10/04/2013. Extracellular Matrix (ECM) Matrice ExtraCellulare. Introduzione

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1 Take home message Matrice ExtraCellulare Il comportamento cellulare (metabolismo, proliferazione, differenziamento o staminalità, migrazione, apoptosi) non dipende solo da caratteristiche intrinseche delle cellule, ma è strettamente condizionato dall interazione tra cellule, matrice e microambiente cellulare. Introduzione Extracellular Matrix (ECM) A collection of proteins and carbohydrates produced by cells that forms a matrix outside the cell a.k.a. connective tissue, interstitium The extracellular matrix is interesting to biotech because it: Is involved in disease processes, including atherosclerosis, cancer, arthritis, lupus Is a major impediment to gene therapy Interactions of the matrix with cell surface receptors influence cell behavior and gene expression. Creating artificial matrices is a big part of tissue engineering, and one of the biggest challenges. Lukashev ME, Werb Z. ECM signalling: orchestrating cell behaviour and misbehaviour. Trends Cell Biol. 8: , Matrice extracellulare e matrichine, segnali criptici fondamentali per il dialogo locale cellula-matrice (1) La matrice extracellulare è una struttura dinamica ricca di proteine multimodulari altamente glicosilate e di polisaccaridi che sorreggono meccanicamente e orientano le cellule che vi poggiano ma soprattutto modulano e pilotano ad ogni momento il loro comportamento (metabolismo, proliferazione, differenziamento o staminalità, migrazione, apoptosi) A loro volta le cellule condizionano la composizione e dinamica della matrice. 1

2 Matrisoma Elenco delle proteine che costituiscono la matrice extracellulare e di quelle che contribuiscono alle matrici in diverse situazioni. Le proteine della matrice tipicamente contengono ripetizioni di un insieme caratteristico di domini: LamG (Laminin G), TSPN (thrombospondin), FN3 (fibronectin 3), VWA (von Willebrandt A), Ig (immunoglobulin), EGF (epidermal growth factor), prodomini del collagene, ecc. Molti di questi domini non sono specifici delle proteine della MEC, ma la loro disposizione è unica e caratteristica Matrice extracellulare e matrichine, segnali criptici fondamentali per il dialogo locale cellula matrice (2) La proteolisi della matrice in situazioni normali e patologiche induce varchi che facilitano la migrazione cellulare e provoca il rilascio in soluzione nel liquido interstiziale di frammenti peptidici o la comparsa sulla superficie proteica di moduli precedentemente situati in posizione criptica, che sono riconosciuti da integrine sulla superficie cellulare comportandosi da fattori di crescita o di differenziamento. I proteoglicani e l acido ialuronico permettono una concentrazione localizzata di tali segnali contribuendo alla diversificazione del microambiente cellulare. Matrice extracellulare, introduzione (1) Nonostante la MEC sia composta soltanto da cinque classi di macromolecole collageni, elastina, acido ialuronico, proteoglicani, glicoproteine essa può assumere una ricca varietà di forme con proprietà meccaniche altamente differenziate. Matrice extracellulare 2

