L omeostasi cellulare è frutto di un sottile equilibrio, finemente regolato, tra moltiplicazione e morte cellulare

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1 L omeostasi cellulare è frutto di un sottile equilibrio, finemente regolato, tra moltiplicazione e morte cellulare Mitogeni Segnali inibitori esterni segnali proapoptotici Danno cellulare Danni al DNA Fattori di sopravvivenza Progressione del ciclo cellulare Attivazione delle caspasi MOLTIPLICAZIONE CELLULARE MORTE CELLULARE GRANDEZZA COMPLESSIVA DELLA POPOLAZIONE CELLULARE

2 ALCUNE PROPRIETA DELLE CELLULE TUMORALI - Non rispettano i segnali interni ed esterni che regolano la proliferazione cellulare - Aggirano le limitazioni programmate alla proliferazione sfuggendo alla senescenza replicativa ed evitando il differenziamento - Sono meno propense, rispetto alle cellule normali, ad andare in apoptosi - Inducono la collaborazione di cellule normali presenti nel loro microambiente - Sfuggono al tessuto dove risiedono (sono invasive) - Sopravvivono e proliferano in siti estranei (metastatizzano)

3 La crescita tumorale è il risultato di mutazioni somatiche Cellule normali Una cellula isolata va incontro a mutazione Le cellule mutanti crescono in un grande clone di cellule

4 Prove a sostegno dell origine monoclonale del cancro Le cellule di un tumore hanno in comune un alterazione genetica (o epigenetica) che le distingue dalle cellule normali che le circondano La prova derivata da mosaici di inattivazione del cromosoma X

5 Prove a sostegno del ruolo delle mutazioni somatiche nell insorgenza del cancro Molti agenti noti come mutageni sono anche cancerogeni Difetti genetici nei meccanismi di riparazione del DNA provocano una forte suscettibilità al cancro

6 MUTAZIONI COINVOLTE NELL ONCOGENESI Mutazioni che fanno aumentare la capacità proliferativa Incremento di funzione di proteine che promuovono la progressione del ciclo cellulare Perdita di funzione di proteine che inibiscono la progressione del ciclo cellulare Mutazioni che fanno diminuire la sensibilità all apoptosi Incremento di funzione di proteine che inibiscono l apoptosi Perdita di funzione di proteine che promuovono l apoptosi Mutazioni che incrementano l instabilità genomica Perdita di funzione di proteine coinvolte nella riparazione del DNA

7 DUE CLASSI DI GENI CRITICI PER IL CANCRO Proto-oncogèni: geni che codificano per proteine che favoriscono la proliferazione cellulare: - promuovendo la progressione del ciclo cellulare - inibendo la morte cellulare Oncosoppressori: geni che codificano per proteine che contrastano la proliferazione cellulare: - inibendo la progressione del ciclo cellulare - promuovendo la morte cellulare

8 DUE CLASSI DI GENI CRITICI PER IL CANCRO Proto-oncogèni: geni il cui incremento di funzione conduce verso il cancro. Le forme mutanti iperattive sono chiamate oncogèni Oncosoppressori: geni la cui perdita di funzione conduce verso il cancro

9 ONCOGENI ONCOSOPPRESSORI Effetto sulla proliferazione Tipo di mutazione analogia stimolazione Acquisto di funzione Acceleratore bloccato inibizione Perdita di funzione Freno non funzionante

10 Gli alleli mutanti dei proto-oncogeni (gli oncogeni) sono in genere dominanti (l iperattività è un guadagno di funzione: è sufficiente una sola copia per indurre un eccesso di proliferazione cellulare) Una mutazione trasforma un allele del proto-oncogene in oncogene Cellula normale Cellula che prolifera in modo anomalo Gli alleli mutanti degli oncosoppressori sono in genere recessivi (l ipoattività è una perdita di funzione: entrambi devono essere mutati per indurre un eccesso di proliferazione) Una mutazione inattiva una copia di un oncosoppressore Una seconda mutazione inattiva la seconda copia Cellula normale Nessun effetto Cellula che prolifera in modo anomalo

11 ONCOSOPPRESSORI Geni che codificano per proteine che inibiscono la proliferazione o favoriscono l apoptosi Le mutazioni che provocano il cancro sono mutazioni che portano alla perdita di funzione Per portare alla crescita tumorale devono in genere essere inattivati allo stato omozigote Sono coinvolti nell ereditarietà della predisposizione ad alcuni tumori

