INTRODUZIONE BIOLOGIA MOLECOLARE DEI TUMORI

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1 INTRODUZIONE BIOLOGIA MOLECOLARE DEI TUMORI Il tumore é una neoformazione di tessuto caratterizzata dalla presenza di cellule atipiche e da un accrescimento autonomo, afinalistico e progressivo; ciò sta a significare che il suo accrescimento è svincolato dalle regole che normalmente lo governano, che avviene senza vantaggi per l'ospite e che possiede una tendenza alla proliferazione continua. Prima di parlare specificamente della Neoplasia Endocrina Multipla (MEN), oggetto di questa tesi, è opportuno richiamare alcuni concetti relativi alle caratteristiche ed alla patogenesi delle neoplasie, riassumendo brevemente quanto riportato da Cotran et al (1999). Tutte le neoplasie sono composte da due tessuti fondamentali:! il parenchima, formato da cellule di origine epiteliale o mesenchimale che hanno subito la trasformazione neoplastica.! lo stroma, di natura non-neoplastica. Le neoplasie possono essere classificate in benigne e maligne nonché in base alla linea cellulare (epiteliale/mesenchimale) o al tessuto di origine. I tumori benigni tendono ad essere ben differenziati, hanno una crescita lenta (anche per mesi o anni) ed espansiva, sono incapsulati e non danno origine a metastasi; quelli maligni, al contrario, variano moltissimo nel loro grado di differenziazione (alcuni sono ben differenziati e sono strettamente somiglianti alle cellule ed al tessuto di origine mentre altri sono estremamente indifferenziati), mostrano una crescita invasiva, tanto da comprimere il normale tessuto che li circonda e causarne così la morte per necrosi o atrofia, non sono incapsulati e danno origine a metastasi molto frequentemente. La crescita dei neoplasmi maligni è varia: alcuni sono estremamente lenti ma altri, se non trattati, raggiungono rapidamente delle dimensioni considerevoli; inoltre tutto ciò avviene casualmente e senza nessun controllo. Il termine metastasi si riferisce alla diffusione di porzioni di tumori maligni in posizioni lontane rispetto all'origine dello stesso e può avvenire,

2 fondamentalmente, attraverso tre meccanismi principali: 1) esfoliazione diretta delle cellule tumorali da un tumore primario in una cavità corporea con successivo impianto; 2) invasione del sistema linfatico e trasporto delle cellule tumorali; 3) invasione diretta dei vasi sanguigni con disseminazione degli emboli neoplastici attraverso il sistema sanguigno. Per poter metastatizzare, il tumore deve avere la capacità di invadere e distruggere la matrice extracellulare nel sito di origine (le cellule tumorali che propendono a metastatizzare, infatti, producono anche diversi enzimi coinvolti nella degradazione del collagene delle membrane basali e della matrice extracellulare), penetrare nella membrana basale e quindi nel lume dei vasi migrando successivamente in organi distanti, dove si insediano e producono metastasi. Le origini della neoplasia sono numerose e diverse, ma il comune denominatore che le unisce è la presenza di alterazioni in quelle porzioni di DNA che controllano la divisione mitotica e la differenziazione. Tra le cause di queste mutazioni vi sono errori spontanei nella replicazione del DNA o eventi esogeni di varia natura (come ad esempio: radiazioni, sostanze cancerogene e virus oncogeni). Le basi molecolari dei tumori sono rappresentate da tre meccanismi principali: mutazioni puntiformi, riarrangiamenti cromosomici e amplificazione genica. Per quanto riguarda le mutazioni puntiformi, la proteina di trasduzione del segnale ras, rappresenta l esempio più eclatante; sono state identificate numerose variazioni genetiche e tutte portano ad una drastica riduzione della attività GTP-asica che risulta, infatti, scarsamente stimolata da GAPs (una proteina che accellera il passaggio della ras da attiva ad inattiva). Esistono, poi, due tipi di riarrangiamento cromosomico che possono attivare i protooncogeni: la traslocazione e l inversione; la prima può attivare questi geni in due modi: 1) posizionandoli in prossimità di sequenze promoter o enhancer che aumentano l espressione genica (ad esempio: elementi regolatori delle immunoglobuline o dei loci per il recettore delle cellule T, come nei tumori linfoidi). 