PLATELIA TM EBV-EA-D IgG Test

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1 PLATELIA TM EBV-EA-D IgG Test DOSAGGIO IMMUNOENZIMATICO PER LA DETERMINAZIONE QUALITATIVA DEGLI ANTICORPI IgG VERSO IL VIRUS DI EPSTEIN BARR (EARLY ANTIGEN - DIFFUSE) NEL SIERO UMANO

2 1 - SCOPO DEL TEST Il presente kit di dosaggio immunoenzimatico è inteso per la determinazione qualitativa degli anticorpi IgG verso il componente diffuso dell antigene precoce del virus di Epstein Barr (EA-D) nel siero umano. Il dosaggio Platelia TM EBV-EA IgG può essere impiegato in associazione con altri dosaggi sierologici di Epstein Barr (Platelia TM EBV-VCA IgM, Platelia TM EBV-VCA IgG e Platelia TM EB-NA-1 IgG) come supporto per la diagnosi della mononucleosi infettiva. 2 - INTERESSE CLINICO La rivelazione del virus di Epstein Barr è stata descritta per la prima volta nel 1964 da Epstein, Achong e Barr mediante studi al microscopio elettronico di colture di linfoblasti derivati da pazienti affetti da linfoma di Burkitt. In base alle sue caratteristiche morfologiche, il virus EBV è classificato come appartenente alla famiglia degli herpes virus. L infezione può evidenziare un ampio spettro di sintomi clinici. La maggior parte delle infezioni primarie da EBV si trasmettono attraverso al saliva, colpiscono soprattutto i bambini e hanno carattere subclinico. Negli Stati Uniti il 50% della popolazione ha sviluppato anticorpi anti EBV prima dell età di 5 anni e l 80% entro l età adulta. Sono stati altresì riportati casi di infezioni da EBV associati alle trasfusioni. Nei giovani adulti le infezioni da EBV possono manifestarsi clinicamente come mononucleosi infettiva (IM) con sintomi relativamente atipici come febbre, faringite, tonsillite, linfoadenopatia, malessere, cefalea, mialgia, spleno ed epatomegalia, rash e leucocitosi. Gli studenti dei collegi e il personale militare sono spesso citati tra le popolazioni a maggiore incidenza di morbilità per la mononucleosi infettiva. Successivamente all infezione primaria da EBV, si è ipotizzato che il linfocita B possa continuare a ospitare il genoma dell EBV e stabilire un'infezione latente che si può prolungare per tutta la vita. La riattivazione o un aumento dell attivazione dell infezione da EBV è stata documentata in pazienti immunodeficienti o immunodepressi, vale a dire pazienti che hanno subito trapianti di organi, individui affetti da tumori maligni, donne in gravidanza e persone in età avanzata. Sussistono controversie riguardo alla definitiva implicazione dell EBV quale agente eziologico nello stato clinico indicato come infezione cronica da EBV o mononucleosi cronica. 72

3 Il virus Epstein Barr è stato altresì associato alla patogenesi di due carcinomi umani, il linfoma di Burkitt e il carcinoma nasofaringeo. La documentazione basata su studi di ibridazione del DNA dimostra la presenza del genoma del virus EBV nei campioni bioptici prelevati da individui affetti da tali carcinomi. Il linfoma di Burkitt è stato osservato per la prima volta nell Africa Subsahariana, principalmente nei bambini, e in Nuova Guinea. Solitamente nei pazienti affetti da linfoma di Burkitt vengono diagnosticate infezioni da malaria ritenute un cofattore. Il carcinoma nasofaringeo è stato osservato in Asia, soprattutto nella Cina meridionale, e può subire influenze genetiche o ambientali quali cofattori. Casi di linfomi a cellule B simili al linfoma africano di Burkitt sono stati di recente riportati in pazienti con sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS). Si ritiene che i pazienti affetti da AIDS possano essere predisposti all'infezione / riattivazione del virus EBV a causa del loro generale stato di immunosoppressione. Le infezioni da EBV causano la produzione di anticorpi diretti contro quattro distinti complessi antigenici. Questi comprendono: Antigene nucleare del virus EBV (EBNA), Antigene precoce del virus EBV (EA), antigene del capside virale (VCA) e antigene di membrana del virus EBV (MA). Il complesso EA è suddiviso in due componenti che comprendono EA-D (componente diffuso) e EA-R (componente ristretto). Il complesso EA deriva da una trascrizione iniziale precedente alla sintesi del DNA. Il mrna interessato nella trascrizione codifica gli enzimi e le polimerasi necessarie per la sintesi dell acido nucleico virale. Tale prodotto non strutturato entra nel ciclo di replicazione e produce virioni completi. Nelle fasi iniziali o avanzate di mononucleosi infettiva è possibile riscontrare gli anticorpi IgG verso il complesso antigenico iniziale. 3 - PRINCIPIO DELLA PROCEDURA Il dosaggio immunoenzimatico in fase solida (ELISA) si fonda sulla capacità dei materiali biologici (come gli antigeni) di adsorbire a superfici di plastica come il polistirene (fase solida). Il kit Platelia TM EBV-EA-D IgG utilizza la tecnologia ELISA in cui un antigene ricombinante EBV-EA-D si lega ai pozzetti di una micropiastra. Quando gli antigeni legati alla fase solida vengono messi a contatto con il siero di un paziente, l anticorpo specifico per l antigene, se presente, si legherà all antigene sulla fase solida a formare un complesso antigene-anticorpo. L anticorpo in eccesso viene eliminato mediante lavaggio. Tale operazione è seguita dall aggiunta di globulina di 73

