I FARMACI ANTIMICROBICI:

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1 I FARMACI ANTIMICROBICI: C.d.L. in Tecniche di Fisiopatologia Cardiocircolatoria e Perfusione Cardiovascolare Dott.ssa Arianna POMPILIO Università G. d Annunzio di Chieti-Pescara Anno Accademico

2 La storia degli antibiotici ha inizio nel 1928, quando Fleming, studiando varianti dello stafilococco, osservò che una muffa che contaminava una delle sue culture aveva inibito intorno a sé la crescita dello stafilococco. Inoltre, Fleming potè osservare che il brodo di coltura in cui erano cresciuti i funghi possedeva un potente effetto inibitorio nei confronti di molti microrganismi. Poiché la muffa apparteneva al genere Penicillum, Fleming chiamò questa sostanza antibatterica PENICILLINA

3 AGENTE ANTIBATTERICO Composto in grado di interferire con la crescita e la moltiplicazione batterica; contrariamente al disinfettante, è attivo solo verso batteri metabolicamente attivi. ANTIBIOTICO CHEMIOTERAPICO Molecola naturale a basso P.M., prodotta dal metabolismo di un microrganismo: Actinomiceti (Streptomyces), Miceti (Penicillium, Cephalosporium), in grado di inibire la crescita di altri microrganismi e/o causarne la distruzione. Farmaco ad attività antibatterica prodotto per sintesi chimica (analogo strutturale di un antibiotico)

4 ADEGUATA ATTIVITA ANTIMICROBICA SCARSA o NULLA ATTIVITA sulla FLORA COMMENSALE e sui MECCANISMI di DIFESA dell OSPITE TOSSICITA SELETTIVA ATTIVO a BASSE CONCENTRAZIONI STABILE, ECONOMICO, facilmente SOMMINISTRABILE RAGGIUNGE ADEGUATE CONCENTRAZIONI TISSUTALI ASSENZA di EFFETTI COLLATERALI e/o SISTEMICI ASSENZA di RESISTENZE nella POPOLAZIONE MICROBICA

5 Paul Ehrlich La chemioterapia antibatterica si basa sul principio della TOSSICITÀ SELETTIVA, formulato per la prima volta da Paul Ehrlich, in base al quale una sostanza può essere utilizzata nella terapia di una malattia infettiva solo se è nociva per il microrganismo e relativamente innocua per le cellule dell ospite. ANTIBIOTICI SELETTIVI Agiscono solo su strutture e vie metaboliche peculiari dei batteri (es: parete cellulare, DNA girasi e topoisomerasi IV) Impossibili gli effetti sulle cellule dell ospite Penicilline, Cefalosporine, Monobattami, Penemici, Carbapenemici. Fosfomicina, Glicopeptidi, Daptomicina. ANTIBIOTICI non SELETTIVI Agiscono con meccanismi diversi verso strutture e meccanismi non esclusivi dei batteri Potenziali effetti dannosi Aminoglucosidi, Macrolidi, Lincosamidi, Linezolid, Tetracicline, Cloramfenicolo, Metronidazolo, Rifamicine,Sulfamidici,Tri metoprimtigeciclina

6 Esistono diversi sistemi di classificazione degli antibiotici, in considerazione del notevole numero di molecole utilizzate nella pratica clinica. In particolare, la classificazione può essere fatta: 1. In FAMIGLIE Molecole che presentano caratteristiche simili (es. PENICILLINE, CEFALOSPORINE,AMINOGLICOSIDI, TETRACICLINE, ecc) 2. Secondo l ORIGINE ESTRATTIVA: da batteri e funghi (Penicillium, Cephalosporium, Streptomyces) SEMISINTETICA: partendo da una struttura base, ottenuta per fermentazione ed aggiungendo catene di sintesi. SINTESI CHIMICA: molti composti si ottengono per sintesi chimica (chinoloni, monobattami,cloramfenicolo, ecc)

7 3. Secondo lo SPETTRO d AZIONE Per spettro d azione si intende il ventaglio delle specie batteriche nei riguardi delle quali l antibiotico mostra attività AMPIO SPETTRO: Gram-positivi e Gram-negativi (es. tetracicline) SPETTRO RISTRETTO: attivo soltanto su una limitata varietà di microrganismi (es. penicillina) 4. Secondo il TIPO d AZIONE (natura dell inibizione) F. BATTERIOSTATICO: inibisce la crescita del microrganismo, consentendo lo sviluppo della risposta immunitaria anticorpale F. BATTERICIDA: provoca la morte dell agente infettivo 5. In base al MECCANISMO d AZIONE

8 1. INIBIZIONE della SINTESI della PARETE CELLULARE 2. ALTERAZIONE della MEMBRANA CITOPLASMATICA 3. INIBIZIONE della SINTESI PROTEICA 4. INIBIZIONE della SINTESI degli ACIDI NUCLEICI 5. ANTIMETABOLITI

