Citotossicità mediata dai linfociti T CD8 + nell eziologia eziologia di patologie neurodegenerative. Manuele Ongari

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1 Citotossicità mediata dai linfociti T CD8 + nell eziologia eziologia di patologie neurodegenerative Manuele Ongari Esame di Immunologia Scuola di specializzazione in Biochimica clinica

2 I LINFOCITI T CD8 + mediano immunità citotossica nei confronti di cellule infettate da endoparassiti (principalmente virus), invisibili ad immunità innata ed umorale una volta penetrati nell ospite recettore dei T CD8 + riconosce e lega il complesso peptidi-mhc MHC-I MHC-I I presenta peptidi sintetizzati nel citosol e trasportati nel RE da proteine TAP1-2

3 I LINFOCITI T CD8 + attivati dal legame con lo specifico antigene inducono apoptosi delle cellule target tramite rilascio di perforina 1 e di peptidasi verso le cellule bersaglio tramite il legame delle proteine Fas di membrana delle cellule bersaglio

4 T CD8 + : armi potenti ma aspecifiche Come salvare i testimoni innocenti? selezione delle TCD8 + e estremamente attenta e richiede prevalentemente l intervento delle cellule dendritiche o costimoli potenti da parte di TCD4 + helper e IL2 in caso di APC diverse cellule bersaglio esprimono MHC-I I e Fas sotto stimoli infiammatori specifici (TNFβ e INFγ) legame TCD8 + - bersaglio provoca risposta fortemente polarizzata verso la cellula target

5 In caso di difettosa selezione e regolazione dell attivit attività dei TCD8 + attivita citotossica-infiammatoria infiammatoria rivolta contro il SNC può provocare patologie degenerative

6 Meccanismi dell autoreattivit autoreattività: presenza di linfociti T autoreattivi non deleti mimetismo molecolare tra antigeni patogeni ed antigeni self crossreattivita tra antigeni patogeni ( viral( dejà vu)

7 1) Malattie neurodegenerative autoimmuni da mimetismo molecolare si sospetta da tempo che malattie quali SM abbiano base autoimmune istologia mostra reazione infiammatoria e infiltrazione di TCD4 + Th1 Ikuo Tsunoda et al. dimostrano per la prima volta il coinvolgimento diretto dei TCD8 + inoculo i.c. su cavie naive provoca degenerazioni infiammatorie e demielinizzazione simili a SM anche dal punto di vista istologico

8 Fase sperimentale-1 inoculo i.c. in topi sani del virus dell encefalomielite encefalomielite murina di Theiler (TMEV) che infetta in modo persistente gli oligodendrociti Risultati-1: TMEV provoca una degenerazione simile a SM con demielinizzazione per: coinvolti anche i TCD8 +? - azione diretta del virus - azione citotossica da Ab - azione infiammatoria di Th1

9 Fase sperimentale-2 Preparazione di cloni TCD8 + anti-tmev TMEV: prelievo di cellule della milza da topi infettati con TMEV arricchimento in TCD8 + tramite Abs anti CD4 stimolazione dei TCD8 + tramite incubazione con APCs presentanti antigeni di TMEV e IL2 verifica del fenotipo TCD8 + tramite analisi FACS

10 Fase sperimentale-2 inoculo i.c. di TCD8 + anti-tmev attivati in topi naive controlli: topi naive inoculati con - PBS - TCD8 + anti-tmev non attivati - TCD8 + attivi non vs TMEV osservazione clinica dei topi e analisi istologica dei tessuti ricerca antigeni virali nei tessuti con immunocitochimica

11 Risultati-2 topi naive trattati meningite reattiva, ampie degenerazioni tissutali, demielinizzazione e gliosi intensa non solo in sede di iniezione (cervello) ma anche in sedi lontane (midollo spinale) controlli non osservati fenomeni degenerativi ma solo lieve gliosi localizzata al sito di iniezione immunocitochimica dei tessuti bersaglio no antigeni virali, no contaminazione da parte di TMEV

12 Fase sperimentale-3 Studi in vitro: incubazione di TCD8 + anti-tmev con cellule del SNC infettate da TMEV in presenza e assenza di Abs anti MCH-I I o MCH-II incubazione dei TCD8 + anti-tmev con cellule del SNC non infettate da TMEV in presenza e assenza di Abs anti MCH-I I o MCH-II osservazione istologica e dosaggio delle citochine presenti nel terreno di coltura

13 Risultati-3 TCD8 + attaccano cellule target infettate da TMEV molto efficacemente TCD8 + attaccano cellule target anche non infettate da TMEV anche se con minor efficacia effetto litico sulle cellule target inibito dalla presenza di Abs anti-mhc MHC-I ma non da Abs anti-mhc MHC-II conferma coinvolgimento di TCD8 + livelli apprezzabili di INFγ nel terreno di incubazione prodotto dai TCD8 +

14 Discussione TCD8 + riconoscono su oligodendrociti e neuroni antigeni self simili ad antigeni virali (mimetismo molecolare) TCD8 + infiltrati producono INFγ che permette esposizione di complessi MHC-I - peptidi a livello del SNC rendendo riconoscibili i target da parte dei TCD8 + autoreattivi per la prima volta trasferimento di TCD8 + in animali naive si ottiene una degenerazione infiammatoria del SNC simile a SM