3 Matrice Extracellulare Materiale acellulare che circonda le cellule Struttura della MEC: Fibre: collageno ed elastina, che forniscono resistenza e flessibilità Proteoglicani: complessi proteinepolisaccaridi che forniscono una matrice voluminosa Glicoproteine adesive: incollano le cellule e la MEC, ad es. fibronectina e laminina. MEC: Macromolecole secrete localmente da cellule specializzate Fibroblasti nei tessuti connettivi Condroblasti, osteoblasti: tessuti connettivi specializzati Cellule epiteliali e fibroblasti: lamina basale Funzione Sostegno meccanico per le cellule e per il tessuto Integrazione delle cellule in tessuti Influenzamento della forma e il movimento della cellule Influenzamento dello sviluppo e il differenziamento delle cellule Coordinamento delle funzioni cellulari mediante segnalamento attraverso recettori di adesione (e recettori associati) Riserva di molecole di segnalamento extracellulare. Legame con proteasi della matrice e loro inibitori Matrice Extracellulare, MEC Matrice Extracellulare E costituita da proteine e polisaccaridi secreti da quasi tutti i tipi cellulari (eccezione: eritrociti) Riempie gli spazi tra le cellule Collega tra di loro cellule e tessuti. Una sottile lamina basale sostiene meccanicamente e metabolicamente cellule epitaliali, cellule muscolari, cellule adipose e i nervi periferici: LAMINA BASALE E particolarmente abbondante nei tessuti connettivi. Gran varietà di polisaccaridi e (glico)proteine) altamente versatili che vengono secreti localmente e si assemblano in una rete organizzata Variazioni in: quantità relative macromolecole della matrice modo di organizzarsi Stupefacente diversità di forme, adattate alle richieste funzionali dei vari tessuti: Calcificazione: strutture dure e compatte delle ossa o dei denti Matrice trasparente: cornea Strutture cordoniformi: tendini Lamina di controllo della permeabilità: lamina basale MEC: RUOLO Impalcatura relativamente inerte per stabilizzare la struttura fisica tessuti??? NO!! Ruolo attivo e complesso di regolazione del comportamento delle cellule Influenza su: Sviluppo Migrazione cellulare Proliferazione Apoptosi Forma Funzioni metaboliche MACROMOLECOLE EXTRACELLULARI (1) A. Polisaccaridi di tipo glicosaminoglicani (GAGs) di solito legati covalentemente a proteine formando proteoglicani. B. Proteine fibrose: Predominantemente strutturali: collagene, elastina Predominantemente adesive: es: Fibronectina Laminina 3

4 MACROMOLECOLE EXTRACELLULARI (2) Fibre collagene: rafforzano e aiutano ad organizzare la matrice. Fibre di elastina: danno resistenza (capacità di riprendere la forma primitiva dopo deformazione) Proteine adesive: aiutano le cellule ad aderire alla matrice GAGs & Proteoglicani Sostanza fondamentale altamente idratata tipo gel in cui sono incluse le proteine fibrose: Fase acquosa del gel di polisaccaridi permette la diffusione di nutrienti, metaboliti, cataboliti e ormoni tra sangue e cellule. La matrice idratata Liquido interstiziale La MEC è essenzialmente un gel (solido fibroso permeato da un liquido viscoso) creato dalla ecellule che vi aderiscono. Structural fibers Collagens Elastin Matrice idratata Fluido extracellulare Proteoglicani Molecole adesive Fibronectina Laminina Il liquido interstiziale è fondamentale per mantenere l omeostasi fra le aree intracellulari e extracellulari. E composto da un vettore acquoso che contiene soprattutto acidi grassi, aminoacidi, zuccheri, coenzimi, messaggeri chimici quali citochine, ormoni, neurotrasmettitori, sali minerali e prodotti di scarto. University of Virginia Meccanotrasduzione e biotensegrità Mediante il processo di meccanotrasduzione, le cellule sono in grado di convertire alterazioni di tipo meccanico in alterazioni chimiche o genetiche. Le cellule mantengono la loro morfologia e funzione mediante un sistema di tensione integrato denominato tensegrità. 4

5 All interno delle cellule I microtubuli costituiscono le strutture di compressione, e l actina, strettamente associate ai filament di miosina, le strutture di tensione. La tensione meccanica generata dai movimenti è trasmessa mediante pressione alla MEC che a sua volta trasferisce i movimenti alle cellule mediante le integrine. Il citoscheletro traduce queste forze in segnali chimici e stimoli meccanici che sono trasferiti al nucleo tramite i filamenti intermedi che sono collegati a proteine dette nesprine e Sun. Queste a loro volta communicano con la lamina nucleare e la lamina con il DNA. Il nucleo stesso ha un sistema di tensegrità intriseca e attiva la proliferazione, il metabolismo, il differenziamento o l apoptosi in risposta a tali stimoli meccanici Lamina basale 5

