Angiogenesi tumorale!

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1 Angiogenesi tumorale!! Le cellule di mammifero devono essere localizzate ad un massimo di 200µM di distanza dalla microvascolatura!! Questa distanza corrisponde al limite massimo di diffusione dell ossigeno!! Per una crescita ulteriore, c é bisogno di formare nuovi vasi sanguigni!! Simili restrizioni sono in atto anche nella massa tumorale!

2 Tumor Angiogenesis and Neovasculature! A, Tumors less than 1 mm 3 receive oxygen and nutrients by diffusion from host vasculature. B, Larger tumors require new vessel network. Tumor secretes angiogenic factors that stimulate migration, proliferation, and neovessel formation by endothelial cells in adjacent established vessels. C, Newly vascularized tumor no longer relies solely on diffusion from host vasculature, facilitating progressive growth.

3 Ca in situ e nuovi vasi sanguigni!

4 Ca invasivo!

5 I grandi vasi sono statici!

6 I capillari sono dinamici!

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8 La neo-angiogenesi è collegata al processo di metastatizzazione!

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10 The Angiogenic Phenotype! Somatic mutation Small avascular tumor Proangiogenic factors secreted by tumor and stroma Tumor growth and metastasis Angiogenic inhibitors may prevent neovascularization and induce vascular regression = Proangiogenic factor, VEGF = Angiogenic inhibitor Carmeliet and Jain. Nature. 2000;407:249.

11 Lo switch angiogenico!! I tumori producono fattori pro-angiogenici ed antiangiogenici!! Nella prima fase della crescita tumorale, il bilancio é tale da non favorire l angiogenesi!! Lo switch avviene quando I fattori pro-angiogenici prendono il sopravvento!! L ulteriore crescita tumorale e la metastatizzazione sono angiogenesi-dipendenti!

12 Segnali di attivazione dello switch!! Stress metabolico (ipossia, basso ph, ipoglicemia): tutte condizioni che si creano nell habitat tumorale quando avviene un accrescimento di massa senza angiogenesi!! Infiammazione!! Stress in generale!

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17 Cellule produttrici di fattori pro- ed anti-angiogenici!! Anche se si assume generalmente che le cellule tumorali sono la maggiore fonte di tali fattori, anche le cellule dello stroma tumorale possono giocare un ruolo attivo nella loro sintesi!

18 Formazione di vasi nel tumore!! Meccanismi di sprouting (diramazione) e intussusception!! Sprouting: iniziale dilatazione dei vasi (VEGF), che supera la barriera dovuta all aderenza cellula-cellula promossa da Ang1 e da molecole d adesione (PECAM, caderine)!! Proteolisi della membrana basale (stimolata da Ang2)!! Proliferazione endoteliale, migrazione e riorganizzazione (VEGF, Ang1 e bfgf)!! Reclutamento di muscolatura liscia: PDGF-BB!

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20 Struttura e funzione dei vasi tumorali!! I meccanismi di regolazione dell angiogenesi sono molto meno stringenti!! I vasi tumorali hanno caratteristiche strutturali diverse da quelli normali: in alcuni casi, il lume é rivestito da un mosaico di cellule endoteliali e tumorali (con ovvie implicazioni per il processo di metastatizzazione)!! I vasi tumorali sono tortuosi, dilatati, molto ramificati: questo provoca ipossia locale nel tumore, indirettamente provoca problemi di distribuzione dei farmaci antitumorali, ed inoltre porta ad ulteriore stimolazione della produzione di fattori pro-angiogenici!

21 Normal and Tumor Vasculature!

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23 Quiescenza tumorale!! Non necessariamente la crescita dei tumori segue un evoluzione spontanea fulminante!! Alcuni tumori possono restare in uno stato di quiescenza per anni, probabilmente per l espressione di un elevata quantitá di fattori antiangiogenici (endostatina, angiostatina, ecc.)!