4 capra anti IgG umana coniugata con perossidasi di rafano che quindi si lega al complesso anticorpo-antigene. Il coniugato in eccesso viene eliminato mediante lavaggio, seguito dall aggiunta di Substrato, tetrametilbenzidina (TMB). Se nel siero del paziente è presente l anticorpo specifico per l'antigene apparirà una colorazione blu. Una volta bloccata la reazione enzimatica con 1N H 2 SO 4, il contenuto dei pozzetti diventerà giallo. L intensità di colorazione, che è proporzionale alla concentrazione di anticorpo nel siero, può essere letta mediante un adeguato apparecchio spettrofotometrico o un lettore di micropiastre per tecnica ELISA. La sensibilità, specificità e riproducibilità dei dosaggi immunoenzimatici in fase solida possono essere paragonabili ad altri test sierologici per la rivelazione di anticorpi, come il test di immunofluorescenza, della fissazione del complemento, di emoagglutinazione e dosaggio immunoradiologico. I dosaggi su fase solida possono essere paragonabili ad altri test sierologici per la rivelazione di anticorpi, come il test di immunofluorescenza, della fissazione del complemento, di emoagglutinazione e dosaggio immunoradiologico. 4 - COMPOSIZIONE DEL KIT Tutti i reagenti sono intesi esclusivamente per uso diagnostico in vitro. Etichetta Natura dei reagenti Presentazione R1 Microplate Micropiastra: 12 Strip (da 8 pozzetti ciascuna) sensibilizzate con antigene ricombinante EBV-EA-D, conservato in un involucro di alluminio con essiccante / indicatore di umidità 1 R2 R3 R4a Concentrated Washing Solution (20x) Non reactive control Positive Control I Soluzione di lavaggio concentrata (20 x). Tampone Tris (ph 7,2 ± 0,2) con l 1% di Tween 20. Conservanti: ProClin 300 (0.1%). Controllo non reattivo (umano) per gli anticorpi IgG EBV-EA-D. Negativo per gli anticorpi Ag HBs e HIV- 1, HIV-2 e HCV; Conservanti: sodio azide (< 0,1 %) e penicillina /streptomicina (0,01%) Controllo positivo I (umano) per gli anticorpi IgG anti EBV-EA-D. Negativo per gli anticorpi Ag HBs e HIV- 1, HIV-2 e HCV. Conservanti: sodio azide (< 0,1 %) e penicillina /streptomicina (0,01%) 1 x 50 ml 1 x 0,4 ml 1 x 0,4 ml 74

