Cryptosporidium Antigen (Stool) ELISA

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1 Cryptosporidium Antigen (Stool) ELISA Enzyme Immunoassay for the qualitative determination of Cryptosporidium antigen HZ

2 Version 5.0 Effective, March 2012 (rev 3) Please use only the valid version of the package insert provided with the kit. Verwenden Sie nur die jeweils gültige, im Testkit enthaltene, Arbeitsanleitung. Si prega di usare la versione valida dell'inserto del pacco a disposizione con il kit. Por favor, se usa solo la version valida de la metodico técnico incluido aqui en el kit. Table of Contents / Inhaltsverzeichnis / Tabella die Contenuti / Tabla de Contenidos 1 INTENDED USE SUMMARY AND EXPLANATION PRINCIPLE OF PROCEDURE REAGENTS WARNINGS/PRECAUTIONS STORAGE CONDITIONS PREPARATION COLLECTION OF STOOL (FECES) PROCEDURE QUALITY CONTROL RESULTS LIMITATION OF PROCEDURE EXPECTED VALUES PERFORMANCE CHARACTERISTICS TROUBLESHOOTING USO INTESO SOMMARIO E SPIEGAZIONI PRINCIPIO DEL PROCEDIMENTO REAGENTI AVVERTENZE / PRECAUZIONI

3 6 CONDIZIONI DI CONSERVAZIONE PREPARAZIONE RACCOLTA DEI CAMPIONI (FECI) PROCEDIMENTO CONTROLLO QUALITÀ RISULTATI LIMITI DEL PROCEDIMENTO VALORI ASPETTATI CARATTERISTICHE DEL TEST RISOLUZIONE DI PROBLEMI BIBLIOGRAPHY / BIBLIOGRAFIA SYMBOLS USED WITH HÖLZEL ASSAYS

4 INTENDED USE This ELISA is an in vitro immunoassay for the qualitative determination of Cryptosporidium antigen in fecal specimens. SUMMARY AND EXPLANATION Cryptosporidium is a coccidian parasite that is recognized as an important enteric pathogen. The organism causes an acute, though self-limiting infection in immunocompetent individuals. Incubation periods of 1 to 12 days have been reported with most oocyst shedding ending by day 21. Symptoms range from mild to severe diarrhea with a variety of complications. 1,8,9,10,11,13 The infection in immunocompromised patients is much more severe and may often be life threatening. Passage of fluid, up to 12 liters per day, has been reported. 1,2,3,12,14,16 Multiple pathways of Cryptosporidium transmission have been implicated. These include animal to human, water contamination and person-to-person. The latter may include contact between members of the same household, day care centers, and homosexual men. 1,2,12,14,16 Diagnosis of Cryptosporidium infections was done originally by direct detection techniques. Of these, microscopic examination of stools using stains or fluorescence labeled antibodies has been the most common. However, this method relies on an experienced technician and subsequent observation of intact organisms. Because of the historically low proficiency of correct microscopic examinations, alternative diagnostic methods have been investigated. 4,5,16,17 One important alternative has been the development of an antigen capture enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for use with stools. These tests, which have shown comparable sensitivity to experienced microscopic examinations, are fairly simple to perform and do not require the observation of intact organisms. 6,7 PRINCIPLE OF PROCEDURE During the first incubation, Cryptosporidium specific antigen present in the stool specimens are captured by antibodies attached to the microwells. The wells are incubated and washed before anti-cryptosporidium antibodies conjugated to horseradish peroxidase are added. The enzyme conjugate will sandwich any antigen bound to the wells. After washings to remove unbound enzyme, a chromogen is added which develops a blue color in the presence of the enzyme complex. The stop solution ends the reaction and turns the blue color to yellow. If no antigen is captured, or if there is an insufficient level of antigen, no colored reaction will take place. 4