9 1. INIBIZIONE della SINTESI della PARETE CELLULARE Agiscono bloccando gli enzimi che regolano la sintesi di peptidoglicano con conseguente lisi cellulare. BATTERICIDI, l inibizione si può verificare: nella 1 FASE di SINTESI (es: FOSFOMICINA inibisce la fosfoenolpiruvato transferasi o CICLOSERINA per mancata utilizzazione della alanina) nella 2 FASE di SINTESI (es: BACITACINA agisce mediante trasferimento e polimerizzazione del mucopeptide parietale) A LIVELLO TERMINALE (es: VANCOMICINA, PENICILLINE e CEFALOSPORINE agiscono nella fase di transpeptidazione) 2. ALTERAZIONE della MEMBRANA CITOPLASMATICA Si tratta di farmaci BATTERICIDI. Provocano alterazioni della membrana citoplasmatica con perdita della permeabilità con meccanismo d azione poco selettivo. Ciò spiega la tossicità di questi farmaci e l uso limitato (es: POLIMIXINA, COLISTINA, DAPTOMICINA)

10 3. INIBIZIONE della SINTESI PROTEICA Agiscono a livello ribosomiale e l inibizione si può verificare: A livello della SUBUNITA RIBOSOMIALE 30S (es: AMINOGLICOSIDI, TETRACICLINE) A livello della SUBUNITA RIBOSOMIALE 50S (es: CLORAMFENICOLO, MACROLIDI) Attività BATTERICIDA, azione selettiva dovuta al fatto che i ribosomi delle cellule eucariote sono costituiti da subunità 60S e 40S. Per agire devono penetrare nella cellula. 4. INIBIZIONE della SINTESI degli ACIDI NUCLEICI Si tratta di farmaci BATTERICIDI. Agiscono inattivando gli enzimi con un meccanismo d azione non selettivo eccetto per i chinoloni: INIBIZIONE della RNA-polimerasi (es: RIFAMICINE) INIBIZIONE della DNA-girasi o topoisomerasi (es: CHINOLONI)

11 5. ANTIMETABOLITI Si tratta di farmaci BATTERIOSTATICI. Agiscono inibendo la sintesi dell ACIDO FOLICO (es: SULFAMIDICI, TRIMETHOPRIM)

12 BATTERICIDI BATTERIOSTATICI NOTE Penicilline Tetracicline Alcuni batteriostatici Cefalosporine Cloramfenicolo possono essere battericidi in vitro ad Monobattami Macrolidi elevate concentrazioni Penemici Lincosamidi che sono però Carbapenemici Acido fusidico irraggiungibili in vivo. COTRIMOSSAZOLO è Aminoglucosidi Sulfamidici battericida anche se Chinoloni Trimetoprim trimethoprim e Glicopeptidi Linezolid sulfametossazolo impiegati Rifamicine Tigeciclina separatamente sono Fosfomicina batteriostatici Cotrimossazolo Colistina Metronidazolo Daptomicina

13 BERSAGLI DEGLI ANTIBIOTICI SINTESI PARETE CICLOSERINE FOSFOMICINA GLICOPEPTIDI BACITRACINA PENICILLINE CEFALOSPORINE DNA THF MONOBATTAMI CARBAPENEMI 50 METABOLISMO ACIDO FOLICO SULFAMIDICI TRIMETOPRIM PABA MEMBRANA POLIMIXINE DNA POLIMERASI NOVOBIOCINA DHF SINTESI PROTEICA trna MUPIROCINA PUROMICINA DNA GIRASI TOPOISOMERASI CHINOLONI mrna RNA POLIMERASI RIFAMPICINA SINTESI PROTEICA Inibitori 50S MACROLIDI CLORAMFENICOLO LINCOSAMIDI SINTESI PROTEICA Inibitori 30S TETRACICLINE SPECTINOMICINA STREPTOMICINA AMINOGLICOSIDI NITROFURANI

14 Poiché il peptidoglicano della parete cellulare batterica non è presente nelle cellule umane, esso rappresenta un bersaglio ideale per l antibiotico terapia. La sintesi del peptidoglicano può essere suddivisa in 3 tappe: SINTESI DEI PRECURSORI NEL CITOPLASMA D-cicloserina Fosfomicina TRASPORTO DEI PRECURSORI ATTRAVERSO LA MEMBRANA CITOPLASMATICA Bacitracina INSERIMENTO DEI PRECURSORI NELLA PARETE CELLULARE Vancomicina, ristocetina Antibiotici β-lattamici

15 La prima tappa avviene nel citoplasma, dove vengono sintetizzate le unità fondamentali della struttura portante del peptidoglicano NAG e NAM. La D-CICLOSERINA è un analogo strutturale della D-alanina. Essa inibisce in maniera competitiva due enzimi coinvolti nella formazione del dipeptide D-alanil-D-alanina: la racemasi che converte la L-alanina nel suo stereoisomero D, e la sintetasi che catalizza la formazione del legame peptidico tra le due molecole D-alanina La FOSFOMICINA è un analogo strutturale del fosfo-enolpiruvato. Impedisce la sintesi dell acido N- acetil-muramico, legandosi covalentemente al sito attivo dell enzima piruvato-udp-nag trasferasi. fosfomicina

