BIOMOLECOLE DI INTERESSE APPLICATIVO 1
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1 BIOMOLECOLE DI INTERESSE APPLICATIVO 1
2 Negli ultimi 30/40 anni, indagini in campo ortopedico e dentale hanno permesso di valutare l abilità di differenti superfici nello stimolare la formazione di tessuto osseo in vitro e in vivo Nessuna tecnologia di preparazione o rivestimento della superficie sembra però agire attraverso un meccanismo biologicamente specifico Un approccio potenzialmente molto promettente riguarda l immobilizzazione di fattori biochimici sulla superficie dell impianto al fine di indurre una specifica risposta cellulare e di promuovere una condizione di integrazione ottimale Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 2
3 Problemi relativi all utilizzo di proteine bioattive L uso clinico di proteine biologicamente attive quali BMP, fibronectina e vitronectina è reso difficile in quanto si tratta di macromolecole instabili e spesso insolubili, che richiedono l integrità della struttura terziaria e che possono venire degradate nell ambiente fisiologico Il loro impiego comporta costi elevati, difficoltà di reperimento e una disponibilità quantitativamente limitata Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 3
4 PEPTIDE MIMICRY Individuazione della sequenza bioattiva PROTEINA BIOATTIVA Instabile Insolubile Costosa PEPTIDE BIOATTIVO Stabile Solubile Economico Disponibile in grandi quantità e ad un elevato grado di purezza Meno attivo a parità di concentrazione Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 4
5 L adesione cellulare è un processo fondamentale per la formazione ed il mantenimento della struttura dei tessuti e quindi per una loro corretta funzione Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 5
6 Sequenza di immagini relative alla variazione di morfologia di una cellula durante il processo di adesione 6
7 Matrice ossea acellulare Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 7
8 Adesione degli osteoblasti su matrice ossea acellulare pretrattata con fibronectina Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 8
9 Adesione degli osteoblasti su matrice ossea acellulare pretrattata con peptide di adesione Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 9
10 ADESIONE CELLULARE 10
11 ADESIONE CELLULA-CELLULA ADESIONE CELLULA-ECM L adesione si realizza mediante interazioni altamente specifiche e selettive che coinvolgono sia proteine della membrana cellulare che proteine presenti sulla matrice extracellulare (ECM) Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 11
12 LA MEMBRANA CELLULARE 12
13 Le membrane sono associazioni lipo-proteiche in cui i componenti sono tenuti assieme, in un foglietto sottile, da legami non covalenti La membrana plasmatica: separa la cellula dall ambiente in cui vive fornisce una barriera selettiva che consente lo scambio di certe sostanze ma impedisce il passaggio di altre contiene i recettori per rispondere all ambiente esterno fornisce una struttura di sostegno Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 13
14 Le membrane sono strutture dinamiche e complesse che regolano, in modo estremamente selettivo, il traffico di molecole dall'esterno verso l'interno della cellula e viceversa La permeabilità altamente selettiva nei riguardi dei soluti polari consente, ad esempio, di regolare e mantenere una determinata concentrazione ionica all'interno della cellula Le membrane sono anche presenti all'interno delle cellula come rivestimento dei diversi organuli che vengono così separati dal citoplasma in cui sono immersi Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 14
15 Le membrane non sono strutture statiche ed inerti; al contrario, rappresentano sistemi complessi nei quali molecole di tipo diverso si associano tra loro costituendo una struttura ordinata La singolare dinamicità e flessibilità delle membrane determina le funzioni svolte e consente alla cellula le modificazioni morfologiche che hanno luogo durante la crescita ed il movimento Queste importanti caratteristiche sono strettamente legate alla particolare struttura delle membrane che sono tenute insieme essenzialmente da interazioni di tipo idrofobico Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 15
16 Le membrane cellulari sono al tempo stesso: resistenti flessibili autosigillanti Le proprietà autosigillanti consentono alla membrana di autoripararsi, ossia di richiudersi rapidamente ed automaticamente, qualora in essa si produca per via meccanica un foro, come ad esempio accade con la puntura di un ago La capacità di autosigillarsi permette inoltre alle membrane di fondersi e scindersi, senza che si abbiano perdite di materiale cellulare, nel corso di processi fondamentali per la vita e l attività delle cellule Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 16
17 Fusione spermatozoo-ovulo Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 17
18 Funzioni delle membrane Contorno e barriera di permeabilità Organizzazione e localizzazione della funzione Processi di trasporto Comunicazione cellula-cellula Rilevamento del segnale Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 18