5 REAGENTS Item Description Symbol Test Strips Enzyme Conjugate Positive Control Negative Control Chromogen Wash Concentrate (20X) Dilution Buffer Stop Solution Microwells containing anti-cryptosporidium antibodies - 96 test wells in a test strip holder. One (1) bottle containing 11 ml of anti-cryptosporidium antibodies conjugated to horseradish peroxidase with thimerosal. One (1) vial containing 2 ml of a diluted Cryptosporidium positive formalinized stool supernatant. One (1) vial containing 2 ml of a buffered protein solution with thimerosal. One (1) bottle containing 11 ml of the chromogen tetramethylbenzidine (TMB) and peroxide. Two (2) bottles containing 25 ml of concentrated buffer with detergent and thimerosal. Four (4) bottles containing 30 ml of a buffered protein solution with thimerosal. One (1) bottle containing 11 ml of 5% phosphoric acid. 5

6 WARNINGS/PRECAUTIONS Do not deviate from the specified procedures when performing this assay. All specimen dilutions, incubation times/temperatures and washings have been optimized for the best performance characteristics. Deviations from the specified procedures may affect the sensitivity and specificity of the assay. For In Vitro Diagnostic Use Only. Do not interchange reagents between kits with different lot numbers. Do not use reagents that are beyond their expiration dates. Expiration dates are on each reagent label. Use of reagents beyond their expiration dates may affect results. Unused microwells should be stored in the desiccated pouch to protect them from moisture. Do not use solutions if they precipitate or become cloudy. Exception: Wash concentrate may precipitate during refrigerated storage, but will dissolve upon warming. Do not add azides to the samples or any of the reagents. Controls and some reagents contain thimerosal as a preservative, which may be irritating to skin, eyes and mucous membranes. In case of contact, flush eyes or rinse skin with copious amounts of water. Treat all reagents and samples as potentially infectious materials. Use care to prevent aerosols and decontaminate any spills of samples. Stop solution is a 5% solution of phosphoric acid in water. If spilled on the skin, wash with copious amounts of water. If acid gets into the eyes, wash with copious amounts of water and seek medical attention. Persons who are color blind or visually impaired may not be able to read the test visually and should use spectrophotometric readings to interpret results. STORAGE CONDITIONS Reagents, strips and bottled components should be stored at 2 C - 8 C. Squeeze bottle containing diluted wash buffer may be stored at room temperature. PREPARATION Before use, bring all reagents and samples to room temperature (15 C - 25 C) and mix. (20X) Wash Concentrate may precipitate during refrigerated storage, but will go back into solution when brought to room temperature (15 C - 25 C) and mixed. Ensure that (20X) wash concentrate is completely in solution before diluting to working concentration. 6

7 To dilute (20X) wash concentrate to working dilution, remove cap and add contents of one bottle of Wash Concentrate to a squeeze bottle containing 475 ml of DI water. Swirl to mix. Squeeze bottle should have a narrow tip to optimize washings. COLLECTION OF STOOL (FECES) No modification of collection techniques used for standard microscopic O&P examinations is needed. Stool samples may be used as unpreserved or frozen, in Cary-Blair Transport Medium or in preservation media of 10% formalin or SAF. Unpreserved samples should be kept at 2 C - 8 C and tested within 24 hours of collection. Samples that cannot be tested within this time should be frozen at -20 C or lower until used. Avoid multiple freeze/thaw cycles. Formalinized and SAF preserved samples may be kept at room temperature (15 C - 25 C) or at 2 C 8 C and tested within 18 months of collection. DO NOT freeze preserved samples. Samples in Cary-Blair should be kept at 2 C - 8 C or -20 C and tested within 1 week of collection. Avoid multiple freeze/thaw cycles. All dilutions of stools must be made with the Dilution Buffer provided. Do not use dilution buffer from a kit with a different lot number. 7