16 La cicloserina è una molecola ciclica La stabile struttura dell anello favorisce il legame alla racemasi e alla sintetasi, preferenzialmente rispetto ai substrati naturali. Ciò risulta in una inibizione competitiva di questi enzimi. La cicloserina è neurotossica e non viene usata clinicamente, eccetto per il trattamento delle infezioni da Mycobacterium tuberculosis resistenti agli altri farmaci. Struttura chimica della D-cicloserina e dell analogo D-alanina

17 La reazione di condensazione tra UDP-N-acetilglucosamina e fosfoenolpiruvato negli stadi iniziali della sintesi del peptidoglicano rappresenta il target d azione della fosfomicina. La rapida insorgenza di resistenza la rendono praticamente inutile in clinica. Struttura chimica della fosfomicina

18 La seconda tappa della sintesi del peptidoglicano avviene sulla superficie interna della membrana citoplasmatica dove l N-acetilmuramilpeptide viene legato da un trasportatore lipidico che trasloca la subunità completa all esterno della membrana citoplasmatica La BACITRACINA inibisce la defosforilazione del trasportatore lipidico legandosi al bactoprenolodifosfato e bloccando la rigenerazione del bactoprenolo-monofosfato. E un polipeptide ciclico tossico per l uso clinico umano. Viene usato per trattamenti topici e come additivo alimentare per ruminanti al fine di ridurre la produzione di metanolo nel rumine.

19 La terza tappa avviene nel contesto del peptidoglicano e nello spazio periplasmico (Gram-), dove l unità basale, liberata dal legame del trasportatore lipidico, si unisce all estremità in accrescimento di una catena di peptidoglicano (transpeptidazione). Molti antibiotici agiscono su questa tappa. La VANCOMICINA e la RISTOCETINA sono glicopeptidi che si legano all estremità D-alanina-Dalanina del pentapeptide legato al bactoprenolo ed impediscono l azione della transpeptidasi sequestrandone il substrato.

20 Gli antimicrobici più comuni sono i -lattamici, accomunati dalla presenza di un anello tetratomico azetidinico -lattamico: PENICILLINE CEFALOSPORINE ALTRI -LATTAMICI: Acido clavulanico, tienamicina, sulbactam Moxalactam Monobattamici (aztreonam) Gli antibiotici β-lattamici sono analoghi strutturali del dipeptide D-alanina- D-alanina che devono la loro azione antibatterica proprio alla capacità di legarsi ad una serie di enzimi che catalizzano le operazioni terminali di polimerizzazione, transpeptidazione ed inserimento delle unità peptidoglicaniche nella parete cellulare, inibendo quindi la sintesi del peptidoglicano stesso.

21 L evento finale dell azione degli antibiotici β-lattamici è la lisi della cellula batterica. Target principale: PARETE CELLULARE BATTERICA (tox selettiva) ATTIVITÀ BATTERICIDA SU CELLULE IN ATTIVA DIVISIONE INIBISCONO LA FASE FINALE DI POLIMERIZZAZIONE Arresto della crescita FORMAZIONE dello SFEROPLASTO e LISI CELLULARE: Produzione di peptidoglicano lasso Induzione di enzimi endogeni batterici (mureina-idrolasi)

22 Interazione con proteine enzimatiche responsabili del processamento terminale del peptidoglicano (transpeptidasi, endopeptidasi e carbossipeptidasi) dette PENICILLIN BINDING PROTEINS PBP a livello della m. citoplasmatica PBP PORINA LPS Spazio Periplasmico GRAM + GRAM -

23 Prodotte da Penicillium chrysogenum Nucleo fondamentale: acido 6-amino-penicillanico Possono essere classificate in: NATURALI Benzil-penicillina (penicillina G) attiva verso cocchi Gram+ e Gram- SEMI-SINTETICHE Meticillina/oxacillina resistenti a β-lattamasi Ampicillina/amoxicillina (ad ampio spettro) Carbenicillina/ticarcillina/piperacillina (attive su specie resistenti alle altre penicilline)

24 Si differenziano dalle penicilline per uno spettro d azione esteso ai Gram-negativi (capacità di penetrare la m. esterna) e per la resistenza nei confronti di alcune -lattamasi Possono essere classificate in: NATURALI Cefalosporina C (prodotta dal fungo marino Cephalosporium achremonium) SEMI-SINTETICHE I GENERAZIONE (cefazolina): attive vs Gram+ II GENERAZIONE (cefuroxime): attive vs Gram- III GENERAZIONE (cefotaxime): ampio spettro (Gram+ e Gram-) IV GENERAZIONE (cefepime): ampio spettro CEFAMICINE Naturali: prodotte da streptomiceti, esteso spettro d azione (soprattutto vs anaerobi)

