TEST PER FARMACI ANSIOLITICI E BENZODIAZEPINE

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1 TEST PER FARMACI ANSIOLITICI E BENZODIAZEPINE

2 DEFINIZIONE DI ANSIA componente comune a molte condizioni biologiche emozione universale dell uomo l ansia è nella maggior parte dei casi utile per adattamenti di tipo psicobiologico l ansia diventa un problema patologico solo in una minoranza di casi

3 CARATTERISTICHE DELL ANSIA l ansia può essere una componente di altri disturbi psichiatrici, e presenta a sua volta diverse forme che possono complicare la sua diagnosi e il suo trattamento

4 generalmente, l ansia è incrementata da attesa di eventi inevitabili CAUSE DELL ANSIA esposizione a un ambiente nuovo sensazione di incertezza Paura incapacità di esprimere impulsi o desideri creazione di un conflitto interiore che Conflitto blocca il comportamento

5 CAUSE DELL ANSIA l ansia è un fenomeno che si autoalimenta, e la sua genesi è spiegata in genere con anomalie del sistema adrenergico, serotoninergico e, soprattutto, GABAergico farmaci

6 MECCANISMO GABAERGICO E FARMACI Il recettore GABA-A ha un ruolo cruciale nell ansia e può legare numerose molecole con azione agonista o modulatoria

7 MECCANISMO GABAERGICO E FARMACI le benzodiazepine sono i farmaci più utilizzati per il trattamento dell ansia le benzodiazepine agiscono da modulatori del canale al GABA in assenza di GABA il canale ionico non si apre il loro meccanismo d azione li rende farmaci molto più sicuri di altri come i barbiturici che prima venivano usati per il trattamento dell ansia

8 NUOVI FARMACI PER L ANSIA lo sviluppo di nuovi farmaci per l ansia riflette il coinvolgimento di sistemi diversi dal GABA e cerca di superare gli effetti collaterali e i limiti delle benzodiazepine

9 NUOVI FARMACI PER L ANSIA gli agonisti del recettore 5-HT1A sono farmaci molto promettenti i loro effetti sarebbero dovuti a un azione sul nucleo del rafe magno che proietta all ippocampo

10 MODELLI SPERIMENTALI CHE VALUTANO FARMACI ANSIOLITICI

11 MODELLI SPERIMENTALI si possono essenzialmente suddividere in due grandi categorie etologici impiegano un comportamento naturale dell animale condizionati impiegano un comportamento appreso entrambe le categorie di modelli hanno vantaggi e svantaggi

12 MODELLI ETOLOGICI VANTAGGI non richiedono addestramento usano apparecchiature semplici non necessitano di privazione di cibo e/o acqua SVANTAGGI hanno una forte componente motoria che può essere influenzata dai farmaci valutati devono essere impiegati una sola volta su un particolare animale può esistere una marcata variabilità dei risultati ottenuti

13 MODELLI CONDIZIONATI VANTAGGI l addestramento degli animali consente una maggiore riproducibilità dei risultati il test può essere ripetuto sugli stessi animali SVANTAGGI ci possono essere effetti non specifici dei farmaci valutati (es: effetto miorilassante) necessitano di addestramento spesso necessitano di privazione di acqua e/o cibo

14 TEST PER LA VALUTAZIONE DEI FARMACI SPECIFICI PER LE BENZODIAZEPINE 1) binding 2) antagonismo aggressività ADATTI PER TUTTI GLI ANSIOLITICI 1) labirinti sopraelevati (a quattro bracci, 0 maze) 2) open field 3) test dell interazione sociale etologici 4) test del marble burying 5) gabbia a due comparti test di evitamento 6) test delle vocalizzazioni ultrasoniche 7) test del conflitto condizionati 8) test della discriminazione

15 STUDI DI COMPETIZIONE CON IL BINDING presenza di GABA assenza di GABA la curva mostra la competizione tra il flumazenil (RO , antagonista del sito per le benzodiazepine), l oxazepam (agonista) e il RO (antagonista) la presenza di GABA influisce esclusivamente sulla competizione con un agonista

16 STUDI DI COMPETIZIONE CON IL BINDING agonisti antagonisti agonisti inversi GABA ratio KD in assenza di GABA KD in presenza di GABA

17 TEST DELL AGGRESSIVITA si utilizzano animali selezionati per la loro aggressività. è anche possibile indurre aggressività negli animali lasciandoli in isolamento prolungato o, nel caso del ratto, introducendo un topo nella gabbia le benzodiazepine contrastano l aggressività il test è poco utilizzato