6 Tipiche molecole della ECM ECM Collageni (Introd. 1) Si trovano in tutti i Metazoi e forniscono forza strutturale a tutte le matrice extracellulari, incluso le forti fibre dei tendini, le matrici organiche delle ossa e cartilagine, gli strati laminari delle membrane basali, la matrice viscosa dell umor vitreo e la matrice interstiziale del derma e delle capsule intorno agli organi. Tipica dei collageni sono le ripetizioni delle triplette Gly X Y in cui X è frequentemente la prolina e Y frequentemente la 4 idrossiprolina. Questa struttura ripetitiva forma «coiled coils» trimerici stabili, a forma di bastoncello, che possono avere lunghezza variabile. Le subunità dei collageni si assemblano come omotrimeri o come un insieme ristretto di eterotrimeri. Prolina Idrossiprolina Collageni (Introd. 2) Il tipo I dei collageni delle ossa e tendini contiene quasi interamente di una lunga (~1000 aa) e rigida tripla elica di collagene (più i prodomini terminali non collagenosi che vengono rimossi durante il processo di biosintesi della proteina). I trimeri a bastoncello si associano in oligomeri di ordine superiore e fibrille che possono creare ulteriormente legami incrociati («cross links») mediante diverse reazioni enzimatiche e non che conferiscono una considerevole resistenza strutturale. Molti altri tipi di collagene hanno interruzioni nella struttura ripetuta Gly X Y, il che introduce flessibilità alle molecole. Tutti i geni dei collageni codificano per domini non collagenosi addizionali, alcuni dei quali sono i caratteristici prodomini B e C terminali mentre gli altri sono domini condivisi con altre proteine della MEC e trattenuti nella proteina matura. Questi domini aggiuntivi conferiscono affinità di legame specifiche, permettendo alle molecole dei collageni di interagire le une con le altre e di assemblare le varie strutture. 6

7 Collageni (Introd. 3) Esempi di strutture multidominio dei collageni Fra le proteine tipo collagene o affini ai collageni, alcune sono proteine di membrana; Altre (ad es. la componente c1q del complemento e proteine simili) vengono secrete, ma la loro funzione principale non coinvolge la MEC e non sono considerate componenti del «matrisoma». Tuttavia, altre ancora (ad es. il dominio tipo collagene della acetilcolinesterasi) servono per ancorare altre proteine della MEC). Ancora altre (ad es. le proteine contenenti domini detti EMI) sono vere proteine della MEC. Didascalia figura precedente (Esempi di strutture di collagene) ECM - GLICOSAMINOGLICANI A. Il collagene di tipo I è un collagene fibrillare con un dominio collagenoso continuo di circa 100 AA (fucsia) comprendente ripetizioni Gy X Y che formano una triplice elica. E codificato da esoni multipli (notare linee verticali) che sono varianti di un esone primordiale che codifica sei di tali ripetizioni. Il dominio collagenoso è fiancheggiato da domini N e C terminali non colagenosi, rimossi per proteolisi per permettere la fibrillogenesi del collagene maturo. I domini VWC in questo e negli altri collageni possono subire splicing alternativo e legare bone morphogenetic proteins (BMPs). B. Il collagene di tipo IX è un collagene Fibril associated (FACIT); le interruzioni nel cominio collagene permettono il piegamento. Questo e altri collageni FACIT si associano con i collageni fibrillari e i loro N terminali protrudono dalle fibrille e presumibilmente fungono da domini leganti proteine. C. Il collagene di tipo VI è un eterodimero di tre subunità correlate, una delle quali è molto più lunga e forma una testa globulare ad ogni estremità. Domini vwa sono di solito domini leganti proteine che probabilmente permettono interazioni con altre proteine durante la formazione di corte fibrille del coll VI. PROTEOGLICANI ECM proteoglicani 7