2) portando alla formazione di geni ibridi che codificano per proteine chimeriche promuoventi la crescita. Il linfoma di Burkitt è l esempio di una traslocazione che induce overespressione di un proto-oncogene; in questo caso il gene myc viene trasposto dal cromosoma 8 al 14. Il cromosoma Philadelphia, invece, costituisce l esempio della fusione di due geni normali portando alla formazione di chimere; in questo caso avviene una traslocazione reciproca tra il cromosoma 9 e 22, riposizionando una porzione troncata del proto-oncogene c-abl vicino

3 a bcr sul cromosoma 22. Il gene ibrido c-abl/bcr codifica per una proteina chimerica che ha attività tirosin-chinasica. I tumori sono, quindi, proliferazioni monoclonali che spesso originano da una singola mutazione genetica che rende le cellule trasformate e così non più suscettibili ai meccanismi di controllo genico che regolano la normale crescita e differenziazione cellulare. In appropriate circostanze, la singola cellula trasformata sopravvive, sfugge al controllo atto ad eliminarla e si divide in situ dando origine a cellule figlie con proprietà simili. Questo processo viene definito iniziazione; durante il corso dell espansione clonale, possono verificarsi altre mutazioni genetiche che conferiscono maggiore o minore capacità di sopravvivenza alla progenie di queste cellule (progressione). Gli agenti iniziatori possono essere cancerogeni direttamente o dopo metabolizzazione, solitamente reagiscono con siti ricchi di elettroni (come il DNA, le proteine, l RNA), spesso inducono mutazioni ben definite e, affinchè la popolazione cellulare rimanga iniziata, è necessario che la cellula si divida entro le ore dalla mutazione, altrimenti intervengono processi riparativi del DNA. Gli agenti promotori, invece, da soli non sono in grado di indurre neoplasia, hanno un azione reversibile e non sono mutageni ma inducono la proliferazione delle cellule iniziate. Poichè i geni colpiti da mutazione sono, assieme ai loro prodotti, responsabili del ciclo cellulare, è necessario comprendere il meccanismo che sta alla base di questo processo e l interazione che esiste tra i suoi componenti. L input al ciclo cellulare è dato dai fattori di crescita che interagiscono con i rispettivi recettori e portano alla attivazione di diversi substrati. I recettori per i fattori di crescita sono proteine con un sito di legame esterno e un dominio tirosin-chinasico che si trova nel citoplasma. In condizioni normali, l attività chinasica, attivata dal legame dei rispettivi fattori di crescita, è transitoria ed è seguita da una rapida dimerizzazione dei recettori e dalla fosforilazione di diversi substrati che fanno parte della cascata mitotica. Un ruolo fondamentale in questo processo è svolto dalle proteine di trasduzione del segnale come le GTP-Binding Proteins, codificate dai geni della superfamiglia ras. Nello stato inattivo ras lega il GDP e, quando le cellule sono stimolate dall arrivo di un fattore di crescita o da un altro tipo di interazione, si attiva grazie allo scambio di GDP con GTP e può, così, dare il via al pathway delle MAP-chinasi intracitoplasmatiche. Le MAP-chinasi attivate hanno come bersaglio i fattori di trascrizione nucleare che possono promuovere la proliferazione. In condizioni normali questo fenomeno è transitorio, anche perché l attività GTP-asica, intrinseca alla normale proteina

