CELLULE STAMINALI APPLICAZIONI TERAPEUTICHE

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1 CELLULE STAMINALI APPLICAZIONI TERAPEUTICHE Maurilio Sampaolesi LESSON 3 Corso ANATOMIA UMANA Specialistica ( )

2 PROGRAMMA Introduzione alle cellule staminali: cellule staminali embrionali ed adulte Ciclo cellulare e cellule staminali. Cellule staminali e cellule tumorali. Le cellule staminali ematopoietiche. Cellule staminali nella terapia cellulare. Cellule staminali e migrazione. Vettori virali nella trasduzione delle cellule staminali. I mesoangioblasti, un esempio di cellule staminali associate ai vasi

3 Pluripotent - can make all cell types Multipotent - can make some cell types

4 Fertilized egg Identical twins At the 8 cell stage, each can make a whole person again

5 Makes stem cells Mutate Make a new you - without higher brain Anencephaly (1-5/1000 births)

6 In theory, embryonic stem cells can make all parts of the body.

7 In theory, embryonic stem cells can make all parts of the body. Problems: how do you program them down the right paths?

8 In theory, embryonic stem cells can make all parts of the body. Problems: how do you program them down the right paths? How do you stop them from dividing too much - from becoming cancer - teratocarcinoma

9 In theory, embryonic stem cells can make all parts of the body. Problems: how do you program them down the right paths? How do you stop them from dividing too much - from becoming cancer - teratocarcinoma Immune problem: your body will reject foreign stem cells - use your own? - Clone yourself

10 In theory, embryonic stem cells can make all parts of the body. Problems: how do you program them down the right paths? How do you stop them from dividing too much - from becoming cancer - teratocarcinoma Immune problem: your body will reject foreign stem cells - use your own? - Clone yourself Therapeutic cloning

11 Diversità nel ciclo cellulare tra cellule dell organismo adulto e cellule embrionali QuickTime and a decompressor are needed to see this picture. QuickTime and a decompressor are needed to see this picture. cellule embrionali cellule adulte

12 La durata del ciclo varia molto, soprattutto nella lunghezza della fase G1. In una cellula adulta può durare da 12 a 36 ore, la differenza dipende dalla fase G1. La fase G1 può durare ore, giorni, settimane o più a lungo a seconda del tipo cellulare. Quando la fase G1 si protrae a lungo, si parla di Go, cioè una fase stazionaria di attesa. L ingresso da Go a G1 ed il passaggio da G1 a S richiede l intervento di messaggi ambientali, chiamati mitogeni o fattori di crescita.

13 I meccanismi di controllo del ciclo cellulare: da Go a G1: fattori di crescita Transizione G1 - S: start point, preparazione delle molecole necessarie per la duplicazione del DNA Transizione G2 M: controllo quantitativo e qualitativo dell avvenuta duplicazione del DNA, preparazione del fuso mitotico. L uscita da M e l avvio della citochinesi

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15 Ingresso nel ciclo: l aggiunta di fattori di crescita attiva il passaggio tra la fase G0 e G1

16 Ingresso nel ciclo e transizione G1-S: il fattore di crescita attiva la via di trasduzione del segnale (Ras/MAPK) che porta alla trascrizione genica. Vengono prodotti fattori trascrizionali (risposta precoce), che a loro volta regolano in cascata la trascrizione di altre molecole (risposta tardiva) che permettono la transizione da G1 ad S.

17 PDGF-R Myc, Fos, Jun Proliferazione E2F ciclina

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19 Le cicline e le chinasi ciclina dipendenti (CdK) Le cicline sono prodotte nella risposta secondaria e la loro presenza attiva le chinasiciclina dipendenti

20 Le cicline sono state identificate sia in cellule di lievito che in cellule di mammifero. La loro concentrazione aumenta sino ad un livello massimo e poi segue una rapida degradazione. L attività delle CdK è regolata dalla concentrazione delle cicline. Esistono vari tipi di cicline e vari tipi di Cdk.

21 Le varie cicline nelle cellule di mammifero Ciclina A/Cdk2 Ciclina B/Cdk1 Ciclina E/Cdk2 Ciclina D/Cdk2 ciclinad/cdk4

22 Le Cdk attivate dalle cicline sono delle proteine serina-treonina chinasi. Fosforilano substrati coinvolti nelle varie fasi del ciclo, ad esempio nel passaggio tra G1 ed S, fosforilano gli istoni e permettono la compattazione dei cromosomi. Oppure fosforilano la lamina nucleare, disassemblandola e rompendo l involucro nucleare. Altre proteine fosforilate sono quelle del citoscheletro, che servono al macchinario della divisione.