5 R4b Etichetta Natura dei reagenti Presentazione Positive Controllo positivo II (umano) per gli anticorpi IgG 1 x 0,4 ml Control II anti EBV-EA-D. Negativo per gli anticorpi Ag HBs e HIV-1, HIV-2 e HCV. Conservanti: sodio azide (< 0,1 %) e penicillina /streptomicina (0,01%) R5 Calibrator Calibratore (umano) per gli anticorpi IgG anti EBV- EA-D, con il fattore specifico del kit stampato sull'etichetta esterna della confezione. Negativo per gli anticorpi Ag HBs e HIV-1, HIV-2 e HCV. Conservanti: sodio azide (< 0,1 %) e penicillina /streptomicina (0,01%) R6 Conjugate Coniugato: Anticorpi caprini anti IgG umane legati con perossidasi di rafano. Conservanti: ProClin 300 (0,1%) and gentamicina R7 Diluent I Diluente I: tampone pronto per l uso (ph 7,5 ± 0,2). Conservanti: ProClin 300 (0,1%) R9 R10 Chromogen TMB Stopping Solution 5 - PRECAUZIONI E AVVERTENZE 1 x 0,4 ml 1 x 16 ml 1 x 30 ml Soluzione cromogeno/ substrato (pronta per 1 x 15 ml l uso): Tetrametilbenzidina (TMB). Soluzione bloccante (pronta per l'uso): 1N acido 1 x 15 ml solforico Foglio dati per dosaggi 1 Precauzioni L'affidabilità dei risultati dipende dal rispetto delle seguenti buone pratiche di laboratorio: Non utilizzare reagenti scaduti. Non mescolare i reagenti prelevati da lotti diversi per uno stesso ciclo di test. NOTA: È possibile utilizzare lotti diversi da quelli contenuti nel kit, purché durante un ciclo di test sia utilizzato sempre lo stesso lotto. soluzione di lavaggio (R2), soluzione cromogeno/substrato (R9) e soluzione bloccante (R10); tali reagenti possono essere utilizzati con Platelia TM EBV-VCA IgM, Platelia TM EBV-VCA IgG e Platelia TM EB-NA-1 IgG del nostro catalogo. Il diluente I (R7) può essere utilizzato con Platelia TM EBV-VCA IgG e Platelia TM EB-NA-1 IgG. Contattare il nostro servizio di assistenza tecnica per informazioni più detagliate. 75

6 Prima dell utilizzo è necessario attendere 30 minuti affinché i reagenti si stabilizzino a temperatura ambiente. Ricostituire i reagenti usando cautela per evitare qualunque contaminazione. Non eseguire il test in presenza di vapori reattivi (acidi alcalini, vapori aldeidi) o di polveri che potrebbero alterare l'attività enzimatica del coniugato. Utilizzare recipienti di vetro perfettamente lavati e risciacquati con acqua deionizzata o preferire materiale mono-uso. Evitare di lasciar asciugare la micropiastra tra la fine delle operazioni di lavaggio e la distribuzione dei reagenti. La reazione enzimatica è molto sensibile agli ioni metallici. Pertanto, evitare qualunque contatto delle diverse soluzioni di substrato o coniugato con elementi metallici. La soluzione di cromogeno/substrato deve essere incolore. La presenza di colore indica che il reagente non può esser usato e deve essere sostituito. Utilizzare un puntale nuovo per ciascun campione. Il lavaggio della micropiastra costituisce una fase essenziale nella procedura: attenersi al numero di cicli di lavaggio prescritti e assicurarsi che tutti i pozzetti siano riempiti completamente e successivamente svuotati. Lavaggi non appropriati possono comportare risultati inesatti. Non utilizzare mai lo stesso contenitore per distribuire il coniugato e la soluzione di rivelazione. Controllare le pipette e gli altri strumenti per garantire che le operazioni siano precise e corrette. Non modificare il modo operativo. INDICAZIONI PAR LA SALUTE E LA SICUREZZA Tutti i reagenti forniti sono destinati all'uso esclusivo per la diagnosi in vitro. Durante la manipolazione dei reagenti indossare guanti monouso. Non pipettare con la bocca. I materiali di origine umana utilizzati per la preparazione dei reagenti sono stati sottoposti a test che hanno rivelato la non reattività per l'antigene di superficie dell'epatite B (Ag HBs), per gli anticorpi del virus dell'epatite C (HCV) e per il virus di immunodeficienza umana (anti-hiv1 e anti-hiv2). 76