8 PROCEDURE Materials Provided Cryptosporidium Antigen Stool ELISA Kit (see chapter REAGENTS ) Materials Required But Not Provided Transfer Pipettes Squeeze bottle for washing strips (narrow tip is recommended) Graduated Cylinder Reagent grade (DI) water Micropipette Applicator sticks (recommended) or swabs for sample preparation Sample dilution tubes Suggested Equipment ELISA plate reader capable of reading biochromatically at 450/ nm. Proper Temperature All incubations are at room temperature (15 C to 25 C) Test Procedure Notes: Ensure all samples and reagents are at room temperature (15-25 C) before use. Frozen samples must be thawed completely before use. If needed, prepared samples can be centrifuged at g for 5-10 minutes. Ensure supernatant is clear before use. When running the assay, try to avoid the formation of bubbles in the wells. Bubbles may affect overall performance and reading of end results. Slapping the wells out on a clean absorbent towel after each wash step should help to minimize bubbles in the wells. Controls must be included each time the kit is run. Controls are provided prediluted. DO NOT dilute further. Specimens can be run following the In Well Dilution Procedure or the In Tube Dilution Procedure. See below for specific instructions on how to run the assay using each procedure. 8

9 In Well Dilution Procedure: 1. Break off the required number of wells needed (number of samples plus 2 for controls) and place in holder. 2. Prepare sample dilutions in tubes using 0.3 ml of Dilution Buffer and 0.1 g, about the size of a small pea, of fecal sample using an applicator stick. Mix thoroughly before using. - IF USING SWABS, add 0.6 ml of dilution buffer to dilution tube. Coat the swab with a thin layer of specimen and mix into dilution buffer, expressing as much fluid as possible. Mix thoroughly before using. 3. For watery unpreserved specimens, mix contents then add 0.1 ml of sample to 0.3 ml Dilution Buffer in dilution tubes. Mix thoroughly before using. 4. For samples in SAF, 10% Formalin or Cary-Blair, mix contents thoroughly inside container. No further processing is required. 5. Using a micropipette, add 100 µl of negative control to well # 1 and 100 µl of positive control to well # Using a micropipette, add 50 µl of Dilution Buffer to each sample well. DO NOT add Dilution Buffer to control wells. 7. Add 50 µl of sample to each sample well with Dilution Buffer. 8. Incubate for 60 minutes at room temperature (15-25 C), then wash.* After last wash, slap the wells out on a clean absorbent towel to remove excess wash buffer. Proceed to step 9. In Tube Dilution Procedure: 1. Break off the required number of wells needed (number of samples plus 2 for controls) and place in holder. 2. Prepare sample dilutions in tubes using 0.7 ml of Dilution Buffer and 0.1 g, about the size of a small pea, of fecal sample using an applicator stick. Mix thoroughly before using. - IF USING SWABS, add 1 ml of dilution buffer to dilution tube. Coat the swab with a thin layer of specimen and mix into dilution buffer, expressing as much fluid as possible. Mix thoroughly before using. 3. For watery unpreserved specimens, mix contents then add 0.1 ml of sample to 0.7 ml of Dilution Buffer in dilution tubes. Mix thoroughly before using. 4. For samples in SAF, 10% Formalin or Cary-Blair, mix contents then add 0.2 ml of sample to 0.3 ml of Dilution Buffer in dilution tubes. Mix thoroughly before using. 9

10 5. Using a micropipette, add 100 µl of negative control to well # Using a micropipette, add 100 µl of positive control to well # Add 100 µl of diluted sample to each well. 8. Incubate for 60 minutes at room temperature (15-25 C), then wash.* After last wash, slap the wells out on a clean absorbent towel to remove excess wash buffer. Proceed to step Add 2 drops of Enzyme Conjugate to each well. 10. Incubate for 30 minutes at room temperature (15-25 C), then wash.* After last wash, slap the wells out on a clean absorbent towel to remove excess wash buffer. 11. Add 2 drops of Chromogen to each well. 12. Incubate for 10 minutes at room temperature (15-25 C). 13. Add 2 drops of Stop Solution to each well. Mix wells by gently tapping the side of the strip holder with index finger for approximately 15 seconds. Read reaction within 5 minutes after adding stop solution. 14. Read results visually or using an ELISA plate reader (see instructions below). * Washings consist of vigorously filling each well to overflowing and decanting contents five (5) separate times. When possible, avoid formation of bubbles in the wells as this may affect the end results. 10