25 a. 6-aminopenicillanico H 2 N PENICILLINE O Generalmente attive su Gram + aerobi ed anaerobi: N S Batteriemia, setticemia, faringite, otite media (S. aureus ed epidermidis) Meningite, polmonite (S. pneumoniae) Attive su alcuni Gram -: UTI ( Proteus, E. coli) CH 3 CH 3 COOH Gastroenteriti (Salmonella, Shigella) H 2 N O CEFALOSPORINE S COOH a. 7-aminocefalosporanico CH 2 O CO CH 3 Spettro esteso anche ai Gram -: Meningiti (Haemophilus influenzae tipo B, S. pneumoniae, Neisseria meningitidis) Resistenza alle β-lattamasi attive sulle penicilline Maggiore penetrazione attraverso la membrana esterna

26 Le β-lattamasi sono enzimi in grado di DEGRADARE gli antibiotici β-lattamici La loro produzione, ampiamente diffusa nel mondo microbico, rappresenta il principale meccanismo con HC CH cui i batteri si difendono da questi antibiotici. L inattivazione dei -lattamici da parte delle - lattamasi è dovuta all idrolisi dell anello -lattamico C (il legame CO=N è spezzato dall enzima con O N conseguente produzione di A. penicilloico inattivo). Le -lattamasi sono enzimi secreti che svolgono la anello -lattamico loro funzione all esterno della membrana plasmatica. La produzione di -lattamasi è in alcuni casi costitutiva mentre in altri risulta indotta in presenza di certi substrati -lattamici. La specificità di substrato di alcuni di questi enzimi è relativamente ristretta, per questo motivo alcuni di questi enzimi sono spesso definiti penicillinasi o cefalosporinasi.

27 Alcune molecole sono in grado di legarsi alle β-lattamasi inattivandole e prevenendo, così la distruzione degli antibiotici β-lattamici. ACIDO CLAVULANICO, SULBACTAM Derivato strutturale dell acido 6-aminopenicillanico (sostituzione dello S con O). Modesta azione antibatterica ma notevole potere inibente su numerose -lattamasi Azione protettiva nei confronti delle - lattamasi (in combinazione con penicilline) MONOBATTAMICI (aztreonam) Antibiotici monociclici prodotti da Chromobacterium violaceum. Rilevante attività vs Gram-negativi (anaerobi esclusi), spiccata resistenza alle -lattamasi. sulbactam R-CO-NH R2 N O SO 2 H MONOBATTAMI (solo Gram-)

28 POLIMIXINE (Polimixina B, Colistina) Gruppo di antibiotici formati da polipeptidi ciclici, legati ad un polipeptide lineare terminante con un acido grasso. Prodotti da Bacillus polymyxa. Attivi solo nei confronti dei Gram- alla cui m. esterna si legano specificamente (fosfolipidi) distruggendone le proprietà osmotiche, alterandone la permeabilità e provocando la fuoriuscita di metaboliti intracellulari. MECCANISMO D AZIONE: Sono detergenti cationici, agiscono in maniera analoga ai disinfettanti, rimpiazzando competitivamente gli ioni Mg2+ e Ca2+ dei gruppi fosfato delle m. lipidiche provocando la distruzione delle membrane. Sono attive anche nei confronti di batteri non metabolizzanti. Sono tossiche anche per le cellule eucariotiche (trattamenti topici).

29 La selettività dell azione di questi antibiotici risiede nelle sostanziali differenze esistenti tra i ribosomi procariotici ed eucariotici e nel processo di sintesi proteica Poiché i ribosomi batterici sono significativamente diversi dai ribosomi delle cellule eucariotiche, tutti gli antibiotici che interagiscono con le subunità ribosomiali sono abbastanza selettivi per poter essere impiegati nella terapia antibatterica.

30 Prodotte da Streptomyces, Micromonospora Possono essere classificate in: NATURALI Streptomicina, Neomicina, Kanamicina, Gentamicina, Tobramicina, Sisomicina SEMI-SINTETICI Amikacina, netilmicina Streptomicina SPETTRO d AZIONE ESTESO: Inattivi nei confronti degli anaerobi Gram+ e Gram- (infezioni gravi da P. aeruginosa, Enterobacter spp) TOSSICITA : Nefrotossicità Ototossicità Blocco neuromuscolare

31 1. Penetrazione dell ANTIBIOTICO nella cellula dove si lega irreversibilmente alla subunità 30S, con formazione di un prodotto proteico anomalo (non funzionale) UNA PICCOLA % ENTRA NELLA CELLULA 2. Parte della proteina anomala viene inserita a membrana generando dei pori che favoriscono l ingresso di ulteriori quantità di antibiotico AAA AAA mrna Elevate concentrazioni dell antibiotico impediscono il legame all m-rna di tutti i ribosomi, causando il blocco di sintesi proteica 4. Induzione di errori nella lettura dei codoni di RNA-m BLOCCO DELLA SINTESI PROTEICA E BATTERICIDIA PROTEINE ALTERATE NELLA MEMBRANA CAUSANO AUMENTATO AFFLUSSO DELL ANTIBIOTICO