19 Le natura delle membrane è prevalentemente lipidica: tuttavia le membrane contengono anche una notevole varietà di proteine specializzate che promuovono o catalizzano un gran numero di eventi biochimici Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 19
20 Le proteine di membrana svolgono funzioni diverse: Proteine strutturali: stabiliscono le connessioni tra più cellule organizzate in tessuti e organi Proteine costituenti parte dei recettori: sono coinvolte nel riconoscimento e legame di altre molecole esterne alla cellula Proteine concorrenti alla formazione di canali e pompe: sono coinvolte nel trasporto di sostanze all interno e all esterno della cellula Enzimi Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 20
21 Le proteine ed i lipidi polari rappresentano la quasi totalità della massa delle membrane biologiche; le piccole quantità di carboidrati, presenti soprattutto nella membrana plasmatica delle cellule eucariotiche, sono costituite, in genere, da glicoproteine e glicolipidi Le quantità relative di lipidi e di proteine variano a seconda del tipo di membrana e riflettono le differenze nelle loro funzioni biologiche Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 21
22 Componenti della membrana cellulare Componente Composizione Funzione Fosfolipidi Doppio strato di fosfolipidi Fornisce una barriera permeabile e una matrice per le proteine Carriers Trasportano molecole attraverso la membrana contro gradiente Proteine integrali Canali Trasporto passivo di molecole attraverso la membrana Recettori Trasmettono informazioni dentro la cellula 22
23 Altri componenti della membrana cellulare Componente Composizione Funzione Network interno di proteine Spettrine Clatrine Determinano la forma delle cellule Ancorano certe proteine a siti specifici, specialmente sull esterno della membrana cellulare nella endocitosi medita da recettori Marker sulla superficie cellulare Glicoproteine Glicolipidi Self-recognition Riconoscimento di tessuti 23
24 PROTEINE DI MEMBRANA 24
25 Integrine I recettori presenti sulla membrana cellulare che contattano fibronectina, laminina e tenascina (proteine dell ECM) appartengono alla famiglia delle integrine Le integrine sono in grado di interagire anche con proteine di membrana Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 25
26 Le integrine sono eterodimeri: ogni eterodimero è composto di una subunità e una subunità Entrambe le catene sono caratterizzate da un importante dominio extracellulare, una zona idrofobica trasmembrana e da una corta coda citoplasmatica Nei vertebrati esistono 16 tipi di catena ed 8 tipi di catena che generano 20 integrine distinte Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 26
27 Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 27
28 Altre molecole di adesione cellulare che mediano l adesione cellula-cellula sono: caderine Famiglia composta da una dozzina di proteine che mediano l adesione cellulare calcio-dipendente Ne esistono più tipi: E-caderina (epiteliale), N-caderina (neurale) e P-caderina (placentale) Le caderine sono composti da: un segmento extracellulare esteso contenente 4 domini un breve tratto transmembrana un singolo dominio citoplasmatico Uniscono cellule dello stesso tipo, legandosi tra di loro Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 28
29 Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 29
30 Immunoglobuline La superfamiglia delle immunoglobuline comprende gli anticorpi e un ampia varietà di proteine transmembraniche; alcune di queste ultime mediano l adesione cellula-cellula indipendente da ioni calcio. Strutturalmente queste proteine sono composte da una serie di domini simili. Ciascun dominio è composto da amminoacidi organizzati in una struttura altamente ripiegata. Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 30
31 Selectine Esistono tre tipi di selectine: L-selectina, E-selectina e P-selectina. Strutturalmente la proteina è composta da un dominio N- terminale omologo alle lectine animali calcio-dipendenti, da un dominio tipo EGF, da 2 a 9 domini seguiti da un tratto elicoidale transmembranico e da una corta coda citoplasmatica. Le selectine mediano il processo di adesione cellulare tramite il riconoscimento, calcio dipendente, dei glicani sialiati. 31
32 PROTEINE DELLA ECM 32
33 Proteine adesive: Fibronectina La fibronectina permette alle cellule di aderire alla ECM attraverso il legame con le integrine presenti sulla membrana cellulare; interagisce inoltre con il collagene, la fibrina e l eparina presenti nell ECM Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 33
34 Legame tra Fibronectina ed Integrina I domini extracellulari dell integrina legano i componenti della ECM attraverso un legame tra la subunità e il motivo RGD Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 34
35 Laminina Partecipa alla formazione della lamina basale e lega le integrine della membrana cellulare Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 35