11 QUALITY CONTROL The positive and negative control must be included each time the assay is run. The use of a positive and negative control allows easy validation of kit stability. Negative control should appear colorless when read visually and should read less than 0.08 OD when read at a dual wavelength of 450/ nm. Positive control should be a clearly visible yellow color and read at greater than 0.5 OD when read at a dual wavelength of 450/ nm. RESULTS Interpretation of Results - Visual Positive: Negative: well. Any sample well that is obviously more yellow than the negative control well. Any sample well that is not obviously more yellow than the negative control NOTE: The negative control, as well as some samples, may show some slight color. A sample well must be obviously darker than the negative control well to be called a positive result. Please refer to the enclosed visual read card for color comparisons. Interpretation of Results - ELISA Reader Zero reader on air. Read all wells using a bichromatic reading with filters at 450 nm and nm. Positive: Negative: Absorbance reading of 0.08 OD and above indicates the sample contains Cryptosporidium antigen. Absorbance reading less than 0.08 OD indicates the sample does not contain detectable levels of Cryptosporidium antigen. LIMITATION OF PROCEDURE Test results should be used as an aid in diagnosis and should not be interpreted as diagnostic by themselves. DO NOT concentrate stool samples. Assay will not give accurate results on a concentrated sample. A negative result can occur from an antigen level lower than the detection limits of this assay. Multiple samples over time may be indicated for those patients that are suspected of being positive for Cryptosporidium. 11

12 EXPECTED VALUES Normal healthy individuals should be free of Cryptosporidium and should test negative. A positive reaction indicates that the patient is shedding detectable amounts of Cryptosporidium antigen. Certain populations, such as homosexual men and children in day care settings, have shown higher rates of infection with Cryptosporidium than the normal population. Please refer to the Summary section for references. 12

13 PERFORMANCE CHARACTERISTICS Study 1: A study was performed with the IVD Research, Inc. Cryptosporidium assay using fresh/frozen specimens, specimens preserved in 10% Formalin and SAF and specimens in Cary-Blair Transport media. There were a total of 94 specimens used in the study that were confirmed positive or negative for Cryptosporidium by microscopy. Of the 94 specimens there were 16 that were positive for Cryptosporidium, and 78 that were negative for Cryptosporidium. The results from the study are shown in the following table. Microscopy + - Cryptosporidium EIA Sensitivity: 100% (16/16) Specificity: 100% (78/78) Study 2: Another study was performed comparing the Cryptosporidium assay (EIA-3467) with another commercially available ELISA. The study was performed using fresh/frozen specimens and specimens preserved in 10% Formalin and SAF. There were a total of 94 specimens used in the study that were confirmed positive or negative for Cryptosporidium. Of the 94 specimens there were 16 that were positive for Cryptosporidium, and 78 that were negative for Cryptosporidium. The results from the study are shown in the following table. EIA Other Commercial ELISA Positive Agreement: 100% (16/16) Negative Agreement: 100% (78/78) Reproducibility The intra-assay (well to well) CV was calculated using 4 positive and 4 negative samples assayed 24 times in a single run. The mean CV was 5.96% with the highest being 9.83%. 13

14 The inter-assay (run to run) CV was calculated using 4 positive and 4 negative samples assayed on three separate days. The mean CV was 4.48% with the highest being 7.3%. Cross Reactivity No cross-reactions were seen with the following organisms: Entamoeba hartmanni, Endolimax nana, Entamoeba histolytica/dispar, Entamoeba coli, Blastocystis hominis, Dientamoeba fragilis, Chilomastix mesnili, Strongyloides stercoralis, Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Diphyllobothrium species, Hymenolepis nana, Clonorchis sinensis, Enteromonas hominis, Trichuris trichiura, Iodamoeba buetschlii, Hookworm, Schistosoma mansoni, Giardia lamblia, Rotavirus, Taenia eggs, Fasciola eggs, Isospora belli, Entamoeba polecki, Adenovirus, & 33 bacterial species (list available on request). TROUBLESHOOTING Problem: Negative control has excessive color after development. Reason: Inadequate washings Correction: Wash more vigorously. Remove excessive liquid from the wells by tapping against an Absorbent towel. Do not allow test wells to dry out 14