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25 Terapia anti-angiogenica!! Si basa sul presupposto (dimostrato sperimentalmente in diversi modelli animali) che l inibizione dell angiogenesi impedisca l espansione e metastatizzazione tumorali!! Risultati nei modelli animali: la terapia anti-angiogenica non é in grado di uccidere le cellule tumorali esistenti (stasi tumorale)!! Gli inibitori dell angiogenesi sembrano normalizzare I vasi tumorali. Questo potrebbe aumentare l efficacia di farmaci chemioterapici, facendo sí che raggiungano l intera massa tumorale!

26 Antiangiogenic Strategies!! Endothelial cell proliferation!! Inhibition of proangiogenic factors!

27 Tumor Angiogenesis!! A shift in the homeostatic balance of proangiogenic and antiangiogenic factors!! VEGF family is best characterized of the proangiogenic growth factors.!! VEGF is considered the most potent and specific of the many angiogenic factors!

28 Vascular Endothelia Growth Factors (VEGF)!! Blood vessel development is dependent upon VEGF family of proteins and their receptors.!! Binding of proteins results in direction of cellular function.!

29 VEGF!! Promotes survival and proliferation of endothelial cells!! Increase vascular permeability!! Expressed in most human tumors!! Correlates with the extent of angiogenesis and prognosis!

30 VEGF Family!! Consists of VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E and placenta growth factor (PIGF)!! VEGF-A most well characterized!! VEGF-A is the most potent direct-acting angiogenic protein known!

31 VEGF Receptors!

32 Rationale for Targeting Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)!! Most potent and specific mitogen for endothelial cells!! Preclinical models - inhibition slows tumor progression and is synergistic with cytotoxic agents and irradiation 1-3!! Overexpressed in many types of human tumors 4!! Overexpression associated with malignant progression 4,5! 1. Gorski et al. Cancer Res. 1999;59: Lee et al. Cancer Res. 2000;60: Hu et al. Am J Pathol. 2002;161: Ferrara. J Mol Med. 1999;77: Dvorak. J Clin Oncol. 2002;20:4368.

33 Modulating VEGF!

34 Bevacizumab!! Recombinant humanized monoclonal IgG 1 antibody!! Recognizes all isoforms of VEGF 1!! Estimated half-life approximately 20 days (range, days)! 1. Presta et al. Cancer Res. 1997;57:4593.

35 Bevacizumab Binds VEGF! Anti-VEGF antibody (Bevacizumab) VEGF P P P P VEGFR-1 P P P P VEGFR-2 Endothelial cell Presta et al. Cancer Res. 1997;57:4593.

36 Azioni del bevacizumab! Blocco dell angiogenesi...e normalizzazione dei vasi tumorali!

37 Colorectal Cancer!

38 Randomized Phase III Trial Design of IFL +/- Bevacizumab in First-Line MCRC! IFL + placebo (n=411) PD Second-line chemotherapy alone Previously untreated MCRC (n=923) IFL + Bevacizumab (5 mg/kg, q2w) (n=402) PD* Bevacizumab + second-line chemotherapy 5-FU/LV + Bevacizumab (5 mg/kg, q2w) (n=110) PD* Bevacizumab + second-line chemotherapy Primary endpoint: Survival *Patients receiving Bevacizumab could continue therapy past disease progression in combination with second-line therapy. After a predetermined interim safety analysis determined the safety of IFL + Bevacizumab, the 5-FU/LV arm was discontinued. IFL = bolus irinotecan/5-fu/lv (Saltz regimen). Hurwitz et al. N Engl J Med. 2004;350:2335.

39 Percent surviving Phase III IFL +/- Bevacizumab in " Treatment Group Error bars represent 95% confidence intervals. Hurwitz et al. N Engl J Med. 2004;350:2335. MCRC: Survival! IFL + placebo (n=411) IFL + Bevacizumab (n=402) Median survival: 15.6 vs 20.3 mo P<0.001, HR Months

40 Bevacizumab Toxicities!! Arterioembolic events (ATEs)!! Hypertension!! Proteinuria!! Wound healing complications!! Bleeding!! Headache!

41 Can We Afford This???!! Bevacizumab costs $4,000 every 2 weeks = $104,000/ year!! Cost-effectiveness studies!! Molecular or clinical markers of benefit!! VEGF expression does not predict!! Correlative studies from ECOG 2100 and others!