8 ECM - PROTEOGLICANI ECM - CARTILAGINE Proteoglicani (Introd. 1) Possono essere considerati come glicoproteine con legati GAGs (polimeri ripetuti di disaccaridi con gruppi acidi e solfati legati) Sono frammisti alle fibrille collagene. Invece di fornire forza strutturale, conferiscono proprietà addizionali. L aggiunta dei GAGs conferisce ai proteoglicani una elevata carica negativa che li porta ad assumere una conformazione distesa in grado di sequestrare sia acquache cationi divalenti come il Calcio. Queste proprietà conferiscono funzioni di riempitori degli spazi vuoti e di lubrificazione. I GAGs e soprattutto l eparan solfato, legano inoltre molti fattori secreti e di crescita nella MEC. Proteoglicani (Introd. 2) Nel genoma dei mammiferi ci sono circa 3 dozzine di proteoglicani della MEC che subentrano in diverse famiglie. Le due famiglie più ampie sono quelle basate su ripetizioni LRR («Leucine Rich Repeat») e quelle contenenti domini LINK (regioni di legame all acido ialuronico) e domini «C type lectin» (moduli leganti carboidrati Cadipendenti) (ialectani). Molti dei proteoglicani LRR si legano a diversi collageni e a fattori di crescita. I membri della famiglia degli ialectani si legano a varie glicoproteine della MEC (ad es. tenascine) e, mediante il dominio LINK, all acido ialuronico. Queste funzioni di legame contribuiscono alla regolazione dei complessi proteici nella MEC. Hynes RO, Naba A. Overview of the matrisome an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol Jan 1;4(1):a Leucine-rich repeat rich_repeat Proteoglicani (Introd. 3) Inoltre, ci sono circa una dozzina di Pgs che non cadono in queste famiglie (es. lubricin/prg4, endocan/esm1, serglicina, ecc). Forse il più significativo di questi sia il Perlecano (HSPG2), una proteina multidominio che è il «core proteoglycan) di tutte le membrana basali. Ci sono inoltre molti altri esempi di Pgs che cadono in altre categorie (es. alcuni collageni, agrina, betaglicano, CD44 e altre glicoproteine) che sono talvolta o sempre modificate dal legame con GAGs. Ci sono infine due piccole famiglie di PGs integrali di membrana con catene laterali di eparan solfato (HS) Glipicani Sindecani e alcuni PGs transmembrana a Condroitin solfato (CS) 8

9 ECM - Glicoproteine FIBRONECTINA Laminina Fibronectina Glicoproteine (Introd. 1) Circa 200 tipi di glicoproteine complesse nel matrisoma dei mammiferi che svolgono miriadi di funzioni: Interazioni che permettono l assemblaggio della MEC; Presenza di domini e motivi che promuovono l adesione cellulare e segnalamento verso le cellule Domini che legano fattori di crescita. I fattori di crescita legati possono servire da serbatoi che possono venire rilasciati (ad es. mediante proteolisi) oppure presentati come ligandi in fase solida dalle proteine della MEC. Le più note sono le laminine (11 geni; 5 tipi di catene α, 3 tipi di catene β, 3 tipi di catena γ) e le fibronectine (1 gene che codifica diverse varianti di splicing). Sono molto studiate anche le trombospondine e le tenascine. Glicoproteine (Introd. 2) Esempi di strutture caratteristiche delle glicoproteine della MEC Due sottogruppi sono studiati particolarmente nell ambito del sistema nervoso (es. netrins, slits, reelin, agrin, SCO-spondin) e del sistema emostatico (fattore di von Willebrand, vitronectina, fibrinogeno una proteina facoltativa della MEC). Un altro gruppo molto studiato in diversi contesti normali e patologici che riguardano la regolazione del Transforming Growth Factor beta (TGF- β) comprende le fibrilline e le «Latent transforming growth-factor b-binding proteins, LTBPs. 9