36 La laminina è una proteina trimerica costituita di tre catene denominate, e Queste tre catene formano una croce o una Y Tre braccia della croce rappresentano i siti N-terminali delle catene mentre le regioni C-terminali sono raggruppate e legate tramite tre ponti a disolfuro Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 36
37 Tenascina Complesso di sei catene polipeptidiche unite da ponti a disolfuro che si proiettano a raggiera da un punto centrale La tenascina contiene più siti di legame per le integrine Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 37
38 Vitronectina La vitronectina è una glicoproteina adesiva multifunzionale presente sia nel circolo che in differenti tessuti Interviene nella regolazione dell adesione cellulare, della difesa immunitaria e nell invasione cellulare Strutturalmente è caratterizzata da un elevato contenuto in struttura e presenta molti siti di legame (per integrine, collagene, componenti di complemento, perforina, plasminogeno ) Nel tratto C-terminale è presente un cluster policationico di 40 AA contenente il sito di legame per l eparina Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 38
39 ALTRE PROTEINE DI INTERESSE APPLICATIVO: FATTORI DI CRESCITA 39
40 I fattori di crescita sono proteine che, legandosi ad opportuni recettori cellulari, attivano il processo di proliferazione e/o di differenziazione cellulare Vi sono fattori di crescita versatili ed altri di tipo specifico ovvero attivi solo nei confronti di un particolare tipo di cellule Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 40
41 41
42 Insulin-like Growth Factors (IGFs) Rappresentano il fattore di crescita più abbondante tra quelli prodotti dagli osteoblasti: IGF-I e l IGF-II sono i membri più importanti della famiglia IGF-I è prodotto in risposta all ormone della crescita (GH) e induce attività cellulari legate alla crescita dell osso È composto di 70 amminoacidi e presenta il 60% di identità con la proinsulina IGF-II viene espresso nei tessuti embrionali e neonatali per cui si ritiene essere un fattore di crescita fetale Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 42
43 Fibroblast Growth Factors (FGFs) Sono proteine che legano l eparina e regolano il processo di proliferazione, differenziamento e migrazione; giocano un ruolo fondamentale nella riparazione dello scheletro, nella neovascolarizzazione e nella crescita tumorale Sono state individuate finora 17 proteine di questa famiglia IGF1 e IGF2 promuovono la crescita ossea attraverso un meccanismo d azione che coinvolge 4 recettori di membrana (FGFR1, FGFR2, FGFR3 e FGFR4) Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 43
44 Transforming Growth Factor- (TGF- ) Sono noti 5 TGF isoformi. Sono tra le proteine più importanti tra quelle prodotte dagli osteoblasti Sono omodimeri in cui le due catene di massa molecolare pari a Da sono collegate da un ponte a disolfuro Le TGF regolano l espressione di più geni associati all attività dell osteoblasto. Il complesso meccanismo d azione prevede nella fase iniziale il legame del TGF ad un recettore di membrana di tipo II, quindi ad un recettore di tipo I, seguito da fosforilazione del complesso trimerico Alla famiglia appartengono le proteine morfogenetiche dell osso note come BMPs Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 44
45 Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) Fino ad oggi sono state individuate 40 proteine appartenenti alla famiglia delle BMP Queste proteine sono state suddivise in sottogruppi in base alla somiglianza della sequenza e a caratteristiche strutturali comuni Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 45
46 Le BMPs possiedono ruoli chiave nella regolazione della crescita, della differenziazione e dell apoptosi di vari tipi di cellule che includono gli osteoblasti, i condroblasti, le cellule neurali ed epiteliali Le BMPs giocano ruoli rilevanti durante gli stadi precoci dello sviluppo embrionale sia nei vertebrati che nei non vertebrati Le BMPs si sono dimostrate attive nei complessi processi multistadio che portano alla formazione di cartilagine ed osso in vivo e sono coinvolte nell attività di molti fattori di crescita ed ormoni Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 46
47 La proteina BMP-2 è uno dei membri più rappresentativi della famiglia delle BMPs BMP-2 è fermamente attaccata alla matrice ossea assieme ad altre BMPs La proteina BMP-2 induce la formazione e la riparazione di tessuto osseo in animali adulti BMP-2 promuove la differenziazione di cellule condriogeniche ed osteogeniche in differenti sistemi cellulari in vitro Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 47
48 BMP-2 può essere estratta dopo demineralizzazione dell osso Da un chilogrammo di ossa di ratto possono essere ricavati solo pochi microgrammi di proteina attiva Più di una tonnellata di ossa bovine devono essere trattate per isolare pochi microgrammi di frazioni con attività osteogenica tramite cromatografia di affinità (eparina) Biomateriali e Tessuti Biologici Laurea Magistrale in Bioingegneria e Ingegneria Clinica 48
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