42 Invasivitá e metastatizzazione!! Invasione della matrice extracellulare!! Disseminazione vascolare e attecchimento!

43 Cascata" metastatica!!diminuita aderenza intercellulare!!legame a componenti della matrice extracellulare!!degradazione della matrice!!migrazione delle cellule tumorali!

44 Invasione della matrice!! Diminuzione delle caderine E: diminuita adesione intercellulare!! Adesione alla matrice: favorita da particolari integrine, e da recettori per laminina e fibronectina!! Degradazione della matrice: metalloproteinasi di matrice (MMP). L inibizione dell attivitá proteolitica di MMP-2 (collagenasi IV) riduce la metastatizzazione in modelli animali!! Migrazione: produzione di fattori stimolanti la motilitá cellulare (HGF, timosina ß15)!

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46 Disseminazione ed attecchimento!! La stragrande maggioranza delle cellule tumorali, anche se riesce a raggiungere la circolazione sanguigna/linfatica, non dá origine a metastasi!! Le cellule tumorali formano piccoli agglomerati embolici all interno dei vasi, che si arrestano nella microvasculatura e favoriscono l uscita delle cellule tumorali dai vasi!

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48 Target per la metastatizzazione!! Metastatizzazione preferenziale di certi tumori in certi tessuti (p.es., fegato e polmone):!! considerazioni anatomiche: la microvascolatura di alcuni organi è più stretta di altri, e le cellule tumorali sono intrappolate;!! alcuni tumori esprimono recettori per determinate molecole presenti in quel particolare organo sulla superficie delle cellule endoteliali;!! Le cellule tumorali possono causare l ingresso in circolo di cellule derivate dal midollo osseo che vanno in determinati tessuti e ne cambiano il microambiente.!

49 Interazione tumoremicroambiente!! Il circolo vizioso delle metastasi ossee:!! Secrezione di PTHrP da parte delle cellule tumorali;!! Degradazione della matrice ossea da parte delle cellule ossee;!! Rilascio di fattori come TGFß;!! Risposta delle cellule tumorali al TFGß: proliferazione e secrezione di nuovo PTHrP.!

50 Quali sono i primi eventi a siti di metastasi?!

51 Il concetto di nicchia tumorale!! Le cellule tumorali secernono fattori in grado di far migrare cellule del midollo osseo (VEGFR1 +) in determinate aree;!! Le cellule tumorali secernono fattori in grado di stimolare i fibroblasti del futuro sito metastatico a modificare la matrice extracellulare in modo da favorire l attecchimento delle cellule del midollo osseo;!! L azione delle cellule del midollo osseo crea un microambiente necessario per le cellule tumorali.!

52 Genetica delle metastasi!! Geni prevalentemente associati al fenotipo metastatico: esistono? Che cosa fanno?!! Molecular profiling dei tumori!

53 Molecular profiling!! Avvento dell era post-genomica : non si puó piú pensare di studiare un gene/una proteina alla volta!! profili di espressione genica, profili di espressione proteica : una visione resa tecnologicamente ora possibile dell attivitá cellulare nel suo insieme!

54 Profili di espressione genica:" tecnologia degli array di DNA!! Un array di DNA consiste in una serie enorme di righe composte da oligonucleotidi depositati su un chip di silicio o un vetrino!! Gli oligonucleotidi contengono sequenze complementari a trascritti di interesse (o a tutti I trascritti di un determinato genoma)!

55 Procedura!! Estrazione dell RNA!! Amplificazione e marcatura con un fluorocromo!! Ibridizzazione dell RNA in presenza di un RNA controllo, marcato con un altro fluorocromo!! Ad ogni punto nell array (che contiene un determinato oligonucleotide) ci sará quindi una fluorescenza che rappresenta l abbondanza relativa del trascritto rispetto ai due RNA studiati!

56 Oligonucleotide arrays - (Affymetrix GeneChips) -for each gene there is a set of oligonucleotides (25mers) based on predicted ability to hybridize to its specific target -for each oligo, there is a mismatch sequence to check for specificity.

