che può essere intrappolato è 1 µg/ml. Calcolare L e stimare il valore di potenziale sviluppato alla membrana. P x0 DS Dp S L 1 1 coshl E M D S Sensore Amperometrico La struttura dei sensori amperometrici è simile a quella dei sensori potenziometrici. Dal punto di vista funzionale invece, i primi si differenziano dai secondi per il passaggio di corrente che si genera fra i due elettrodi tra cui viene applicato un potenziale elettrico. La corrente generata all equilibrio è dovuta al trasferimento di elettroni tra la superficie enzimatica e gli elettrodi ed è proporzionale alla concentrazione di specie elettroattive. I sensori amperometrici riescono a misurare la riduzione della pressione parziale di ossigeno che viene consumato con la riduzione al catodo (-600 mv) o l'ossidazione di H 0 all'anodo (+600 mv). I sensori amperometrici maggiormente sviluppati per l analisi del glucose sono quelli in cui un anodo di platino polarizzato a circa 600mV rispetto ad un elettrodo di riferimento (di solito a calomelano), ossida elettrochimicamente l'h 0 H 0 - H e - Nel caso di un sensore amp, il segnale dipende dal flusso di prodotto attraverso la membrana (elettroni). La corrente generato è dato da (dp/dx)*z*f*l*a 16