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24 Il ciclo cellulare è controllato da segnali positivi, cioè attivazione di geni, produzione di cicline, ecc Ma esistono anche dei controlli negativi della progressione nel ciclo, che devono essere rimossi. Un esempio è la proteina del retinoblastoma (Rb), che in Go è associato al fattore trascrizionale E2F, inattivandolo. Nella transizione G1-S, le Cdk fosforilano Rb, che di conseguenza si stacca da E2F attivandolo e permettendogli di funzionare come fattore trascrizionale.

25 La proteina del retinoblastoma

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27 Le placche focali

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29 La crescita tumorale dipende da una de-regolazione dei meccanismi che controllano la crescita, il differenziamento e la morte cellulare. Controllo normale ed alterato della produzione di cellule a partire da cellule staminali. Iperattività di un gene capace di stimolare la proliferazione: mutazione con effetto dominante (basta che muti una copia del gene): il gene alterato è chiamato oncogene (l allele dominante è chiamato protooncogene). Inattivazione di un gene inibitore: mutazione con effetto recessivo (devono essere distrutte entrambe le copie del gene): il gene è chiamato gene soppressore della crescita tumorale.

30 I soppressori tumorali

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33 Saggio di identificazione di oncogeni in tumori umani di origine spontanea

34 La proliferazione delle cellule in vitro

35 Inibizione da contatto

36 La dipendenza da ancoraggio

37 Anomalie nella membrana: formazione di vescicole e di proteine di membrana citoplasmatica Anomalie nelle proprietà adesive: minore adesione, forma arrotondata, mancata formazione delle fibre di stress, aumentata proteolisi extracellulare Anomalie della crescita e della divisione: crescita ad alta densità, ridotto fabbisogno di fattori di crescita, minore dipendenza ad ancoraggio, immortale, inducono tumori in animali da esperimento

38 La sintesi del DNA: incorporazione di BdUR e analisi al citofluorimetro

39 Durante la fase S ogni cromosoma (molecola di DNA) viene duplicato e ogni copia completa (cromatide) resta unita all altra per la zona centrale del centromero sino alla fase M.

40 Ciascun cromatide contiene una delle due molecole di DNA generate nella fase S di replicazione del DNA

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42 Le fasi del ciclo cellulare: interfase e mitosi

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50 Cancer; a definition -A growth (enlargement) composed of a clonal population of cells that has acquired the ability to expand in defiance of the checks and balances that would normally control the proliferation and survival of normal cells (neo-plastic). -The genetic changes in a tumor cell were acquired sequentially. The appropriate combination of mutations resulted in a competitive advantage of a clone of cells over a number of competing clones. The clonally selected population will compose the majority of a tumor in one site. -While the number of genetic lesions vary, it is clear that the transformation of a cell involves multiple mutations (n>2, at least).

51 The clonal evolution of tumor cell populations Acquired genetic liability permits stepwise selection of variant sublines an underlies tumor progression Science 194, (1976)

52 Peter Nowell s original observation was based on the detection of the translocation between chromosome 9 and 22 in CML. The truncated version of chr. 22 was named the Philadelphia Chr. Peter C. Nowell

53 Genetic complexity of genomically-unstable tumor cells

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55 Terms for the road Oncogene: the hyperactive version of a gene whose normal form (proto-oncogene) is involved in the regulation of cellular proliferation and/or survival. This alteration is a dominant genetic event. Tumor supressor: a gene whose normal function involves the inhibition of cell growth and/or survival. The loss of both copies of this gene result in the uninhibited growth of the cell. This is a recessive genetic event. Identification of oncogenes by three independent lines of study: -transforming retroviruses (Bishop and Varmus) -Gene transfer experiments from tumor cells (Weinberg and others) -Molecular cloning of chromosomal breakpoints (Cory, Korsmeyer, Croce, etc)

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57 transforming retroviruses Development of in-vitro systems to study cellular transformation: the chick-embryo fibroblast model Transformed by v-src Wild-type

58 transforming retroviruses Transforming retroviruses were able to render Chicken Embryonic Fibroblasts (CEFs) resistant to density-dependent inhibition of proliferation