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58 Micro-dissezione laser-assistita!!!! Un film costituito da particolari polimeri é posto in contatto con il campione patologico! Un fascio laser attiva il polimero nella zona selezionata (7-8 µm di diametro), trasferendo il campione al polimero! Il materiale purificato viene poi processato in vari modi!

59 Correlazioni fra profili di espressione genica e prognosi!! Linfomi non-hodgkin:!! 40% dei pazienti rispondono molto bene al trattamento, il restante ha una pessima prognosi. Non esiste nessun criterio che consenta di prevedere la risposta al trattamento!! Profili di espressione genica:!! I due gruppi di pazienti sono prevedibili in base a diversi profili di espressione genica!! Identificazione di 2 malattie!

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61 Emergenza sequenziale di subcloni. Un processo di selezione competitiva fra I subcloni coesistenti porta all emergenza del subclone maligno vincente, che peró puó acquisire nel tempo nuove alterazioni genetiche dando origine ad eterogeneitá genetica!

62 A progression puzzle!! This model of tumour progression carries with it a striking conceptual inconsistency: the genes that specify the final step in tumour progression metastasis would not seem to confer increased proliferative benefit at the primary site. That is, there is no reason to think that a metastatic phenotype enables cells to proliferate more effectively within the primary tumour mass, thereby increasing their representation in the overall tumour-cell population. Hence, rare cells in the primary tumour mass that happen to acquire metastatic capability will remain rare. As the success rate of individual cells undertaking metastasis is extraordinarily low, this makes it difficult to imagine how metastasis can ever proceed.!

63 Alternative model: weinberg and bernards, 2002!!.Reasoning like this drives us to consider a quite different mechanistic model: namely, that the tendency to metastasize is largely determined by the identities of mutant alleles that are acquired relatively early during multistep tumorigenesis. It is already apparent that there are several alternative genetic paths that cells can take en route to forming a primary tumour. Thus, a particular phenotype required early in tumorigenesis by an evolving tumour cell can be acquired through the mutation of any one of several alternative growth-controlling genes. We suggest that a subset of the mutant alleles acquired by incipient tumour cells early in tumorigenesis confer not only the selected replicative advantage, but also, later in tumorigenesis, the proclivity to metastasize. This proclivity will become manifest only much later in tumour progression, in the context of yet other mutations that have struck the genomes of descendant cells.!

64 Implicazioni!! This type of thinking has three implications. First, the tendency of a tumour eventually to metastasize is already pre-ordained by the spectrum of mutations that progenitor cells acquire relatively early in tumorigenesis; that is, some cancers start out 'on the wrong foot'. Second, genes and genetic changes specifically and exclusively involved in orchestrating the process of metastasis do not exist. Instead, the genes for metastasis are largely those that cancer biologists have been studying intensively for a generation: the oncogenes and tumour-suppressor genes. Third, because important components of the genotype of metastasis are already implanted in cells relatively early in tumorigenesis, even relatively small primary tumour cell populations may already have the ability to dispatch metastatic pioneers to distant sites in the body.!

65 Evidenze in supporto!! Several independent lines of evidence seem to support these ideas. In some small, well-localized primary human breast cancers, individual carcinoma cells are clearly detectable in the bone marrow. Furthermore, DNA-microarray analysis reveals that the gene-expression pattern of metastatic tumour cells is often strikingly similar to that of the cells confined to the primary tumour mass from which they were derived, implying that the dominant cell population in the primary tumour mass is phenotypically and possibly genotypically (almost) identical to the cells in the metastases.equally relevant are other studies in which the gene-expression profiles of the dominant populations of breastcancer cells within a primary tumour mass have been used to predict, with 90% accuracy, whether the tumour will remain localized or whether the patient will experience metastases and disease relapse. Here, once again, the metastatic behaviour of these cancer cells seems to be determined relatively early in tumorigenesis. (The implications for the usefulness of early clinical detection of breast cancer are unsettling.) Finally, several well-studied oncogenes, including ras and myc, the proliferative powers of which are well documented, can function in certain mouse models of tumorigenesis to enable cancer cells to metastasize.!

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