10 Fattori di crescita e secreti legati alla MEC (1) Molti fattori di crescita si legano alle proteine della MEC e debbono essere considerati come componenti della MEC. E vero che molti fattori di crescita e secreti si legano ai GAGs, e specialmente ai GAGs ad eparan solfato.. Tuttavia, molti fattori di crescita si possono legare a domini specifici della proteine della matrice: La fbronectina si può legare specificamente a diversi tipi di fattori di crescita (VEGF, HGF, PDGF, ecc.) I domini von Willebrand factor C (VWC/chordin) e follistatin che si trovano in molte protein legano le bone morphogenetic proteins» (BMPs), Il TGF si lega specificamente a domini TB delle «Latent transforming growthfactor b-binding proteins (LTBPs) che a loro volta si legano alle fibrilline e a matrici ricche di fibronectina. Importante: mutazioni nelle fibrilline influenzano la regolazione della funzione del TGF-β nel sindrome di marfan e altre patologie Fattori di crescita e secreti legati alla MEC (2) La MEC può fungere da serbatoio di fattori di crescita. Vi sono molti esempi di questo per le chemochine e per molti dei più importanti fattori di differenziamento (es. VEGFs, Wnt, Hhs, BMPs, FGFs) Tali fattori formano gradienti che controllano la formazione dei diversi pattern tissutali durante lo sviluppo embrionale; I gradienti sono fortemente influenzati dal legame alla MEC. [Chemochine: piccole citochine (molecole di segnalamento) secrete dalle cellule. Il nome deriva dalla loro capacità di indurre la chemotassi in cellule vicine responsive.] Agenti che modificano la struttura e la funzione della MEC (1) Le proteine della MEC e le fibrille in cui si assemblano sono in seguito spesso modificate in modo significativo. I collageni subiscono «cross links» mediante legami disolfuro (S S) o derivati dall azione di transglutaminasi o lisil ossidasi e idrossilasi.: Le laminine e altre proteine della membrana basale anche esse subiscono «cross links» mediante legami disolfuro. Idem per la fibronectina che inoltre subisce ulteriore processamento ad uno stato caratterizzato da insolubilità in desossicolato (DOC). Anche la fibronectina e altre proteine della MEC sono substrati per la transglutaminasi 2 che contribuisce indubbiamente per l insolubilità della MEC. Cross linking da legami disolfuro Meccanismo di azione delle transglutaminasi summer10/stryer6/ch02/figure2 21.jpg tokyo.ac.jp/nagamune/eeg.html 10

11 Agenti che modificano la struttura e la funzione della MEC (2) METALLOPROTEASI Anche gli enzimi proteolitici modificano la MEC: Ad es le propeptidasi dei procollageni sono necessarie per processare i collageni in modo che essi possano polimerizzare. I collageni e altre proteine della MEC sono inoltre substrati per le metalloproteinasi della matrice (MMPs) e per le proteasi ADAMTs («A Desintegrin and a Metalloproteinase with a Thrombospondin domain»). Molti altri enzimi proteolitici (elastasi, catepsine, diverse serine esterasi proteasi, ecc.) possono intervenire su diverse proteine della MEC. Queste proteasi sono coinvolte nel turn over della MEC e inoltre probabilmente contribuiscono a rilasciare fattori di crescita legati alla matrice oppure ad esporre attività criptiche della MEC, incluso il rilascio di inibitori dell angiogenesi. Struttura a domini delle MMPs Agenti che modificano la struttura e la funzione della MEC (3) Allo stesso modo, enzimi che degradano i GAGs, quali ad esempio le ialuronidasi, le eparanasi e le solfatasi, possono alterare le proprietà dei PGs della matrice. Il rimodellamento della MEC da parte di queste attività ha effetti estremamente importanti nello sviluppo embrionale e nelle patologie. aldrich/lifescience/biochemicals/migrationbiochemicals1/hyaluronidase_hyaluronic_ac.gif Recettori cellulari per la MEC (integrine e non solo) (1) La MEC influenza il comportamento cellulare tramite recettori specifici. I principali recettori sono la famiglia delle integrine, che comprende 24 eterodimeri αβ. Un altro recettore per le proteine della MEC è il distroglicano, che si lega alla laminina, agrina e perlecano nelle membrane basali ed anche alle neurexine transmembrana. Ciascuno di questi ligandi del distroglicano contengono domini LamG che si legano al distroglicano in modo dipendente dalla glicosilazione, probabilmente mediante legame alle catene di carboidrati laterali del distroglicano. Mutazioni nel distroglicano o nelle sue proteine associate nella membrana o nel citoscheletro (o nella laminina) possono produrre varie forme di distrofia muscolare, a causa della perdita del collegamento transmembrana alla membrana basale che circonda le cellule muscolari. 11