15 1 USO INTESO Questo test ELISA é un test immunologico in vitro per la determinazione qualitativa di antigeni di Criptosporidio nelle feci. SOMMARIO E SPIEGAZIONI Si prega di far riferimento al manuale in lingua inglese. PRINCIPIO DEL PROCEDIMENTO Durante la prima incubazione, gli antigeni di specifico al criptosporidio presenti nel campioni fecali sono catturati da anticorpi attaccati ai pozzetti. I pozzetti sono incubati e lavati prima dell aggiunta degli anticorpi anti-criptosporidio coniugati alla perossidasi di rafano. Il coniugato enzimatico si legherà a sandwich ogni antigene legato sul pozzetto. Dopo un lavaggio per rimuovere l enzima non legato, si aggiunge un cromogeno che sviluppa un colore blu nella presenza dell enzima e del perossido. Una soluzione d arresto termina la reazione e vira il colore dal blu al giallo. Se nessun antigene viene catturato o se esiste un livello insufficiente di antigeni, non avviene alcuna reazione colorata. REAGENTI Item Descrizione Simbolo Micropiastre Tracciante enzimatico Controllo positivo Controllo negativo Cromogeno Una micropiastra contenente anticorpi a criptosporidio - 96 pozzetti in un sostegno. Una (1) bottiglia contenente 11 ml di anticorpi anticriptosporidio -coniugati alla perossidasi con timerosal. Un (1) flacone contenente 2 ml di surnatante fecale formalinizzato positivo al criptosporidio diluito. Un (1) flacone contenente 2 ml di soluzione proteica tamponata con timerosal Una (1) bottiglia contentente 11 ml del cromogeno benzidine tetrametilico (TMB) e perossido. 15

16 Concentrato di lavaggio (20X) Tampone di diluizione Soluzione d arresto Due (2) bottiglie contenente 25 ml del tampone concentrato e surfattante con timerosal. Quattro (4) bottiglie contenenti 30 ml di una soluzione proteica tamponata con timerosal. Una (1) bottiglia contenente 11 ml di 5% acido fosforico. 16

17 AVVERTENZE / PRECAUZIONI Non deviare dal protocollo specifico durante l eseguimento del test. Tutte le diluizioni, i tempi e le temperature d incubazione e i lavaggi sono stati ottimizzati per il migliore rendimento possibile. Ogni deviazione dal procedimento puó influenzare la sensitivitá e specificitá del test. Per la diagnosi in vitro soltanto. Non mescolare reagenti provenienti da kit con numeri di lotto differenti. Non usare reagenti dopo la data di scadenza. Le date di scadenze sono indicate sull etichetta di ogni reagente. L uso dei reagenti scaduti puó incidere sui risultati. Micropozzetti non usati devono essere conservati negli involucri essiccati protetti dall umiditá. Non usare le soluzioni se presentano precipitati o opacitá. Eccezione: Il concentrato di lavaggio puó dare precipitate durante la conservazione nel frigorifero, che si dissolvano dopo il riscaldamento. Non aggiungere azidi ai reagenti o ai campioni. I controlli ed alcuni reagenti contengono timerosal come conservante, che puó essere irritante per la pelle, gli occhi e le membrane mucose. In caso di contatto lavare gli occhi o la cute con abbondante acqua. Trattare tutti i reagenti e i campioni come materiale potenzialmente infettivo. Lavorare cautamente evitando la formazione di aerosol e decontaminare ogni perdita dei campioni. La soluzione d arresto é una soluzione al 5 % di acido fosforico in acqua. Al contatto con la pelle lavare con abbondante acqua. Se l acido viene al contatto con gli occhi, lavare con abbondante acqua e cercare l aiuto medico. Persone daltoniche o con disabilitá visiva possono essere non in grado di valutare i risultati visivamente e possono ricorrere alla lettura spettrofotometrica per interpretare i risultati. CONDIZIONI DI CONSERVAZIONE I reagenti, le strisce e i componenti imbottigliati devono essere conservati a 2 C - 8 C. La bottiglia a spruzzo contenente il tampone di lavaggio diluito puó essere conservata a temperatura ambiente. (15 C - 25 C). PREPARAZIONE Prima dell uso, portare tutti i reagenti a temperature ambiente (15 C 25 C) e mescolarli. 17