32 Gruppo di antibiotici prodotti da Streptomyces spp, caratterizzati da una struttura molecolare tetraciclica. MECCANISMO d AZIONE Attività batteriostatica Blocco della sintesi proteica in una fase molto iniziale: si legano reversibilmente alla subunità 30S inibendo l attacco dell aminoacil-trna a livello del codone di inizio e bloccando la formazione del polisoma. SPETTRO d AZIONE ESTESO: Gram+ (acne), Gram- (infezioni vie aeree) Ricketsie (trattamento di elezione) Clamidie (trattamento di elezione) Spirochete ed alcuni protozoi TOSSICITA : Superinfezioni (eliminazione flora commensale) Colorazione dei denti in via di sviluppo R4 R3 R2 R1 N(CH 3 ) 2 OH = O OH OH O = OH CONH 2 Struttura base delle Tetracicline

33 MACROLIDI (Eritromicina, Claritromicina, roxitromicina, azitomicina..) Gruppo di antibiotici caratterizzati da un nucleo lattonico macrociclico, prodotti da Streptomyces. MECCANISMO D AZIONE: attività batteriostatica Inibiscono la sintesi proteica legandosi reversibilmente alla subunità 50S ed inibendo la traslocazione SPETTRO d AZIONE: Poco più ampio di quello delle penicilline (include anche alcuni gram-) Infezioni da patogeni intracellulari: Chlamydia Campylobacter Mycobacterium spp. Polmonite da Mycoplasma pneumoniae Legionellosi Eritomicina

34 CLORAMFENICOLO Prodotto da Streptomyces venezuelae. MECCANISMO D AZIONE: attività batteriostatica Blocca la reazione di transpeptidazione e di allungamento della catena polipeptidica (impedisce il legame tra l aminoacil-trna e il ribosoma). Conseguentemente, si assiste al blocco della sintesi proteica. SPETTRO d AZIONE ESTESO: Gram+ e Gram- (da utilizzare solo in infezioni gravi) TOSSICITA Effetti secondari negativi a livello del sistema ematopoietico Cloramfenicolo LINCOSAMIDI clindamicina lincomicina Antibiotici batteriostatici con un meccanismo e spettro d azione simile ai macrolidi, pur avendo una struttura chimica diversa. Clindamicina è particolarmente attiva vs gli anaerobi obbligati.

35 Il gruppo più importante di antibiotici che agiscono bloccando la sintesi del DNA è quello dei chinoloni. CHINOLONI (a. nalidixico, ofloxacina, ciprofloxacina, levofloxacina, a. pipemidico ) Chinoloni Composti di sintesi aventi come struttura base la 4-oxo-1,4 diidrochinolina MECCANISMO D AZIONE: attività battericida Agiscono bloccando la subunità A della DNA-girasi (enzima responsabile della despiralizzazione del DNA, necessaria per la sua replicazione e trascrizione). L inattivazione dell enzima è seguita dal blocco della neosintesi del DNA e morte del batterio. SPETTRO d AZIONE ESTESO: Cocchi Gram+ ed infezioni delle vie urinarie TOSSICITA SELETTIVA Differente struttura enzimatica tra procarioti ed eucarioti

36 Le rifamicine sono un gruppo di antibiotici isolati in Italia, dalle colture di Nocardia mediterranea RIFAMPICINA Rifampicina Derivato semi-sintetico MECCANISMO D AZIONE: Agisce legandosi direttamente alla subunità β dell RNA polimerasi batterica che rende non funzionale. SPETTRO d AZIONE: attività battericida Gram+ e Gram- ed in particolare nei confronti del micobatterio tubercolare per le cui infezioni rappresenta uno dei farmaci di elezione. TOSSICITA SELETTIVA differenze nella struttura della RNA-polimerasi batterica rispetto a quella eucariotica

37 Prodotti chimici di sintesi strutturalmente simili a metaboliti essenziali dei batteri : una volta assorbiti bloccano importanti processi biosintetici.

38 I sulfamidici sono stati i primi chemioterapici usati per inibire la crescita batterica. Il sulfamidico più semplice è la sulfanilamide ma vi sono numerosi derivati sintetici ottenuti mediante sostituzioni SULFAMIDICI Sulfanilamide MECCANISMO D AZIONE: Agiscono come analoghi strutturali dell acido p-aminobenzoico (PABA). Competono con il PABA legandosi al sito attivo dell enzima DHPS (diidropteroatosintetasi) bloccando la sintesi dell acido folico (coenzima essenziale per la moltiplicazione batterica), precursore degli a. nucleici. SPETTRO d AZIONE ESTESO: attività batteriostatica Gram+ e Gram-; usati primariamente nelle UTI e nelle infezioni da Nocardia TOSSICITA SELETTIVA via biosintetica dei folati presente nei soli batteri che sono in grado di sintetizzare acido folico, ma non contro gli organismi superiori, che devono procurarselo con la dieta.