4 ras, è fortemente accelerata dalle GTP-ase activating proteins (GAPs). Tutti i segnali del pathway di trasduzione, infine, interagiscono a livello nucleare con numerosi geni che coordinano la progressione del ciclo mitotico controllando la trascrizione dei geni della crescita. I fattori di trascrizione legano il DNA in specifici siti e possono attivare o inibire la trascrizione dei geni adiacenti. La progressione ordinata delle varie fasi del ciclo cellulare è realizzata dalle cicline, dalle chinasi-cicline dipendenti (CDKs) e dai loro inibitori; mutazioni nei geni che codificano per questi regolatori del ciclo cellulare sono stati riscontrati in molti tumori umani. Le CDKs sono espresse costitutivamente durante il ciclo cellulare ma in forma inattiva; sono attivate tramite fosforilazione dopo legame con le cicline che sono, invece, sintetizzate solo in specifiche fasi. La sintesi delle cicline D, che legano CDK4 e CDK6, è stimolata all inizio della fase G 1 ; successivamente viene indotta la sintesi della ciclina E che si lega al CDK2. I complessi cilina D/CDK4, cilina D/CDK6 e ciclina E/CDK2 fosforilano la proteina Rb; quest ultimo è un anti-oncogene che, nelle cellule quiescenti, è presente in forma attiva ipofosforilata e blocca la progressione del ciclo cellulare da G 1 a S sequestrando E2F. In seguito a fosforilazione la proteina Rb rilascia E2F che può, in ultima analisi, attivare la trascrizione di diversi geni target; dopo la mitosi una fosfatasi defosforila la proteina e la cellula torna in fase Go. L ulteriore progressione alla fase G 2 è facilitata dalla up-regolazione della ciclina A che si lega alla CDK1 e alla CDK2; successivamente subentra la ciclina B che forma un complesso con CDK1 e che permette alle cellule di passare dallo stato G 2 alla fase M fosforilando una serie di proteine richieste per la mitosi. L attività delle CDKs è regolata da due famiglie di inibitori: la prima è composta da tre proteine, p21, p27 e p57, che hanno effetto su tutte le CDKs; la seconda famiglia ha un effetto selettivo sui complessi ciclina D/CDK4 e ciclina D/CDK6 ed è composta da 4 membri, p14, p16, p18 e p19, chiamati anche INK4. I geni coinvolti nella formazione dei tumori sono stati suddivisi in 4 gruppi: 1) protooncogeni; 2) anti-oncogeni o cancer suppressor genes; 3) geni coinvolti nella regolazione dell apoptosi; 4) geni coinvolti nella riparazione del DNA. Gli oncogeni, o geni che causano il cancro, derivano dai proto-oncogeni e sono coinvolti nel ciclo cellulare e nella differenziazione; le proteine da loro prodotte sono simili a quelle sintetizzate a partire dai proto-oncogeni ma la loro produzione è indipendente da stimoli esterni e molte di esse non hanno una funzione regolatoria. Il tumore compare quando queste proteine diventano anomale, cioè costitutivamente attivate, per mutazioni geniche o

5 se sono presenti in gran quantità processo alla cui base vi sono traslocazioni o gene amplification. Le oncoproteine rappresentano, dunque, la versione alterata della loro controparte normale e possono essere raggruppate sulla base della funzione che svolgono nella cascata della trasduzione del segnale e nella regolazione cellulare. Ritroviamo 5 principali categorie di proteine codificate da oncogeni: fattori di crescita; recettori per fattori di crescita; proteine di trasduzione del segnale; proteine di trascrizione nucleare; cicline e chinasi ciclinedipendenti (CDKs). Per quanto riguarda i fattori di crescita, è stata riscontrata una mutazione nel gene c-sis che codifica per la catena β del PDGF e i tumori che lo esprimono (astrocitomi e osteosarcomi) producono PDGF ma anche molti recettori per lo stesso, portando ad una stimolazione autocrina. Un meccanismo PDGF dipendente è stato riscontrato anche nel fibrosarcoma vaccino-indotto del gatto. I recettori per i fattori di crescita, se mutati, presentano una dimerizzazione ed un attivazione persistente senza che vi sia nessun legame con il fattore di crescita extracellulare; tutto questo può accadere grazie a mutazioni frequenti, riarrangiamenti genici e over-espressione, come nel caso del recettore per l EGF che aumenta dell 80%. Altro esempio è RET, recettore per i fattori di crescita neuroendocrini in cui si assiste ad una mutazione nella parte extracellulare o intracellulare o, addirittura, ad un riarrangiamento con altri gene partner, con comparsa della sindrome Neoplasia Endocrina Multipla di tipo 2 (MEN 2). Le proteine di trasduzione del segnale ras mutate, invece, legano si GAPs, ma la loro attività GTP-asica non viene incrementata e quindi persiste uno stato di attivazione che risulta in una stimolazione patologica del pathway per la