18 (20X) Concentrato di lavaggio puó precipitare durante la conservazione nel frigorifero, ma si solubilizza portato a temperatura ambiente (15 C - 25 C) e mescolato. Accertarsi che il concentrato di lavaggio (20X) é completamente dissolto prima di diluirlo alla soluzione operative. Per diluire il concentrato di lavaggio (20X) alla soluzione operative, rimuovere il tappo ed aggiungere il contenuto di una bottiglia di concentrato ad una bottiglia a spruzzo contenente 475 ml di acqua distillata. Agitare per mescolare. La bottiglia a spruzzo deve avere una apertura stretta per ottimizzare il lavaggio. RACCOLTA DEI CAMPIONI (FECI) Non si necessita di alcuna modificazione delle tecniche di raccolta usate per le esaminazioni microscopiche O&P. I campioni fecali possono essere usati senza conservanti o congelati. in medio di trasporto Cary-Blair o in medi di conservazione al 10% di formalina o SAF. I campioni senza conservanti devono essere conservati a 2 C - 8 C e processati entro 24 ore dopo la raccolta. I campioni che non possono essere analizzati entro questo tempo devono essere congelati a - 20 C o inferiore fino all uso. NON congelare campioni conservati. Campioni conservati con formalina o SAF possono essere mantenuti a temperature ambiente (15 C 25 C) o a 2 C 8 C e analizzati entro 18 mesi dalla raccolta. NON congelare campioni conservati. Campioni in medio Cary-Blair devono essere conservati a 2 C 8 C o a -20 C e analizzati entro 1 settimana dalla raccolta. Evitare ripetuti cicli di congelamento e scongelamento. Tutte le diluizioni devono essere eseguite con il tampone di lavaggio fornito. Non usare tampone di diluizione di un kit con un differente numero di lotto. 18

19 PROCEDIMENTO Materiale provisto Cryptosporidium Antigen Stool ELISA Materiale richiesto ma non fornito Pipette di trasferimento Bottiglia a spruzzo per il lavaggio (a punta stretta) Cilindro graduato Acqua distillate pura (DI) Micropipette Raccoglitori (raccomandati) o tamponi per la preparazione dei campioni Tubetti per la diluizione dei campioni Attrezzatura raccomandata Lettore per piaste ELISA capace di leggere biocromaticamente a 450/ nm. Temperature raccomandate Tutte le incubazioni avvengono a temperature ambiente (15 C a 25 C) Procedimento del test Nota: Accertarsi che tutti i campioni e reagenti sono a temperatura ambiente (15 C 25 C) prima dell uso. Campioni congelati devono essere completamente scongelati prima dell uso. Se necessario, I campioni preparati possono essere centrifugati a g per 5-10 minuti. Assicurarsi che il surnatante sia chiaro prima dell uso. Durante il procedimento d analisi evitare la formazione di bolle d aria nei pozzetti. Bolle d aria possono influenzare il rendimento e la lettura dei risultati. Scuotere i pozzetti contro la carta assorbente dovrebbe aiutare a minimizzare le bolle. Ogni analisi deve includere I controlli. I controlli sono forniti prediluito. NON diluire ulteriormente. Campioni possono essere processati seguendo il procedimento della diluizione nel pozzetto o seguendo il procedimento della diluizione nel tubetto. Vedi sotto per le istruzioni specifiche su come eseguire il test usando entrambi i procedimenti. 19