39 TRIMETHOPRIM Trimethoprim Analogo dell acido diidrofolico MECCANISMO D AZIONE: Agisce legandosi all enzima diidrofolato riduttasi (DHFR), catalizzante la reazione che trasforma il diidrofolato in tetraidrofolato, cofattore richiesto per la sintesi delle purine, della timina, e di alcuni aminoacidi. SPETTRO d AZIONE ESTESO: attività batteriostatica Gram+ e Gram-; usati primariamente nelle UTI e nelle infezioni da Nocardia TOSSICITA SELETTIVA Via metabolica comune sia ai procarioti che eucarioti, tuttavia l enzima batterico mostra maggiore affinità per il trimethoprim. TERAPIA COMBINATORIA (Trimethoprim-sulfametossazolo) Usato in combinazione con il sulfametossazolo inibisce due fasi metaboliche sequenziali della sintesi di acido tetraidrofolico: il sulfametossazolo si sostituisce al PABA nell acido folico, il trimethoprim impedisce la formazione di acido tetraidrofolico, prevenendo l emergenza di ceppi resistenti.

40 LA VALUTAZIONE DELL ANTIBIOTICO-RESISTENZA: C.d.L. in Tecniche di Fisiopatologia Cardiocircolatoria e Perfusione Cardiovascolare Dott.ssa Arianna POMPILIO Università G. d Annunzio di Chieti-Pescara Anno Accademico

41 Uno stipite batterico è resistente ad un farmaco quando: è in grado di moltiplicarsi in presenza di concentrazioni di farmaco che risultano inibitorie per la massima parte degli stipiti della stessa specie è in grado di moltiplicarsi in presenza di concentrazioni del farmaco pari a quelle massime raggiungibili nel corso dell impiego terapeutico. L antibiotico resistenza è una proprietà geneticamente trasmissibile del microrganismo. Essa può essere:

42 NATURALE o INTRINSECA Condizione di generale insensibilità ad un farmaco che si estende a tutti gli stipiti di una data specie. Al microrganismo può mancare la struttura su cui agisce l antibiotico (es: Gram vs penicilline; Clamidie e Micoplasmi sono privi della parete cellulare e quindi insensibili ai β-lattamici) La struttura della parete cellulare o la membrana citoplasmatica di un microrganismo possono essere impermeabili ad un antibiotico. ACQUISITA Generalmente selezionata da una precedente esposizione del patogeno all'antibiotico. Si attua secondo diversi meccanismi di cui i principali sono: modifica del target batterico produzione da parte del batterio di enzimi inattivanti l antibiotico ridotta permeabilità all'antibiotico efflusso dell'antibiotico dalla cellula grazie ad un sistema di pompe attive (che richiedono E).

43 Significato clinico della resistenza I ceppi resistenti sopravvivono in presenza di concentrazioni raggiunte in vivo a livello sierico dall antibiotico in seguito a somministrazione di normali dosi terapeutiche. La resistenza predice il possibile fallimento della terapia antibiotica. Antibiotico-resistenza: il problema medico Meticillino-resistenza negli stafilococchi ( decessi/anno negli USA) Circa il 50% delle infezioni nosocomiali è resistente ad almeno 1 antibiotico Esito infausto per il 90% dei pazienti affetti da tubercolosi multi-resistente

44 L abuso (uso non corretto) ha aumentato l incidenza e la selezione delle mutazioni inducenti resistenza: Profilassi in chirurgia Uso empirico (agente eziologico ignoto) Aumentato uso di antibiotici a spettro esteso Antibiotici (probiotici) nei mangimi animali Uso pediatrico per infezioni virali Scarsa compliance del paziente

45 L esame batteriologico consente l identificazione dell agente etiologico, così permettendo la scelta del farmaco antibatterico adatto. Ogni antibiotico o chemioterapico possiede uno spettro d azione antibatterico in base al quale è possibile prevedere in quali infezioni il suo impiego può essere efficace. Questa previsione, naturalmente, è possibile automaticamente solo nel caso di infezioni sostenute da batteri uniformemente e costantemente sensibili a determinati antibiotici (Haemophilus influenzae, Salmonella, spirochete )

46 Quando invece l esame batteriologico mette in evidenza la presenza di: specie batteriche che sappiamo costituite da stipiti diversamente sensibili ai vari medicamenti (Pseudomonas, streptococchi viridanti, enterococchi, enterobatteri del gruppo dei coliformi o dei Proteus) specie che facilmente danno luogo alla comparsa di MUTANTI antibiotico-resistenti (stafilococchi, micobatteri) è necessario completare l identificazione dei batteri presenti in un dato materiale con lo studio della loro SENSIBILITA ai diversi antibiotici.

47 L ANTIBIOGRAMMA è il test impiegato per determinare l efficacia antimicrobica di un farmaco nei confronti di specifici patogeni. E uno dei test più importanti che viene comunemente eseguito nel laboratorio di microbiologia clinica a causa delle sue implicazioni terapeutiche immediate. Nella pratica clinica questo tipo di test, essenziale per una corretta terapia, permette di: 1) evidenziare quali siano i farmaci più efficaci nei confronti di un certo microrganismo patogeno 2) fornisce una stima della dose terapeutica più opportuna per la cura della malattia infettiva.