12 Geni Oncosoppressori The Two-Hit Hypothesis (L ipotesi dei due colpi) Knudson, 1971 PRIMO COLPO Mutazione in un allele SECONDO COLPO Mutazione nell altro allele CANCRO

13 L ipotesi dei due colpi nei Tumori Ereditari (retinoblastoma) Negli individui che sviluppano questi tipi di tumori, il 1 colpo viene ereditato come mutazione germinale e il 2 colpo si verifica in una cellula somatica 1 colpo 2 colpo

14 Il gene per la suscettibilità al retinoblastoma (Rb) è il prototipo degli oncosoppressori

15 La proteina Rb agisce da freno nella fase G1 Segnale di un fattore di crescita Proteina Rb fosforilata Ciclina-cdk Nelle cellule in G1 non sono trascritti i geni necessari per l entrata in fase S trascrizione Bersagli trascrizionali di E2F -Ciclina E -Ciclina A -Enzimi per la biosintesi dei nucleotidi -Subunità della DNA polimerasi proteine necessarie per la fase S G 1 S

16 In assenza della funzione di Rb l attività di E2F è indipendente dalla presenza di mitogeni G 1 S

17 Repressione coinvolge la metilazione della lisina9 dell istone H3 che regola la struttura della cromatina

18 I meccanismi genetici alla base del retinoblastoma INDIVIDUO NORMALE SANO RETINOBLASTOMA EREDITARIO RETINOBLASTOMA SPORADICO Gene Rb mutante ereditato Una cellula inattiva uno dei suoi geni Rb funzionanti Una cellula inattiva uno dei suoi geni Rb funzionanti In una cellula si inattiva la sua sola copia funzionante di Rb RETINOBLASTOMA La seconda copia di Rb è inattivata molto raramente nella stessa linea di cellule RETINOBLASTOMA NESSUN TUMORE LA MAGGIOR PARTE (90%) DELLE PERSONE CON LA MUTAZIONE EREDITATA SVILUPPA IL TUMORE SOLTANTO UNA PERSONA NORMALE SU SVILUPPA IL TUMORE

19 Cellula non tumorale con una sola copia normale di Rb Mutazione di Rb nel cromosoma materno Rb normale nel cromosoma paterno POSSIBILI MODI IN CUI L ALLELE NORMALE DI Rb PUO ESSERE ELIMINATO Non-disgiunzione causa la perdita del cromosoma normale Duplicazione del cromosoma con la mutazione Ricombinazione mitotica Conversione genica Delezione Mutazione puntiforme

20 La forma ereditaria del retinoblastoma è trasmessa come un carattere autosomico dominante +/- +/- +/- +/- +/- L individuo che sviluppa il retinoblastoma è eterozigote Le cellule del tumore sono omozigoti

21 Gli individui affetti da forma ereditaria di retinoblastomi sono a rischio di sviluppare anche altri tipi di tumore, come sarcomi dei tessuti molli. La mutazione di RB si riscontra spesso in diversi tumori (mammella, prostata, polmone) in individui che hanno ereditato alleli RB normali

22 Il gene oncosoppressore p53: il guardiano del genoma La proteina p53 si accumula in risposta al danno del DNA o a segnali iperproliferativi e provoca l arresto del ciclo cellulare o l apoptosi Danno al DNA Iperproliferazione p53 Arresto in G1 Apoptosi

23 DNA DANNEGGIATO Aumenta il livello intranucleare di p53 trascrizione trascrizione Trascrizione Bax APOPTOSI Eliminazione di cellule danneggiate irreparabilmente p21 ARRESTO DEL CICLO CELLULARE Riparazione del DNA

24 p53 è fortemente indotto in una cellula sana da un danno genetico, come l esposizione a luce ultravioletta p53 induce l espressione di BAX, iniziatore dell apoptosi. p53 lega BAX sulla membrana mitocondriale esterna, inducendo la permeabilizzazione della membrana e il rilascio di fattori apoptotici p53 lega direttamente diversi membri della famiglia BCL2 inibendoli e favorendo l apoptosi

25 p53 e tumori umani mutazioni somatiche di p53 sono state identificate in più del 50% dei tumori umani è nota, però, soltanto una condizione ereditaria causata da mutazioni germinali di p53, la sindrome di Li-Fraumeni, una rara forma di predisposizione allo sviluppo di tumori multipli

26 In molti casi le mutazioni di p53 si comportano come dominanti negative Normalmente p53 è attiva come tetramero Anche con 1/4 di p53 mutante l intero tetramero è inattivo