12 Recettori cellulari per la MEC (integrine e non solo) (2) Altri recettori cellulari per la MEC includono: La GPVI sulle piastrine e le tirosina chinasi «Discoidin domain receptor» (DDR), tutti recettori per i collageni. Il complesso GPIb/V/IX, che forma un recettore per il fattore di von Willebrand nelle piastrine CD44, che si lega all ialuronato ed è espresso in molte cellule. Oltre a collegarsi ai ligandi extracellulari questi recettori per la matrice forniscono collegamenti transmembrana al citoscheletro e alle vie di trasduzione del segnale. I domini citoplasmatici dei recettori per la MEC assemblano grandi complessi dinamici di proteine che regolano l assemblaggio del citoscheletro ed all interno delle cellule e attivano molte cascate di segnalazione Questo è vero non solo per le integrine ma anche per gli altri tipi di recettore. Le componenti extracellulari dell adesione cellulare In vitro, l adesione, l espansione e la migrazione delle cellule richiedono interazioni tra la cellula e la MEC. Il grado di espansione dipende dalla concentrazione delle componenti della MEC, ossia del numero di contatti focali stabiliti. Quando una cellula incontra quantità limitate di sostanze adesive, essa tende a migrare verso regioni dove la concentrazione è sufficiente per permettere alle cellule di espandersi. Sembra che la migrazione abbia luogo quando le interazioni cellulamatrice sono poche in numero ma tali da conferire la trazione necessaria per la migrazione: L aumento del numero di punti di adesione cellulare immobilizza la cellula. Si ritiene che meccanismi simili abbiano luogo durante lo sviluppo embrionale, i processi di riparo e la disseminazione metastatica. (Smith & Wood, 1999) Proteine della matrice MODULI E DOMINI 12

13 Domini modulari delle proteine 1 La maggior parte dei peptidi consiste in disposizioni lineari di regioni globulari, ripiegate in modo indipendente, dette domini, collegati in modo modulare. La maggior parte dei domini consiste di residui, ma i domini chinasici e i domini motori sono molto più estesi. Si pensa che ciascuna delle 1000 famiglie note di domini si sia evoluta da un antenato comune diverso. In questo senso, i membri di una famiglia vengono detti omologhi. Pollard & Earnshaw Domini modulari delle proteine 2 MODULAR PROTEINS CONSTRUCTED FROM EVOLUTIONARILY HOMOLOGOUS, INDEPENDENTLY FOLDED DOMAINS. A, Examples of protein domains used in many proteins: fibronectin 1 (FN I), fibronectin 2 (FN II), fibronectin 3 (FN III), immunoglobulin (Ig), Src homology 2 (SH2), Src homology 3 (SH3), kinase. (PDB files: 1FN7, 1PDC, 1FNA, 1IG2, 1HCS, 1PRM, and 1CTP.) B, Immunoglobulin G (IgG), a protein composed of 12 Ig domains on four polypeptide chains. Two identical heavy chains (H) consist of four Ig domains, and two identical light chains (L) consist of two Ig domains. The sequences of these six Ig domains differ, but all of the domains are folded similarly. The two antigen-binding sites are located at the ends of the two arms of the Y-shaped molecule composed of highly variable loops contributed by domains H1 and L1 Mediante processi di duplicazione genica, trasposizione e evoluzione divergente, i domini di impiego più ampio (ad es. il dominio immunoglobulinico) sono stati incorporati in centinaia di proteine diverse, dove svolgono funzioni caratteristiche e uniche. I domini omologhi in proteine diverse hanno ripiegamenti simili ma possono differire significativamente in sequenze aminoacidiche. Pollard & Earnshaw Pollard & Earnshaw Domini modulari delle proteine 3 PROTEINE: motivi, domini, moduli _ 1 Ciò nonostante, la maggior parte dei domini correlati può essere riconosciuta dalla presenza di patterns caratteristici di aminoacidi lungo le loro sequenze. Ad esempio, i residui di cisteina dei domini immunoglobulinici (Ig) sono distanziati in un pattern necessario per la costruzione di legami intramolecolari di tipo disolfuro. Più raramente, domini proteici con strutture correlate possono essere comparsi indipendentemente e convergiuto durante l evoluzione verso una conformazione particolarmente favorevole. Questa è l ipotesi avanzata per spiegare ripiegamenti simili dei domini immunoglobulinico e fibronectina III, che hanno sequenze aminoacidiche non correlate. I motivi sono combinazioni regolari di strutture secondarie Molte proteine contengono uno o più motivi, che consistono in particolari combinazioni di strutture secondarie. Un motivo è definito come una combinazione specifica di strutture secondarie che ha una topologia particolare ed è organizzata in una struttura tridimensionale caratteristica. Lodish/Alberts Pollard & Earnshaw 13