48 Vengono effettuati in vitro, e misurano la risposta (crescita) di un microrganismo isolato nei confronti di uno o più antibiotici. Sono eseguiti in condizioni standardizzate (la realizzazione tecnica deve rispondere a criteri perfettamente standardizzati periodicamente aggiornati da diversi comitati Nazionali, CLSI ecc.) per garantirne la riproducibilità dei risultati. I risultati di questi tests debbono essere usati per guidare la scelta dell antibiotico da adottare, alla quale contribuiscono anche le informazioni cliniche e l esperienza professionale. Obiettivo dei tests per la determinazione della antibiotico-s è: predire il successo od il fallimento in vivo della terapia antibiotica.

49 ISOLARE il MICRORGANISMO RESPONSABILE dell INFEZIONE IDENTIFICARE IL MICRORGANISMO a LIVELLO di SPECIE ESPRIMERE la SENSIBILITA BATTERICA secondo i CRITERI ORIENTATI alla TERAPIA SELEZIONARE un APPROPRIATA BATTERIA di ANTIBIOTICI da SAGGIARE

50 Un antibiogramma è INUTILE Quando il microrganismo isolato non può essere ragionevolmente considerato responsabile di una infezione nel sito in cui il campione è stato prelevato (FLORA COMMENSALE o CONTAMINANTE: Streptococchi orali o H. parainfluenzae isolati da secrezioni bronchiali) o quando il n di CFU/ml è inferiore alla soglia significativa (nelle urine o nelle secrezioni bronchiali). Quando il patogeno isolato appartiene ad una specie che è costantemente SENSIBILE ad un trattamento standard, o per la quale non esiste una correlazione fra l attività in vitro ed in vivo. In quelle infezioni cutanee dove è indicato un trattamento topico o chirurgico.

51 Un antibiogramma è UTILE EMOCOLTURA: l antibiogramma deve essere eseguito tempestivamente nei campioni positivi LIQUOR TRATTO RESPIRATORIO SUPERIORE ed INFERIORE: espettorato, lavaggio bronco-alveolare (BAL) CAMPIONI da OSSA o ARTICOLAZIONI, URINA da CATETERE, FLUIDI da PUNTURA: quando si sospetti un eziologia batterica INFEZIONI OSPEDALIERE ACCERTATE: anche per obiettivi epidemiologici

52 Il metodo più corretto per determinare l efficacia di un antibiotico nei confronti di un microrganismo consiste nello stabilire, per ogni farmaco antibatterico: la concentrazione minima inibente (MIC) la concentrazione minima battericida (MBC). Questo metodo permette di stabilire una scala di attività dell antibiotico per diverse specie batteriche.

53 MIC (Minimal Inhibitory Concentration): è una misura quantitativa dell attività di un antibiotico verso un determinato batterio. Definita come la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica visibile. MBC CLSI (Minimal Bactericidal Concentration): è definita come la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica di almeno il 99,9% (1 germe su elude l azione antibiotica) della popolazione iniziale. (Clinical and Laboratory Standard Institute): pubblica i criteri per l interpretazione dei risultati dei tests di sensibilità (categorie interpretative).

54 Le categorie interpretative (Sensibilità, Sensibilità Intermedia e Resistenza) sono individuate da valori di MIC detti BREAKPOINTS (soglia, limite). I valori standard di sensibilità variano per ciascun microrganismo e sono basati sulla concentrazione plasmatica di farmaco che può essere raggiunta senza la comparsa di effetti tossici.

55 I BREAKPOINTS consentono di classificare il microrganismo in: S I R quando l infezione causata da quel ceppo può essere adeguatamente trattata con il dosaggio di un agente antimicrobico comunemente raccomandato per quel tipo di infezione. quando la crescita batterica è inibita solo al dosaggio massimo raccomandato; gli isolati batterici mostrano MIC corrispondenti a livelli sierici e tessutali di antibiotico per i quali l efficacia potrebbe essere più bassa di quella registrata per gli isolati sensibili. questa categoria predice il possibile fallimento dell antibiotico testato. L'antibiotico dovrebbe essere utilizzato a dosaggi che risulterebbero tossici nell'organismo in quanto i ceppi non sono inibiti alle concentrazioni sistemiche di antimicrobico raggiungibili di solito con i normali dosaggi.

56 I breakpoints per la categorizzazione (S, I, R) vengono individuati dalla CLSI (già NCCLS) e determinati sulla base della: FARMACOCINETICA e FARMACODINAMICA degli ANTIBIOTICI (livelli raggiunti in vivo nel sangue e tessuti dall antibiotico) ATTIVITA CLINICA mediante correlazione tra risultati in vitro (MIC) e risultati in vivo (risoluzione del caso clinico).