7 Poiché nessun metodo può garantire con certezza assoluta l'assenza di agenti infettivi, maneggiare i reagenti di origine umana e i campioni dei pazienti come potenzialmente infettivi. Qualunque materiale che venga in diretto contatto con i campioni e i reagenti di origine umana, come pure la soluzione di lavaggio, dovrebbero essere considerati come prodotti infettivi. Evitare schizzi di campioni o di soluzioni che li contengono. Eventuali schizzi devono essere lavati con candeggina diluita al 10%. Se il liquido contaminante è un acido, le superfici sporche devono essere neutralizzate inizialmente con bicarbonato di sodio, poi lavate con candeggina e asciugate con carta assorbente. Il materiale usato per ripulire deve essere eliminato in un contenitore per residui contaminati. I campioni, i reagenti di origine umana, come pure i materiali ed i prodotti contaminati devono essere eliminati solo dopo decontaminazione. - o mediante immersione in candeggina a concentrazione finale del 5% di ipoclorito di sodio per 30 minuti, - oppure mediante autoclavaggio a 121 C per almeno 2 ore. L autoclavaggio per almeno un ora a 121 C è il metodo migliore per inattivare i virus HIV e HBV. ATTENZIONE : NON INTRODURRE SOLUZIONI CONTENENTI IPOCLORITO DI SODIO NELL AUTOCLAVE. La manipolazione e l eliminazione dei prodotti chimici devono essere effettuate attenendosi alle buone pratiche di laboratorio. Evitare qualunque contatto del tampone substrato, del cromogeno e della soluzione bloccante con la pelle o le mucose (rischio di tossicità, irritazioni o bruciature). La scheda relativa ai dati sulla sicurezza dei materiali è disponibile su richiesta. 77

8 78 Attenzione: alcuni reagenti contengono ProClin 300 < 1,5% Xi - Irritante R43: Può provocare sensibilizzazione per contatto con la pelle S28-37: In caso di contatto con la pelle, lavarsi immediatamente e abbondantemente con acqua e sapone. Usare guanti adatti. 6 - MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO Miscelatore tipo Vortex. Lettore per micropiastre dotato di filtri da 450 nm (*). Contenitore per rifiuti a rischio biologico. Ipoclorito di sodio (candeggina) e bicarbonato di sodio. Acqua distillata o deionizzata. Cilindri graduati. Guanti in lattice monouso. Occhiali di protezione. Carta assorbente. Pipette o multipipette automatiche o semi-automatiche, regolabili o fisse impostate per dispensare da 10, 100 e 1000 µl. Dispositivo di lavaggio per micropiastre manuale, semi-automatico o automatico (*). Provette monouso. (*) Rivolgersi al nostro reparto tecnico per informazioni dettagliate riguardo la strumentazione consigliata. 7 - RICOSTITUZIONE E CONSERVAZIONE DEI REAGENTI Il kit deve essere conservato a 2-8 C fino alla data di scadenza indicata sulla confezione (salvo diversa indicazione specifica). Prima dell'uso, lasciare che i reagenti raggiungano la temperatura ambiente ( C) Subito dopo l uso riporre i reagenti in frigorifero. 1) Reagenti pronti per l'uso: Reagente 1 (R1): micropiastra Ciascun vassoio contenente 12 strip è avvolto in una bustina rivestita di alluminio. Tagliare la bustina con un paio di forbici o un taglierino a 0,5-1 cm sopra la linea. Riporre immediatamente le strisce inutilizzate nel sacchetto. Risigillare il sacchetto con cautela e conservarlo a +2-8 C. A questo punto le strip rimangono stabili per 1 mese. Reagente 3 (R3): controllo non reattivo

9 Reagente 4a (R4a): controllo positivo I Reagente 4b (R4b): controllo positivo II Reagente 5 (R5): calibratore Reagente 6 (R6): Coniugato Reagente 7 (R7): Diluente I Reagente R9(R9): Soluzione cromogeno/ substrato Quando non viene usato, il reagente va conservato ben chiuso, altrimenti nei pozzetti di reazione si potrebbe formare un precipitato. Reagente 10 (R10): soluzione bloccante 2) Reagenti da ricostituire Reagente 2 (R2): soluzione di lavaggio concentrata (20x): Diluire 50 ml di soluzione di lavaggio 20X a 1,0 l con acqua distillata e/o deionizzata in modo da ottenere la soluzione pronta per l uso. Mescolare a fondo. Dopo la diluizione, conservare a 2-8 C per 5 giorni 8 - CAMPIONI Prelevare un campione di sangue secondo le pratiche d'uso. Il test sarà eseguito con campioni non diluiti. Estrarre il siero dal coagulo o dai globuli rossi non appena possibile per evitare emolisi. Un emolisi molto accentuata può avere ripercussioni sulle prestazioni del test. I campioni che presentano grumi devono essere chiarificati prima del test mediante centrifugazione. Le particelle o aggregati di fibrina in sospensione possono produrre risultati falsi positivi. Se il test è eseguito entro 5 giorni i campioni vanno conservati a C oppure possono essere congelati a 20 C per parecchi mesi. Evitare cicli ripetuti di congelamento / scongelamento. Se i campioni devono essere spediti, imballarli secondo le normative vigenti in materia di trasporto di agenti eziologici. NON USARE SIERI CONTAMINATI, IPERLIPEMICI, ITTERICI IPEREMOLIZZATI O INATTIVATI MEDIANTE CALORE 9 - PROCEDURA Attenersi strettamente alla procedura proposta. Usare il calibratore e i controlli per validare i risultati del test a ogni serie di determinazioni. Attenersi alle seguenti buone pratiche di laboratorio: 79