proliferazione. Oltre a ras, molte tirosin-chinasi non recettore associate, possono funzionare nella via di trasduzione del segnale fosforilando proteine intracellulari in risposta a stimoli esterni. Si riscontrano in oncovirus animali mentre nell uomo è nota solo una mutazione del gene c-abl che si sposta dal cromosoma 9 al 22 dove forma una chimera con il gene bcr provocando una leucemia linfoide. Non sorprende poi che, le mutazioni dei geni che codificano per i fattori di trascrizione portano, inevitabilmente, a trasformazioni di carattere maligno. In molti tumori vi è, infatti, la overespressione di proto-oncogeni (come myc, myb, jun e fos) che causano un persistente stimolo replicativo. Tra questi il proto-oncogene myc è il gene più comunemente coinvolto

6 in neoplasie umane ed è espresso virtualmente in tutte le cellule eucariote; appartiene a quel gruppo di geni che sono rapidamente indotti quando le cellule quiescenti ricevono il segnale di dividersi. Sia prima che dopo il trasporto nel nucleo, forma un eterodimero con un altra proteina chiamata max; l eterodimero myc-max si lega a sequenze specifiche di DNA (E-boxes) ed è un potente attivatore trascrizionale mentre, quando myc si unisce a mad, origina un eterodimero con funzione di repressore trascrizionale. Mad può, quindi, essere considerato un anti-oncogene o un tumor-suppressor gene. E facile comprendere, anche, come le mutazioni che agiscono sulle cicline e sulle CDKs possono alterare la proliferazione cellulare ed essere, così, origine di tumori; infatti, in molte neoplasie, si riscontra una overespressione di cilina D e/o CDK4 e CDK6 che attiva costantemente il ciclo. Il secondo gruppo di geni colpiti da mutazione è rappresentato dai tumor-suppressor genes, o anti-oncogeni, che portano ad un interruzione della proliferazione e la cui funzione è di regolare la crescita cellulare. Quindi, si ha tumore se questi geni mancano o se non funzionano. Esistono tre classi di tumor-suppressor genes: 1) molecole che regolano la trascrizione nucleare e il ciclo cellulare 2) molecole che regolano la trasduzione del segnale 3) recettori di superficie. Nella prima categoria troviamo il gene Rb le cui mutazioni sono localizzate in una regione chiamata Rb pocket coinvolta nel legame a E2F. La perdita omozigote di Rb induce apoptosi, ma non nella retina; in altri tumori, invece, non vi sono mutazioni di Rb ma in altri geni coinvolti nel processo. L altro tumor-suppressor gene è la p53 ed è il target più comune delle alterazioni genetiche nei tumori, infatti è presente in quasi il 50% di questi; la sua perdita omozigote si riscontra in tutti i tipi di neoplasia. La trasmissione ereditaria di un allele mutato predispone allo sviluppo di tumori maligni e, i più comuni nell uomo, sono sarcomi, leucemia, tumori al cervello e carcinomi mentre, in Medicina Veterinaria, la p53 è risultata mutata in una grande varietà di tumori. La p53 agisce come una sentinella che previene la diffusione di cellule danneggiate geneticamente; è localizzata nel nucleo e, quando indotta (ad esempio in seguito a danni causati da radiazioni, UV o sostanze mutagene), la sua prima funzione è di controllare la trascrizione di molti altri geni. In caso di necessità la sua sintesi viene incrementata, la p53 si lega al DNA e stimola la trascrizione di geni che mediano i due suoi più importanti effetti: l arresto del ciclo cellulare e l apoptosi. Il ciclo è bloccato

7 perchè la p53 stimola la sintesi dell inibitore p21 che inibisce i complessi cicline/cdk e, quindi, la fosforilazione di Rb; la ragione della pausa sta nel dare alle cellule il tempo necessario per riparare al danno subito. La p53 aiuta, inoltre, questo processo inducendo la trascrizione di GADD45, una proteina coinvolta nella riparazione del DNA. Se il danno viene ripristinato con successo la p53 attiva un gene chiamato mdm2 il cui prodotto si lega e down-regola la stessa p53. Al contrario la p53 attiva i geni che inducono apoptosi come bax, che lega e antagonizza l azione dell inibitore dell apoptosi bcl-2. E chiaro che la perdita omozigote di p53, in una situazione