27 BRCA 1 e BRCA 2 sono responsabili della maggior parte dei casi ereditari di tumore della mammella Danno al DNA BRCA-1 e -2 fanno parte di grandi complessi proteici che rispondono al danno al DNA e ne attivano il riparo Tramite ricombinazione omologa BRCA1 BRCA2 BRCA1 BRCA2 Riparazione ione di p53 MDM2 lega p53 e ne favorisce l esporto nel citoplasma e la successiva ubiquitinilazione. La fosforilazione di p53 da parte di ATM blocca l interazione con MDM2 Apoptosi Arresto del ciclo cellulare

28 Esempi di oncosoppressori BRCA2

29 Una singola mutazione non è sufficiente a provocare il cancro N. di divisioni cellulari in un corpo umano nell arco della vita: N. di mutazioni spontanee per gene per divisione cellulare: 1/10 6 Ogni gene subisce mutazioni in circa occasioni Incidenza del cancro in funzione dell età

30 Evoluzione clonale un tumore si sviluppa tramite cicli ripetuti di mutazione e proliferazione

31 Ipotesi della sequenza di alterazioni genetiche nello sviluppo del carcinoma colorettale

32 Ciascun tumore contiene generalmente una serie diversa di alterazioni genetiche

33 Oltre alle mutazioni, anche le alterazioni epigenetiche sono comuni nel cancro INATTIVAZIONE GENETICA INATTIVAZIONE EPIGENETICA INATTIVAZIONE EPIGENETICA Cambiamento nella sequenza del DNA Formazione di eterocromatina Metilazione del DNA

34 Cellula che si amplifica in transito Cellula staminale normale autorinnovamento Mutazioni o cambiamenti epigenetici provocano l acquisizione di proprietà di cellule staminali Mutazioni e cambiamenti epigenetici Molti tumori sono sostenuti da una piccola popolazione di cellule staminali cancerose Cellula staminale del cancro maligna Crescita continua Cellula staminale del cancro autorinnovamento TUMORE Cellula cancerosa che si amplifica in transito

35 VIRUS ONCOGENI

36 I virus oncogeni ad RNA appartengono alla famiglia dei retrovirus

37 Un retrovirus Il comportamento dell acido nucleico di un retrovirus in una cellula infettata

38 Il ciclo vitale di un retrovirus

39 I retrovirus oncogeni attivano protooncogeni cellulari

40 Meccanismi di attivazione di proto-oncogeni da parte di virus oncogeni a RNA Trasduzione di un proto-oncogene cellulare Attivazione di un proto-oncogene cellulare mediante mutagenesi inserzionale Trans-attivazione di proto-oncogeni cellulari mediante proteine virali che regolano la trascrizione Complessi meccanismi indiretti

41 ORGANIZZAZIONE GENETICA DEI RETROVIRUS Retrovirus semplici Sequenze fiancheggianti (Long Terminal Repeats) LTR gag pol env LTR Proteine strutturali del virione Trascrittasi inversa Glicoproteine dell involucro Retrovirus che trasducono un proto-oncogene cellulare (c-onc) LTR gag pol env v-onc LTR

42 Esempi di retrovirus che trasducono proto-oncogeni cellulari Virus Specie Oncogene virale Protooncogene cellulare Sarcoma di Rous (RSV) Pollo v-src c-src Sarcoma di Harvey (Ha-MuSV) Ratto v-ras c-ras Mielocitomatosi aviaria (MC29) Pollo v-myc c-myc Leucemia di Abelson (MuLV) Topo v-abl c-abl Eritroblastosi aviaria (AEV) Pollo v-erbb EGFR Sarcoma della scimmia (SSV) Scimmia v-sis PDGF Sarcoma felino (FeSV) Gatto v-fms c-fms

43 Possibile meccanismo di mutagenesi durante la cattura di un proto-oncogene da parte di un retrovirus Nella proteina oncogenica virale Raf, il dominio regolativo è stato deleto e sostituito dalle sequenze Gag virali, col risultato che il dominio chinasico è costitutivamente attivo

44 Possibile meccanismo di mutagenesi inserzionale Influenza dell enhancer virale Sintesi del trascritto potenziata

45 RETROVIRUS ASSOCIATI A TUMORI NELL UOMO Virus Virus di tipo I della leucemia umana a cellule T (HTLV-I) Virus dell immunodeficienza umana (HIV) Tumori associati Leucemia dell adulto a cellule T Sarcoma di Kaposi (cancro delle cellule endoteliali) (HTLV-1) TRANSATTIVATORI LTR gag pol env X-I X-V X-II X-III X-IV LTR