59 Transforming retroviruses transforming retroviruses -first documented instance: P. Rous and RSV in chickens (1923). -Following serial passage in vitro, identified a mutant virus that was able to propagate but no longer caused tumors. This sugested that the viral oncogene was genetic baggage that was dispensable for viral pathogenesis and replication. -The gene was eventually cloned and named src. -Low stringency Southern blotting showed that the viral oncogene had a closely related counterpart in the host s genome. The normal gene (termed c-src) was partially picked up by the virus during some recombination event, and altered by partial sequence incorporation into the viral genome. -Viral oncogenes have helped identify numerous cellular proto-oncogenes

60 Oncogenes originally identified through their presence in retroviruses transforming retroviruses Oncogene abl Proto-oncogene function Protein tyrosine kinase (PTK) Source of virus Mouse/cat Virus-induced tumor Pre-B-cell leukemia erb-b EGF-receptor (RTK) chicken Erythroleukemia, fibrosarcoma fes (PTK) Cat/chicken sarcoma fms GMCSF-R (PTK) cat sarcoma fos/jun AP-1 transcription factor Mouse/chicken Osteosarcoma, fibrosarcoma kit Stem cell factor (SCF) cat sarcoma raf PTK Chicken/mouse sarcoma myc Transcription regulator chicken Sarcoma, myelocytoma, carcinoma H-ras GTP-binding protein rat Erythroleukemia, sarcoma rel Regulator of NF-kB turkey reticuloendotheliosis sis PDGF-b monkey sarcoma src PTK chicken sarcoma akt PTK mouse T-cell leukemia

61 transforming retroviruses Alternative mechanism of retrovirally-induced transformation: Insertional mutagenesis of host genes. -the retroviral genome is reverse transcribed and integrated into the cellular genome. -The insertion of a retroviral LTR sequence upstream from a proto-oncogene may result in the ectopic expression, or overexpression of such a gene without any overt mutation to its nucleotide sequence. This may also happen over large stretches of genomic DNA (up to 10 KB away!). -The insertion of a retroviral genome may also disrupt an ORF, such as that of a tumor supressor gene, extinguishing its expression.

62 Gene transfer exp Identification of oncogenes by transfection of DNA derived from tumor cells into fibroblasts. -transfected DNA obtained from human tumors into a non-transformed context (murine 3T3 cells). -Isolated clones with transforming function. -Define the minimal essential fragment of DNA required to confer the phenotype. -Identified several dysregulated oncogenes that had been previously found encoded in transforming retroviruses. -Classically defined oncogenes by transfection approach were the various members of the Ras family (H, K and N-Ras).

63 Mechanisms of dysregulation of proto-oncogenes in cancer

64 Example of gene amplification: The c-myc locus in a case of B-NHL

65 Mol Clon of Chr breakpoints

66 Mol Clon of Chr breakpoints

67 What about tumor suppressor genes? Alfred G. Knudson Jr. - statistical study of retinoblastoma: retinoblastoma is a cancer caused by two mutational events. In the dominantly inherited form, one mutation is inherited via the germ cell and the second occurs somatically. In the nonhereditary form, both mutations occur somatically. Using Poisson statistics, one can calculate that this number (three) can explain the occassional gene carrier who gets no tumor, those who develop bilateral tumors, as well as explaining instances of multiple tumors in one eye Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68, (1971)

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71 What about tumorigenic viruses? -there are a number of viruses that have been shown to encode viral oncogenes. -For all of the viruses associated with human cancers, the number of people infected is much larger than those that develop cancer: the virally encoded oncogenes need to cooperate with an additional mutation in the host. -Some tumor-associated viruses act indirectly: HIV aliminates the T-cell element of the immune response, facilitating the process of tumorigenesis by eliminating the steps of immunoselection.

72 Summary -Cancer is an abnormal growth of a clonal population of cells that harbor several mutations in genes that normally regulate cellular growth, survival and differentiation. -Oncogenes are the dysregulated form of genes that normally act as positive regulators of cellular growth and dependence on extracellular cues. These are dominant mutations. -Tumor suppressor genes are recessive mutations of genes whose normal function is probably negative regulation of cellular growth, and whose absence in a transformed cell provides a competitive advantage. -Oncogenes can be dysreguated by point mutations, gene amplification chromosomal translocation and/or fusion to other ORFs, truncation, or overexpression due to point mutations in transcriptional regulatory regions of the locus. -Tumor suppressor genes require the loss of both alleles in order to exert their effect. Hereditary predisposition is associated with the germline loss of one allele, and somatic loss of the second allele.

73 Cancer Cell 2005 Sep;8(3):