20 Procedimento di diluizione nei pozzetti: 1. Staccare il numero richiesto di pozzetti (numero dei campioni più 2 per i controlli) e fissare sul sostegno. 2. Preparare le diluizioni dei campioni nei tubetti usando 0.3 ml del tampone di diluizione e 0.1 g, circa la misura di un pisello piccolo, del campione fecale usando un bastoncino applicatore. Mescolare accuratamente prima dell uso. - SE SI USANO BASTONCINI SWAB, aggiungere 0.6 ml del tampone di diluizione per diluire nei tubetti. Ricoprire i bastoncini con un sottile strato di campione e mescolare dentro il tampone di diluizione, portando in sospensione più materiale possibile. Mescolare accuratamente prima dell uso. 3. Per campioni acquosi non conservati, mescolare il contenuto, poi aggiungere 0.1 ml dei campioni a 0.3 ml del tampone di diluizione nei tubetti. Mescolare accuratamente prima dell uso. 4. Per campioni in SAF, 10% formalina o Cary-Blair, mescolare il contenuto accuratamente. Non si richiede alcun altro procedimento. 5. Usando una micropipetta, aggiungere 100 µl del controllo negativo nel pozzetto # 1 e 100 µl del controllo positivo nel pozzetto # Usando una micropipetta, aggiungere 50 µl del tampone di diluizione in ogni pozzetto per i campioni. NON aggiungere il tampone ai pozzetti di controllo. 7. Aggiungere 50 µl dei campioni in ogni pozzetto contenente il tampone di diluizione. 8. Incubare per 60 minuti a temperature ambiente (15 C - 25 C), poi lavare.* Dopo l ultimo lavaggio, scuotere i pozzetti su della carta assorbente pulita per rimuovere l eccesso di tampone di lavaggio. Procedere con passaggio 9. Procedimento di diluizione nei tubetti: 1. Staccare il numero richiesto di pozzetti (numero dei campioni più 2 per i controlli) e fissare sul sostegno. 20

21 2. Preparare le diluizioni dei campioni nei tubetti usando 0.7 ml del tampone di diluizione e 0.1 g, circa la misura di un pisello piccolo, del campione fecale usando un bastoncino applicatore. Mescolare accuratamente prima dell uso. - SE SI USANO BASTONCINI SWAB, aggiungere 1 ml del tampone di diluizione per diluire nei tubetti. Ricoprire i bastoncini con un sottile strato di campione e mescolare dentro il tampone di diluizione, portando in sospensione più materiale possibile. Mescolare accuratamente prima dell uso. 3. Per campioni acquosi non conservati, mescolare il contenuto, poi aggiungere 0.1 ml dei campioni a 0.7 ml del tampone di diluizione nei tubetti. Mescolare accuratamente prima dell uso. 4. Per campioni in SAF, 10% formalina o Cary-Blair, mescolare il contenuto accuratamente, poi si aggiunge 0.2 ml dei campioni a 0.3 ml di tampone di diluizione nei tubetti. Mescolare accuratamente prima dell uso. 5. Usando una micropipetta, aggiungere 100 µl del controllo negativo nel pozzetto # Usando una micropipetta, aggiungere 100 µl del controllo positivo nel pozzetto # Aggiungere 100 µl dei campioni in ogni pozzetto. 8. Incubare per 60 minuti a temperature ambiente (15 C - 25 C), poi lavare.* Dopo l ultimo lavaggio, scuotere i pozzetti su della carta assorbente pulita per rimuovere l eccesso di tampone di lavaggio. Procedere con passaggio Aggiungere 2 gocce del coniugato enzimatico in ogni pozzetto. 10. Incubare per 30 minuti a temperature ambiente (15 C - 25 C), poi lavare.* Dopo l ultimo lavaggio, scuotere i pozzetti su della carta assorbente pulita per rimuovere l eccesso di tampone di lavaggio. 11. Aggiungere 2 gocce del cromogeno in ogni pozzetto. 12. Incubare per 10 minuti a temperature ambiente (15 C - 25 C). 13. Aggiungere 2 gocce della soluzione d arresto in ogni pozzetto. Mescolare i pozzetti gentilmente chiudendo i lati del sostegno con l indice per circa 15 secondi. Determinare la reazione entro 5 minuti dopo l aggiunta della soluzione d arresto. 14. Leggere il risultato visualmente o usando un lettore per piastre ELISA (vedi L istruzioni sotto). 21

22 * I lavaggi consistono nel riempimento completo di ogni pozzetto e conseguente decantamento per 5 volte. Se possibile, evitare la formazione di bolle d aria nei pozzetti, che possono influenzare i risultati. 22