46 I virus oncogeni a DNA inducono la trasformazione cellulare quando si integrano nel genoma dell ospite Nella trasformazione sono generalmente espresse solo le proteine precoci

47 Meccanismi di trasformazione utilizzati dai virus oncogeni a DNA Inattivazione di proteine codificate da oncosoppressori da parte di proteine virali Attivazione di proteine codificate da proto-oncogeni cellulari da parte di proteine virali Attivazione di proto-oncogeni cellulari mediante mutagenesi inserzionale Trans-attivazione di proto-oncogeni cellulari mediante proteine virali che regolano la trascrizione Complessi meccanismi indiretti

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49 Le proteine E6 e E7 del virus del papilloma inattivano Rb e p53

50 La proteina E5 del virus del papilloma attiva il recettore del PDGF

51 VIRUS ONCOGENI A DNA ASSOCIATI A TUMORI NELL UOMO Virus Tumori associati Famiglia dei Papovavirus Papillomavirus (HPV) Verruche benigne Carcinoma della cervice uterina Famiglia degli Herpesvirus Virus di Epstein-Barr (EBV) Linfoma di Burkitt Famiglia degli Hepadnavirus Virus dell epatite B (HBV) Carcinoma epatocellulare

52 CLASSI PRINCIPALI DI PROTO-ONCOGENI Fattori di crescita Recettori di fattori di crescita Proteine di trasduzione del segnale Proteine che controllano il ciclo cellulare Proteine che inibiscono l apoptosi Fattori trascrizionali

53 Gli oncogeni si identificano tramite la loro capacità di indurre la trasformazione cellulare

54 Gli oncogeni sono dei proto-oncogèni modificati da mutazioni spontanee o provocate da agenti esogeni (chimici, fisici e virali). L attivazione di un proto-oncogene può essere quantitativa e/o qualitativa

55 MUTAZIONI CHE PROVOCANO L IPERATTIVITA DEI PROTO-ONCOGENI - Mutazioni puntiformi - Piccole delezioni - Amplificazione genica - Riarrangiamenti cromosomici - Attivazione da parte di retrovirus

56 Meccanismi di conversione dei proto-oncogeni in oncogeni Proto-oncogene

57 ATTIVAZIONE ONCOGENICA DI RAS (mutazione puntiforme) Ras inattiva Attività GTPasica intrinseca Ras attiva L attivazione di un recettore stimola lo scambio GTP/GDP Ras resta bloccata nello stato attivo Attiva la cascata delle MAP chinasi Il segnale a valle diventa continuo

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59 ATTIVAZIONE ONCOGENICA DEL RECETTORE DELL EGF MEDIANTE DELEZIONE EGFR ErbB Il recettore codificato dall oncogene segnala indipendentemente dal ligando

60 ATTIVAZIONE ONCOGENICA DEL GENE myc (AMPLIFICAZIONE DEL NUMERO DI COPIE) Ibridazione in situ Regione che si colora omogeneamente cromosoma A Replicazione aberrante cromosomi doppi minuti cromosoma B

61 ATTIVAZIONE ONCOGENICA DEL GENE myc (traslocazione cromosomica) nei linfociti che danno origine al linfoma di Burkitt

62 ATTIVAZIONE ONCOGENICA DEL GENE ANTIAPOPTOTICO BCL-2 (traslocazione cromosomica) in un linfoma delle cellule B Bcl-2 IgH /18 IgH Bcl-2 Enhancer dell IgH Punto di rottura Cromosoma 14 Cromosoma 18 Traslocazione 14/ 18 Riunione delle rotture Gene Bcl2 inattivo Punto di rottura Gene Bcl2 iperattivo nei linfociti B B cell lymphoma

63 La traslocazione tra i cromosomi 9 e 22 responsabile della leucemia mieloide cronica Gene Bcr sul cromosoma 22 Gene Abl sul cromosoma 9 Cromosoma Philadelphia La proteina di fusione Bcr-Abl è una chinasi iperattiva

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67 Sviluppo di farmaci antitumorali che agiscono attraverso targeting molecolare - Gleevec - Herceptin

68 Una molecola di piccole dimensioni, il farmaco chiamato Gleevec, è stata appositamente sintetizzata per bloccare l attività della chinasi oncogena Bcr-Abl

69 Un anticorpo monoclonale chiamato Herceptin, specifico per il recettore HER2 è stato appositamente prodotto per bloccare la crescita di tumori HER2-positivi nucleus

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