10 1. Definire accuratamente il piano di distribuzione e di identificazione dei campioni. 2. Preparare la soluzione di lavaggio (R2) diluita (fare riferimento al capitolo 7). 3. Estrarre il vassoio di supporto e le strisce (R1) dall'involucro protettivo. Posizionare il numero desiderato di strip sensibilizzate con antigene in un supporto con micropozzetti. Destinare un pozzetto per il bianco reagente, tre pozzetti per il calibratore, un pozzetto rispettivamente per il controllo negativo, positivo I e positivo II. A B C D E F G H 1 B1 R3 R4a R4b R5 R5 R5 S1 2 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S Tutti i campioni, i controlli e il calibratore devono essere miscelati prima dell'uso. Diluire i campioni da testare, il calibratore e i controlli negativo e positivo a 1:21 (per esempio: 10 µl µl) con il diluente I per campioni (R7) in provette o piastre per diluizione. 5. Pipettare 100 µl di ciascun calibratore, controllo o campione paziente diluito dentro ciascun pozzetto. Pipettare 100 µl di diluente I per campioni (R7) dentro il primo pozzetto per il bianco reagente. 6. Incubare la micropiastra per 20 minuti ± 2 minuti a temperatura ambiente (21-25 C). 7. Aspirare il contenuto di tutti i pozzetti in un contenitore per rifiuti biologici (contenente ipoclorito di sodio). Aggiungere immediatamente in ciascun pozzetto almeno 300 µl di soluzione di lavaggio. Aspirare di nuovo. Ripetere la procedura almeno 4 volte (per un totale di almeno 5 lavaggi). Se necessario, asciugare la piastra rivoltandola su un foglio di carta assorbente. Se si utilizza un lavatore automatico, seguire la stessa procedura. 80

11 8. Dispensare 100 µl di coniugato (R6) pronto per l uso in tutti i pozzetti. 9. Incubare per 20 minuti ± 2 minuti a temperatura ambiente (21-25 C). 10. Svuotare tutti i pozzetti mediante aspirazione e lavare 5 volte come descritto sopra. 11. Dispensare rapidamente 100 µl di soluzione cromogeno/substrato (R9) in ciascun pozzetto. 12. Lasciar sviluppare la reazione al riparo dalla luce per 10 ± 2 minuti a temperatura ambiente (21-25 C). Non utilizzare pellicole adesive durante questa incubazione. La soluzione cromogeno/substrato diventerà blu nei pozzetti contenenti livelli rivelabili di anticorpi IgG. 13. Aggiungere 100 µl di soluzione bloccante (R10) in ciascun pozzetto. Mescolare tamponando delicatamente la piastra. L aggiunta della soluzione bloccante (R10) provocherà un cambiamento di colore dal blu al giallo. 14. Attendere almeno 5 minuti prima di cominciare la lettura. Asciugare con cautela il fondo della piastra. Mediante una lunghezza d onda di 450 nm, tarare il lettore sul pozzetto del bianco reagente e misurare la densità ottica di ciascun pozzetto. Leggere la piastra entro 30 minuti dall aggiunta della soluzione bloccante (prima della lettura le strip devono sempre essere tenute lontane da fonti luminose.) 15. Accertarsi della concordanza tra la lettura e il piano di distribuzione e di identificazione dei campioni e della piastra. 10- CALCOLO E INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI 1) Calcolare l assorbanza media 1. D.O. (Densità ottica) media del calibratore del valore soglia: Calcolare il valore medio della D.O. per il calibratore valore soglia a partire da tre determinazioni di calibratore (R5). Se uno qualunque dei valori dei tre calibratori differisce di oltre il 15% dalla media, eliminare tale valore e ricalcolare la media dei due valori rimanenti. 2. Fattore di correzione: Al fine di tenere conto delle fluttuazioni giornaliere delle attività del dosaggio a causa della temperatura ambiente e della tempistica, per ciascun kit è stato determinato un fattore di correzione. Il fattore di correzione è stampato sulla fiala del calibratore. 3. Misura del calibratore valore soglia: La misura del calibratore valore soglia di ciascun dosaggio viene calcolata moltiplicando il fattore di correzione per la D.O. media del calibratore valore soglia determinata al punto 1. 81