14 PROTEINE: motivi, domini, moduli _ 2 PROTEINE: motivi, domini, moduli _ 3 Il motivo a coiled coil comprende due, tre o quattro α eliche anfipatiche avvolte una attorno all altra. In questo motivo, le catene caterali idrofobiche di ogni elica si proiettano come protuberanze da una α elica e si inseriscono nei buchi fra le catene idrofobiche laterali dell altra elica lungo la superficie di contatto. Le subunità in alcune proteine multimeriche e in fibre a bastoncello sono tenute insieme da interazioni a coiled coil. Il motivo legante il Ca 2+ elica loop elica è caratterizzato dalla presenza di alcuni residui idrofilici in posizioni invariabili nell ambito del loop. In un altro motivo comune, il ditto di zinco, tre strutture secondarie una α elica e due foglietti β con orientamento antiparallelo formano un fascio a forma di dito tenuto insieme da un ione zinco. Questo motivo si trova frequentemente nelle proteine che legano il RNA o il DNA. La presenza dello stesso motivo con funzioni simili in proteine diverse indica che durante l evoluzione queste combinazioni utili di strutture secondarie sono state conservate Lodish/Alberts Lodish/Alberts Motivo coiled coil Motivo helix coil.helix Un dimero helix-loop-helix legato all impalcatura del DNA. Motivo Zinc finger PROTEINE motivi, domini, moduli 4 I domini strutturali e funzionali sono moduli della struttura terziaria La struttura terziaria delle proteine di grandi dimensioni è spesso suddivisa in regioni globulari o fibrose dette domini. Da un punto di vista strutturale un dominio è una regione ripiegata in modo molto compatto di un polipeptide. Queste regioni separate sono ben distinguibili o separate fisicamente da altre zone della proteina, ma sono collegate da una catena polipeptidica. 14

15 Moduli 1 Moduli 2 Alcuni domini di proteine, detti moduli, sono presenti in molte proteine diverse. La maggior parte delle proteine è composta di diversi domini proteici, in cui regioni diverse della catena polipeptidica si ripiegano indipendentemente, formando strutture compatte. Si ritiene che tali proteine a domini moltipli sia originate quando sequenze di DNA che codificano per tali domini, in modo incidentale si siano riunite, creando un nuovo gene. Dalla juxtaposizione dei domini spesso si sono create nuove superficie di legame, e molti siti funzionali dove le proteine si legano a piccola molecole. Molte proteine di grandi dimensioni mostrano di essere evolute mediante riunione di domini pre esistenti in nuove combinazioni, un processo evolutivo detto domain shuffling (rimescolamento dei domini). Un sottogruppo di proteine è risultato specialmente mobile durante l evoluzione: Questi moduli sono di solito più piccoli ( amino acids) di un dominio tipico e sembrano essere strutture particolamente versatili. Esempi di moduli diversi A protein formed from four domains. In the Src protein shown, two of the domains form a protein kinase enzyme, while the SH2 and SH3 domains perform regulatory functions [riconoscono tirosine fosforilate]. (A) A ribbon model, with ATP substrate in red. (B) A spacing filling model, with ATP substrate in red. Note that the site that binds ATP is positioned at the interface of the two domains that form the kinase. Domini Kringle Il dominio epidermal growth factor (EGF): modulo presente in diverse proteine Domini proteici a triplo loop collegati da ponti disolfuro. Questi comuni domini strutturali, così designati a causa della loro somiglianza con i biscotti Dannesi noti come kringlers, sono coinvolti nel legame alle membrane, proteine, e fosfolipidi, nonché alla regolazione della proteolisi. I kringles sono inoltre presenti in proteine coinvolte nella coagulazione e fibrinolisi e in altre proteinasi plasmatiche. Il fattore di crescita epidermico ( Epidermal Growth Factor; EGF ) é generato mediante scissione proteolitica della proteina precursore che contiene diversi domini EGF (arancione). Il dominio EGF é presente inoltre nella proteina Neu e nell attivatore tissutale del plasminogeno (TPA). Altri domini o moduli in queste proteine includono un dominio di chimotripsina (porpora), un dominio immunoglobulinico (verde), un dominio fibronectina (giallo), un dominio di attraversamento della membrana (rosa) e un dominio kringle (blu). [Adattato da I. D. Campbell and P. Bork, 1993, Curr. Opin. Struc. Biol. 3:385.] 15