57 1.BRODO DILUIZIONE (micro- e macrometodo) 2.DIFFUSIONE IN AGAR (Kirby-Bauer) Metodi per diffusione Metodi per diluizione Determinazione della MIC Antibiogramma Str Tet Ery k Chl Amp MIC = MINIMA CONCENTRAZIONE INIBENTE

58 Nei test di antibiotico-sensibilità mediante diluizione la sensibilità del microrganismo viene valutata in base alla sua crescita o meno in un terreno di coltura (solido o liquido) contenente diverse concentrazioni dell'antibiotico. VANTAGGI Metodo quantitativo (consente di determinare accuratamente oltre alla MIC anche la MBC). Metodo valido e preciso (RIPRODUCIBILE) SVANTAGGI Costoso Laborioso (allestimento pannelli antibiotizzati), per cui l'impiego è limitato a pochi casi: trattamenti di affezioni molto serie in cui sia necessario valutare la MBC (endocarditi batteriche o osteomieliti); valutazione sensibilità di microrganismi a lenta crescita (micobatteri e actinomiceti)

59 Preparare una serie di provette contenenti terreno con diverse concentrazioni di antibiotico, ed inocularle con quantità convenzionali (5 x 10 5 cfu/ml) dell organismo da testare. Incubare le provette (37 C, 16-20h) La MIC è data dalla concentrazione più bassa di antibiotico che porta ad assenza di crescita dopo ore di incubazione.

60 E invece possibile calcolare la MBC se le provette che non presentano crescita sono sottoposte a subcultura in terreno fresco privo di antibiotico: la concentrazione più bassa di antibiotico alla quale il microrganismo non è in grado di crescere quando viene trasferito in terreno fresco equivale alla MBC.

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62 Il micrometodo in pozzetti è sostanzialmente identico al metodo delle diluizioni in provetta. Le MIC vengono determinate in microtiter 96/wells fondo ad U valutando l intorbidimento del brodo o la formazione di sedimento sul fondo dei pozzetti.

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64 ANTIBIOTICO S I R PIPERACILLINA CEFAZOLINA CEFOTAXIME CEFPODOXIME IMIPENEM VANCOMICINA GENTAMICINA S = Sensibilità, I = Sensibilità Intermedia, R = Resistenza

65 È un metodo quali-quantitativo, semplice, rapido ed economico, valido per microrganismi aerobi a crescita rapida. Attualmente il test di diffusione su dischetto più utilizzato è il metodo di Kirby-Bauer, sviluppato agli inizi degli anni 60. VANTAGGI Tecnica standardizzata (CLSI) Flessibilità nella scelta degli antibiotici Facilità di esecuzione Economicità Correlazione tra risultati in vitro (antibiogramma) e risoluzione clinica (risultati in vivo) SVANTAGGI Impossibilità di totale automatizzazione Produce risultati qualitativi (categorie di sensibilità)

66 Si effettua applicando sulla superficie della piastra in cui è stata precedentemente seminata una brodocoltura batterica dei dischetti di carta da filtro sterili perfettamente aderenti contenenti una concentrazione nota e standard di antibiotico. L antibiotico presente sul disco diffonde in rapporto alla diffusibilità in terreno di coltura 1. Allestimento brodocoltura da coltura pura 2. Semina brodocoltura 3. Apposizione dischetti antibiotizzati 4. Incubazione (37 C, 18-24h) 5. Misurazione diametro alone di inibizione

67 1. Allestire piastre con idoneo terreno solido le quali vengono successivamente inoculate con una quantità di batteri sufficiente a dare uno sviluppo confluente generando una patina uniforme sul terreno

68 2. Deporre sulla superficie della piastra, con l aiuto di una pinzetta sterile, una serie di dischetti di carta assorbente imbevuti con adatte concentrazioni degli antibiotici che si desidera testare. 3. Incubare le piastre a 37 C per ore.

69 4. Misurare il diametro degli aloni di inibizione formatisi per ogni antibiotico.

70 Secondo i criteri stabiliti dalla CLSI (Clinical and Laboratory Clinical Institute) il diametro dell alone di inibizione deve rispondere a determinati valori al di sotto dei quali il microrganismo viene considerato Resistente, ed al di sopra dei quali viene considerato Sensibile. Esiste inoltre una zona definita Intermedia in cui si deve stabilire se il microrganismo è sensibile o resistente.

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72 MICRORGANISMO SENSIBILE MICRORGANISMO con RESISTENZA

73 L'E-test o epsilon test dalla forma dell'alone di inibizione, è un metodo quantitativo per la determinazione della MIC. E-test è costituito da strisce di plastica di 5 x 50 mm contenenti un gradiente corrispondente a 15 concentrazioni a raddoppio di antibiotico (in mg/ml). Queste sono variabili a seconda dei diversi antibiotici utilizzati:

74 La tecnica di semina a tutta piastra è analoga a quella dell antibiogramma per diffusione secondo Kirby-Bauer. Deposizione delle strisce antibiotizzate sulla superficie della piastra inoculata Incubazione a 37 C per ore. La lettura della MIC si effettua dove la crescita batterica interseca la striscia.

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