12 82 4. Valore ISR - Calcolare un Rapporto dello stato immunitario (ISR) per ciascun campione dividendo il valore di D.O. del campione per la misura del calibratore valore soglia determinato al punto 3. Esempio : D.O. ottenute per il calibratore (R5) = 0,380-0,400-0,420 D.O. media per il calibratore (R5) = 0,400 Fattore di correzione = 0,5 Misura del calibratore valore soglia = 0,5 x 0,400 = 0,200 D.O. ottenuta per il siero del paziente = 0,600 Valore ISR = 0,600/0,200 = 3,00 2) Validazione de dosaggio 1. Bianco reagente (se letto all aria) deve essere < 0,150 a 450 nm: DO (BR) < 0, Il controllo negativo (R3) deve essere 0,250 a 450 nm (se letto rispetto al bianco reagente): DO (R3) Ciascun calibratore (R5) deve essere 0,250 a 450 nm (se letto rispetto al bianco reagente): DO (R5) Il controllo positivo (R4b) deve essere 0,500 a 450 nm (se letto rispetto al bianco reagente): DO (R4b) 0, La gamma di valori ISR (rapporto dello stato immunitario) per i controlli negativo, positivo I e positivo II (R3, R4a e R4b) dovrebbe essere stampata sulle rispettive fiale. Se tali criteri non rientrano nei rispettivi range, il test deve essere considerato non valido e deve essere ripetuto. 3) Interpretazione dei risultati I valori ISR (Rapporto dello stato immunologico) dei pazienti sono interpretati nel modo seguente: Valore ISR Risultati Interpretazione 0.90 Negativo Livelli non significativi di anticorpi IgG EBV-EA-D rivelabili Si presume che tali individui non siano infetti da EBV ma suscettibili di infezione primaria Equivoco I campioni devono essere ritestati 1.10 Positivo Livelli significativi di anticorpi IgG EBV-EA-D rivelabili Indicatore di infezione recente o in corso. Il soggetto può essere a rischio di trasmissione dell infezione da EBV, ma non necessariamente contagioso al momento.

13 1. Di seguito è indicato un metodo consigliato per riportare i risultati ottenuti: I seguenti risultati sono stati ottenuti con il test Platelia TM EBV-EA-D IgG. Valori ottenuti con metodi diversi non possono essere utilizzati in modo intercambiabile. L'entità del livello di IgG indicato non può essere correlato a un titolo endpoint. 2. Per ottenere un quadro completo dell'infezione da EBV sono stati considerati quattro diversi anticorpi anti EBV: vale a dire IgM EBV-VCA, IgG EBV-VCA, IgG EBV-EA e IgG EB-NA. Un interpretazione accurata dell infezione da EBV si basa sui risultati ottenuti da tutti questi anticorpi e solitamente la diagnosi non dovrebbe limitarsi al risultato di un singolo test. 3. I campioni i cui risultati restano equivoci dopo aver ripetuto il test devono essere ritestati con un altro metodo, per esempio il test di immunofluorescenza (IFA). Qualora i risultati fossero ancora equivoci dopo ulteriori test, si dovrà ricorrere a un nuovo prelievo di campione. 4. Sono state stabilite le caratteristiche delle prestazioni di questo prodotto utilizzando un calibratore. Qualora si desideri ottenere una curva lineare della risposta alla dose per questo test, il cliente dovrebbe stabilire almeno due calibratori aggiuntivi. 5. Per valutare il sieri di campioni appaiati al fine di rilevare cambiamenti significativi nel livello anticorpale, entrambi i campioni devono essere testati in duplicato durante lo stesso dosaggio. La ISR media di entrambi (in fase acuta e convalescente) deve essere superiore a 1,00 per poter individuare un aumento significativo di titolo anticorpale nei sieri di campioni appaiati. 4) Valori attesi Fase Acuta Gli anticorpi IgG EBV-VCA sono in aumento. Gli anticorpi IgM VCA ed eterofili sono normalmente presenti. Gli anticorpi IgG EB-NA-1 sono normalmente assenti o a livelli molto bassi. Gli anticorpi IgG EBV-EA-D cominciano ad aumentare. Fase di transizione Gli anticorpi IgG EBV-VCA persistono mentre gli anticorpi IgM EBV-VCA e eterofili solitamente diminuiscono. Gli anticorpi IgG EB-NA-1 cominciano ad aumentare. Gli anticorpi IgG EBV-EA-D solitamente persistono. 83