16 Epidermal Growth Factor (EGF) Domini, segue 3 L EGF é una piccolo ormone peptidico solubile che si lega alle cellule della pelle e del tessuto connettivo, provocando la loro divisione. Viene generato mediante scissione proteolitica fra i domini ripetuti di EGF nella proteina precursora dell EGF, che é ancorata alla membrana plasmatica mediante un dominio di attraversamento della membrana. Sei residui conservati di cisteina formano tre coppie di legami disulfuro che mantengono l EGF nella sua conformazione nativa. Il dominio EGF si trova anche in altre proteine, incluso l attivatore tissutale del plasminogeno (TPA), una proteasi che viene usata per sciogliere i coaguli di sangue negli infarti di miocardio. La proteina Neu, che è coinvolta nel differenziamento embrionale e la proteina Notch, una molecola di adesione che incolla le cellule una all altra. Oltre al dominio EGF, queste proteine contengono domini aggiuntivi che si trovano anche in altre proteine. Ad esempio, il TPA possiede un dominio chimotripsina, una caratteristica comune alle proteine che catalizzano la proteolisi. I domini spesso sono definiti in termini funzionali basati su osservazioni che l attività della proteina é localizzata in una piccola regione lungo la sua estensione. Ad esempio, una particolare regione o regioni di una proteina possono essere responsabili dalla sua azione catalitica (ad es. un dominio chinasico) o capacità di legame (ad es. un dominio di legame al DNA, un dominio di legame alla membrana, un dominio che si lega a determinate sequenze glicidiche dominio lectinico). I domini funzionali spesso sono identificati sperimentalmente mediante frazionamento della proteina fino ad ottenere il suo frammento attivo più piccolo con l aiuto di proteasi, enzimi che scindono i legami peptidici. In alternativa, il DNA che codifica per la proteina può essere sottoposto a mutagenesi, in modo tale che isegmenti dell impalcatura proteica sono rimossi o alterati. L attività della proteina troncata o alterata sintetizzata dal gene mutato viene monitorata. Domini, segue 4 La definizione funzionale di un dominio è meno rigorosa della definizione strutturale. Tuttavia, se la struttura tridimensionale della proteina non è stata individuata, l identificazione di domini funzionali può fornitre informazioni utili sulla proteina. Dato che l attività della proteina di solito dipende da una struttura 3 D adeguata, un dominio funzionale consite al meno di un e spesso di vari domini strutturali. L organizzazione della struttura terziaria in domini illustra ulteriormente il principio che le molecole complesse sono costruite a partire di componenti più semplici. Come avviene con i motivi della struttura secondaria, i domini della struttura terziaria sono incorporati sotto forma di moduli in proteine diverse, così modificando le loro attività funzionali. L approccio modulare all archittetura proteica é particolarmente facile da riconoscere nelle proteine di grandi dimensioni, che tendono ad essere un mosaico di domini diversi e perciò possono svolgere diverse funzioni simultaneamente. 16