di mancata riparazione del DNA, porta alla fissazione della mutazione che si diffonde alle cellulle figlie e genera una trasformazione maligna. Nella categoria delle molecole che regolano la trasduzione del segnale troviamo i prodotti dei geni APC e NF-1. Una funzione importante della proteina APC è di degradare le β- catenine che sono coinvolte nella trasduzione del segnale, inviando segnali replicativi nel nucleo, e nella adesione cellulare mediante il legame con le E-caderine. L inattivazione del gene per la APC porta alla perdita della proteina e, conseguentemente, ad un aumento dei livelli di β-catenine che traslocano nel nucleo e up-regolano la proliferazione cellulare. Per quanto riguarda NF-1, gli individui che ereditano un allele mutato sviluppano numerosi neurofibromi benigni, mentre l inattivazione del secondo allele porta ad una neurofibromatosi di tipo I che può evolvere in neurofibrosarcomi. La proteina prodotta (neurofibromina) è una GTP-asi che dovrebbe inattivare il gene ras; se però presenta una mutazione la conseguenza è una iperattivazione di ras. Tra i recettori di superficie vi sono diverse molecole che regolano il ciclo cellulare come i recettori per gli inibitori della proliferazione (TGF-β) e proteine che regolano l adesione cellulare (caderine), proteine di adesione la cui mancanza può favorire un fenotipo maligno permettendo un facile distacco delle cellule che, partendo dalla popolazione originaria, possono invadere localmente o metastatizzare. Il terzo grande gruppo è costituito dai geni che regolano l apoptosi e tra questi il primo identificato è stato bcl-2, appartenente ad una famiglia di proteine, alcune delle quali inibiscono l apoptosi (lo stesso bcl-2 e bcl-xl) mentre altre la promuovono (bax, bad e bclxs). Ad esempio, una overespressione di bcl-2, come quella che si verifica nei linfomi delle cellule B a seguito di una traslocazione del gene per bcl-2 vicino a regioni trascrizionalmente attive, protegge le cellule dalla apoptosi, prolunga la vita cellulare e facilita altre mutazioni di proto- ed anti-oncogeni. La famiglia di bcl-2 regola l attivazione

8 di enzimi proteolitici responsabili della morte cellulare, le caspasi. Il rapporto tra fattori pro-apoptotici (bax, bad e bcl-xs) e anti- apoptotici (bcl-2 e bcl-xl) determina come la cellula risponderà ad uno stimolo apoptotico; il tutto è operato dalla dimerizzazione competitiva tra i vari membri. Quindi, omodimeri di bcl-2 favoriscono la sopravvivenza mentre omodimeri di bax l apoptosi. Il ruolo dei geni che regolano la riparazione del DNA nella predisposizione dei tumori è illustrato molto bene dal caso della sindrome HNPCC (hereditary nonpolyposis colon cancer). In questa patologia si verificano numerose mutazioni che non vengono corrette dall attività di correzione di bozze della DNA polimerasi (attività proofreading); quindi, gli errori si accumulano in molti geni e tra questi possono essere danneggiati anche i protooncogeni e i tumor-suppressor-genes. Le conseguenze più comuni sono l alterazione dei recettori per TGF-β e per bcl-2. Tutti i tumori umani analizzati mostrano alterazioni genetiche multiple che coinvolgono l attivazione di numerosi oncogeni e la perdita di due o più cancer-suppressor genes. Ciascuna di queste alterazioni rappresenta uno step cruciale nella progressione da cellula normale a maligna. Un esempio dell acquisizione crescente del fenotipo maligno è documentata dallo studio sul carcinoma del colon; queste lesioni evolvono attraverso una serie di passaggi morfologicamente evidenziabili: iperplasia epiteliale del colon seguita dalla formazione di adenomi che progressivamente aumentano e, in ultimo, assumono carattere maligno. In questa sequenza di eventi è di fondamentale importanza il momento in cui compaiono le mutazioni a carico dei geni prima descritti; sono, infatti, loro a determinare la propensione allo sviluppo del tumore. E necessario sottolineare, così, che molti oncogeni non riescono da soli ad indurre neoplasia ed ogni tumore ha molteplici attivazioni geniche che spesso compaiono anche in momenti successivi.