14 Fase Convalescente Gli anticorpi IgM EBV-VCA ed eterofili si riducono a negativi o molto bassi. Gli anticorpi IgG EBV-VCA e IgG EB-NA-1 solitamente persistono per tutta la vita. Gli anticorpi IgG EBV-EA-D sono solitamente transitori ma possono persistere per tutta la vita 5) Prevalenza Un gruppo di 360 campioni di siero prelevati da una popolazione sana in vari stati degli USA sono stati testati con il dosaggio Platelia TM EBV-EA-D IgG. I sieri sono stati randomizzati in base a sesso, età e razza. La distribuzione dei valori ISR di questo studio è riportata nella tabella seguente. In questo studio 313 su 360 dei campioni di siero sono risultati negativi durante il dosaggio: 47 campioni di siero sono risultati positivi (prevalenza: 13%) e 5% dubbi. 90 Distribuzione dei Valori ISR (N = 360) Frequency ISR [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [ [2.5->3[ 6) Limiti d uso 1. Procedure o usi del kit diversi da quelli indicati nel foglio illustrativo della confezione possono produrre risultati controversi. 84

15 Reazioni non ripetibili sono spesso causate da: - Lavaggio inadeguato della micropiastra, - Tempistica inadeguata delle fasi di incubazione, - Contaminazione di campioni negativi da parte di siero o plasma con alto titolo di anticorpi, - Contaminazione della soluzione di rivelazione da parte di agenti ossidanti (candeggina, ioni di metallo, ecc.) - Contaminazione della soluzione di arresto. Sieri contaminati, itterici, lipemici, emolizzati o inattivati mediante calore possono causare risultati errati e devono essere evitati. Le caratteristiche delle prestazioni non sono state stabilite per matrici diverse dal siero. 2. Il medico deve interpretare i risultati del test alla luce di altri risultati clinici e procedure diagnostiche. Il presente kit è indicato per la misurazione degli anticorpi IgG nei campioni prelevati da pazienti. Risultati positivi nei neonati vanno interpretati con cautela, in quanto le IgG materne sono trasferite passivamente dalla madre al feto prima della nascita. I dosaggi di IgM sono generalmente indicatori di infezione più adeguati in bambini di età inferiore a 6 mesi. I valori ottenuti dal presente dosaggio sono intesi unicamente come supporto diagnostico. Ciascun medico dovrà interpretare i risultati alla luce dell anamnesi del paziente, dei risultati dell esame fisico e di altre procedure diagnostiche. Le caratteristiche delle prestazioni non sono state stabilite per pazienti affetti da carcinoma nasofaringeo, linfoma di Burkitt, altre linfoadenopatie associate al virus EBV e altre patologie associate al virus EBV diverse dalla mononucleosi da EBV. I risultati del test Platelia TM EBV-EA-D IgG eseguito su siero prelevato da pazienti immunosoppressi devono essere interpretati con cautela. Non sono state stabilite le caratteristiche delle prestazioni di questo dosaggio per campioni pediatrici. La presenza di anticorpo anti IgG EBV può non garantire la protezine dalla malattia. La ISR di una sola determinazione di anticorpo del campione non è in correlazione con la gravità dei sintomi clinici di IM. Vi è un possibilità di reazione crociata con campioni contenenti anticorpi anti E. coli. 85