15 Quale antigene riconosciuto dai TCD8 +? libreria di cdna di proteine espresse da cellule del SNC infettate e non da TMEV inserimento della libreria in astrociti non infettati da TMEV e non riconosciuti da TCD8 + anti-tmev incubazione dei diversi cloni con TCD8 + autoreattivi fino a trovare quelli target caratterizzazione del cdna

16 2) Malattie neurodegenerative autoimmuni da viral dejà vu o crossreattività virale esistono malattie neurodegenerative (es. encefalite di Rasmussen,, RE, e in parte la SM) in cui la risposta autoimmune da parte di TCD4 + Th1 e TCD8 + segue a infezioni virali autoreattività scatenata contro antigeni virali persistenti e tollerati da sistema immune su cui si innesta infezione virale secondaria crossreattiva

17 Fase sperimentale-1 Modelli di infezioni virali persistenti: inoculo i.c. in topi neonati (< 24h) di virus della coriomeningite linfocitaria (LCMV) tolleranza verso il virus che persiste nei neuroni inoculo i.c. in topi neonati di LCMV ricombinante, in cui GP wt sono state sostituite con GP di virus di stomatite vescicolare sierotipo Indiana (rlcmv( rlcmv/indg) infezioni meno efficaci ma uguale capacità di dare persistenza controlli: inoculi di LCMVwt e rlcmv/indg in adulti normali eliminazione completa del virus

18 Fase sperimentale-2 Carico con ceppo virale LCMVwt attivo (ARM) di: topi naive adulti topi adulti normali immunizzati contro rlcmv/indg topi carrier del ceppo rlcmv/indg reso persistente da infezione neonatale

19 Risultati-2 topi naive no risposte immune (come atteso) topi adulti normali immunizzati rapida (4gg) ed efficace risposta di memoria topi carrier risposta di memoria lenta (8gg) e poco efficace infiltrazione del SNC da TCD8 + con risposta infiammatoria legata a INFγ (quadro di meningite simile a RE)

20 Fase sperimentale-3 Ricerca di RNA virale nei tessuti di topi carrier dopo carico con LCMVwt (ARM) RNA nel SNC Risultati-3 no tracce RNA virale nei tessuti linfoidi restrizione virale al SNC dovuta a immunità innata, non ad acquisita nén a tropismo di LCMV (virus pantropico)

21 Fase sperimentale-4 Ricerca dell antigene comune tra LCMVwt e rlcmv/indg alla base della crossreattività: antigeni condivisi tra i due ceppi solo NP e non GP tra gli NP, solo NP396 evoca reattività di TCD8 + topi carrier rlcmv/indg resi tolleranti verso NP396 rimangono sani dopo inoculo con LCMVwt (ARM) inoculo di virus rlcmv privati di NP396 topi carrier per rlcmv/indg rimangono sani dopo inoculo con LCMVwt (ARM)

22 Discussione Inoculo di rlcmv/indg nei topi neonati: LCMV è pantropico,, ma in prima infezione è eliminato da immunità innata che determina la sua permanenza in SNC in assenza di adeguata risposta citotossica TCD8 + né deleti né stimolati in modo efficace (attivazione subliminale) reinfezione con virus correlato in epoca differente provoca l infiltrazione dei TCD8 + nei tessuti dove antigene virale e e persistente (SNC) provocando risposta infiammatoria citotossica e neurodegenerazione

23 Meccanismo del viral dejà vu -1 crossreattività tra due agenti virali correlati che infettano l ospite con una precisa cronologia e in precise condizioni ambientali un primo virus attacca l ospite l in condizioni di debolezza /immaturità immunitaria determinando un infezione persistente in un tessuto protetto con risposta linfocitaria inadeguata ma di memoria virus predisponente una seconda infezione con virus crossreattivo provoca attivazione di risposta citotossica di memoria contro tessuti che portano l infezione l persistente virus precipitante

24 Meccanismo del viral dejà vu -2 virus predisponente è ristretto nei tessuti ospiti per azione dell immunit immunità innata virus precipitante penetra attraverso via olfattive o nervi periferici o nel sangue e da qui si infiltra nel tessuto di persistenza (++SNC) soprattutto in condizioni di debolezza della barriera ematoencefalica autoimmunità e mimetismo molecolare implicano teoria del campo fertile ; viral dejà vu sembra determinato da fattori ambientali

25 Prospettive future viral dejà vu nell uomo potrebbe spiegare alcune patologie neurodegenerative (es SM, RE)? vedi crossreattività tra HHV 6A (raro e reattivo e sierologicamente identico) e 6B (diffusissimo e persistente in SNC) viral dejà vu offrirebbe possibilità di diagnosi, prevenzione e cura vaccini e farmaci per prevenire/eradicare eradicare infezione predisponente necessità di distinzione dei ceppi persistenti/predisponenti predisponenti crossreattivi tramite fingerprinting e non per indagini sierologiche e individuazione di tessuti infetti in modo persistente