23 CONTROLLO QUALITÀ Il controllo positivo e negativo deve essere sempre incluso nell eseguimento del test. L uso del controllo positivo e negativo permette la valutazione della stabilità del test kit. Il controllo negativo deve apparire incolore se il risultato é determinato visivamente e deve assorbire meno di 0.08 DO se determinato spettrofotometricamente a 450/ nm. Il controllo positivo deve apparire chiaramente giallo e deve assorbire più di 0.5 DO se determinato spettrofotometricamente a 450/ nm. RISULTATI Interpretazione dei risultati - visivamente Positivo: Negativo: Ogni campione che é ovviamente più giallo del controllo negativo. Ogni campione che non é ovviamente più giallo del controllo negativo. NOTA: Il controllo negativo, come alcuni campioni, può mostrare un leggero colore. Un campione deve essere chiaramente più scuro del controllo negativo per poter essere considerato positivo. Si prega di far riferimento alla carta cromatica inclusa per la comparazione visiva. Interpretazione dei risultati ELISA lettore Azzerare contro aria. Misurare tutti i pozzetti a 450/ nm. Positivo: Negativo: Letture di assorbimento di 0.08 DO e superiori indicano che il campione contiene antigeni di criptosporidio Letture di assorbimento inferiore a 0.15 unità OD indicano che il campione non contiene livelli rilevabili di antigeni di criptosporidio. LIMITI DEL PROCEDIMENTO I risultati del test devono essere usati come un aiuti diagnostico e non devono essere interpretati come diagnosi stessa. NON concentrare campioni fecali. Il test non dà risultati attinenti con campioni concentrati. Un risultato negativo può occorrere quando il livello antigenico è inferiore al livello di rilevabilità di questo test. L analisi di più campioni per un certo periodo di tempo può essere utile per quei pazienti che sono sospetti di essere positivi a criptosporidio. 23

24 VALORI ASPETTATI Individui normali sani devono essere privi di cripto sporidio e dare risultati negativi. Una reazione positiva indica che il paziente espelle una quantità rilevabile di antigeni di criptosporidio. Certe popolazioni, come uomini omosessuali e bambini nei asili nidi, hanno mostrato tassi di infezione con criptosporidio più alti rispetto al valor medio della popolazione. CARATTERISTICHE DEL TEST Si prega di far riferimento al manuale in lingua inglese. RISOLUZIONE DI PROBLEMI Problema: Il controllo negative mostra un eccessivo sviluppo di colore. Ragione: lavaggi insufficienti Correzione: lavare piu energicamente. Rimuovere il liquido in eccesso dai pozzetti premendoli contro la carta assorbente. Evitare l essiccamento dei pozzetti. 24

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27 SYMBOLS USED WITH HÖLZEL ASSAYS Symbol English Deutsch Français Español Italiano Consult instructions for Gebrauchsanweisung Consulter les Consulte las Consultare le istruzioni use beachten instructions d utilisation instrucciones de uso per l uso European Conformity CE-Konfirmitätskennzeichnung Conformité aux normes européennes Conformidad europea Conformità europea In vitro diagnostic device In-vitro-Diagnostikum Usage Diagnostic in vitro Para uso Diagnóstico in vitro Per uso Diagnostica in vitro RUO For research use only Nur für Forschungszwecke Seulement dans le cadre de recherches Sólo para uso en investigación Solo a scopo di ricerca Catalogue number Katalog-Nr. Numéro de catalogue Número de catálogo Numero di Catalogo Lot. No. / Batch code Chargen-Nr. Numéro de lot Número de lote Numero di lotto Contains sufficient for Ausreichend für n Contenu suffisant pour Contenido suficiente Contenuto sufficiente <n> tests/ Ansätze n tests para <n> ensayos per n saggi Storage Temperature Lagerungstemperatur Température de conservation Temperatura de conservación Temperatura di conservazione Expiration Date Mindesthaltbarkeitsdatum Date limite d utilisation Fecha de caducidad Data di scadenza Legal Manufacturer Hersteller Fabricant Fabricante Fabbricante Distributed by Distributor Vertreiber Distributeur Distribuidor Distributore Content Content Inhalt Conditionnement Contenido Contenuto Volume/No. Volume / No. Volumen/Anzahl Volume/Quantité Volumen/Número Volume/Quantità 27

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