16 11- PRESTAZIONI 1 - Sensibilità relativa e specificità basata sulla caratterizzazione del siero Un totale di 193 campioni di siero caratterizzato sono stati testati con il test Platelia TM EBV-EA-D IgG. I risultati sono riassunti nella tabella seguente: Platelia TM EBV-EA-D IgM Positivo Dubbio Negativo Totale Fase Acuta Fase di transizione Seropositivo Sieronegativo Tali risultati consentono i seguenti calcoli per la specificità e sensibilità relative: Stat Risultati ** Specificità Sensibilità Sieronegativo Fase Acuta Sieropositivo Fase di transizione 14/14 * 32/33 * 106/132 * 9/9 100 % 97 % 80.3 % 100 % Concordanza 161/188 * 85.6 % * risultati dubbi non inclusi ** risultati dubbi non ritestati 2 - Ripetibilità (precisione intra-dosaggio) La precisione del test Platelia TM EBV-EA-D IgG è stata valutata testando tre sieri (uno negativo, uno basso positivo e uno positivo) per dieci volte ciascuno sulla stessa piastra. I risultati sono riassunti nella tabella seguente: Siero n X D.S. CV % Negativo Positivo basso Positivo X = Valore ISR medio D.S. = Deviazione standard C.V. = Coefficiente di Variazione 86

17 3 - Riproducibilità (precisione inter-dosaggio) La precisione del test Platelia TM EBV-EA-D IgG è stata valutata testando tre sieri (uno negative, uno basso positivo e uno positivo) per dieci volte ciascuno in tre giorni diversi. I risultati sono riassunti nella tabella seguente: Siero n X D.S. CV % Negativo Positivo basso Positivo La C.V. nei campioni positivi è risultata al di sotto del 10 %. 4 - Reattività crociata I seguenti 12 campioni di siero sono stati dosati e sono risultati negativi con il test Platelia TM EBV-EA-D IgG. Campione VZC CMV HSV 1 HSV 2 n Platelia TM EBV-EA-D IgG 0.26 < ISR < 0.83 Negativo 0.31 < ISR < 0.74 Negativo 0.37 < ISR < 0.56 Negativo Negativo 12- BIBLIOGRAFIA Vedere la verzione inglese. 87

18 12- BIBLIOGRAPHY 1. Baltz, M Identifying Stages of EBV Infection. In: American Clinical Lab. pp Epstein, M.A., Y.M. Barr, and B.G. Achong Studies with Burkitt's Lymphoma. In: Wistar Inst. Sympos. Monogr. 4: Schooley, R.T. and R. Dolin Epstein-Barr Virus Infectious Mononucleosis, 2nd edition. In: Principles and Practices of Infectious Diseases. Mandell, G.L., R.G. Douglas, and J.E. Bennett, eds. John Wiley and Sons, New York. pp Ambinder, R.F., Mullen, M., Chang, Yung-Nien, Haryward, G.S., and Hayward S.D Functional Domains of Epstein-Barr Virus Nuclear Antigen EBNA-1-1. In: Journal of Virology, ASM. Vol. 65, No., pp Davidsohn, I., Lee, C.L The Laboratory in the Diagnosis of Infectious Mononucleosis. Medical Clinics of North America. 46: Evans, A.S History of Infectious Mononucleosis. In: American Journal of Medical Science. 267: Dobek, Marinko A New Combi Test for Simultaneous Detection of Antibodies to Viral Capsid, Early, and EBNA Antigens of Epstein-Barr Virus. Zbl. Bakt. 278: Luka, Janos, R.C. Chase, and G.R. Pearson A Sensitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISA Against the Major EBV-associated Antigens: I. Correlation Between ELISA and Immunofluorescence Titers Using Purified Antigens. Journal of Immunological Methods. 67: Schmidt, Nathalie J., and Richard W. Emmons. Diagnostic Procedures For Viral Rickettsial and Chlamydial Infections 6th Edition. (Washington DC). p Lettler, Edward, Sally A. Baylis, Yi Zeng, Margaret J. Conway, Micheal Mackett, and John Arrand Diagnosis of Nasopharygeal Carcinoma by Means of Recombinant Epstein-Barr Proteins. Lancet. 337: Engvall, E., K. Jonsson, and P. Perlman Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA Quantitative Assay of Immunoglobulin G. In: Immunochemistry. 8:

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