18 TEST DEL LABIRINTO A QUATTRO BRACCI SOPRAELEVATO (O ELEVATED PLUS MAZE) versione originale due bracci sono aperti e due presentano delle pareti nel senso della lunghezza varianti due bracci sono aperti e due presentano delle pareti nel senso della lunghezza e della larghezza, oppure un solo braccio presenta pareti laterali

19 TEST DEL LABIRINTO A QUATTRO BRACCI SOPRAELEVATO (O ELEVATED PLUS MAZE) un animale deve essere esposto una sola volta al labirinto il test non deve essere ripetuto sullo stesso animale parametri misurati numero di ingressi in ciascun braccio, tempo trascorso in ciascun braccio (in 5 minuti) animale di controllo tende a trascorrere un tempo maggiore nei bracci chiusi ansiolitico incrementa gli ingressi nei bracci aperti e il tempo trascorso in essi

20 TEST DEL LABIRINTO A QUATTRO BRACCI SOPRAELEVATO (O ELEVATED PLUS MAZE) parametri critici per il test illuminazione uniforme in tutto il labirinto parametri accessori misurati distanza totale coperta nel labirinto, tempo trascorso nel quadrato centrale, numero di head dips (indice di impulsività), numero di boli fecali emessi durante il test

21 TEST DEL LABIRINTO A QUATTRO BRACCI SOPRAELEVATO (O ELEVATED PLUS MAZE) l incremento del tempo trascorso nei bracci aperti non va inteso in senso assoluto, ma relativamente agli animali di controllo questo esperimento dimostra perché il test con l elevated plus maze deve essere effettuato una sola volta

22 TEST DEL LABIRINTO CIRCOLARE SOPRAELEVATO (O ELEVATED ZERO MAZE) è un evoluzione dell elevated plus maze, in cui il labirinto è circolare e presenta delle zone protette e non protette in genere si preferisce all elevated plus maze nel caso si usino topi

23 TEST DEL LABIRINTO CIRCOLARE SOPRAELEVATO (O ELEVATED ZERO MAZE) un animale deve essere esposto una sola volta al labirinto il test non deve essere ripetuto sullo stesso animale parametri misurati numero di ingressi in ciascuna area, tempo trascorso nelle aree aperte e chiuse (in 5 minuti) animale di controllo tende a trascorrere un tempo maggiore nelle zone chiuse ansiolitico incrementa gli ingressi nelle zone aperte e il tempo trascorso in esse

24 TEST DEL LABIRINTO CIRCOLARE SOPRAELEVATO (O ELEVATED ZERO MAZE) parametri critici per il test illuminazione uniforme in tutto il labirinto parametri accessori misurati distanza totale coperta nel labirinto, numero di head dips (indice di impulsività), numero di boli fecali emessi durante il test

25 TEST DEL LABIRINTO CIRCOLARE SOPRAELEVATO (O ELEVATED ZERO MAZE) come nel caso dell elevated plus maze, l incremento del tempo trascorso nelle aree aperte non va inteso in senso assoluto, ma relativamente agli animali di controllo il grafico mostra che i risultati ottenuti utilizzando i due apparati sono sovrapponibili

26 TEST DELL OPEN FIELD valuta gli effetti del farmaco esaminato sui parametri comportamentali misurabili in un open field distanza percorsa, numero di spostamenti, grooming, rearing, tempo trascorso nella zona centrale i farmaci ansiolitici tendono ad incrementare il tempo trascorso dagli animali nella zona centrale i farmaci ansiolitici inoltre tendono ad incrementare parametri quali rearing, grooming e distanza percorsa

27 TEST DELL OPEN FIELD il test dell open field è inoltre utilizzabile per verificare la presenza di effetti sedativi in seguito alla somministrazione di un agente ansiolitico questo deve essere sempre considerato quando si valutano questi farmaci

28 TEST DELL INTERAZIONE SOCIALE 1. Esplorazione del partner 2. Ispezione ano-genitale 3. Monta 4. Autopulizia 5. Morsicature 6. Inseguimento 7. Scalciamento 8. Collutazione

29 TEST DELL INTERAZIONE SOCIALE interazione sociale è favorita da fattori quali il buio e la permanenza in un ambiente familiare; è sfavorita da forte illuminazione e ambiente non familiare farmaci ansiolitici non agiscono sulle interazioni sociali in condizioni favorevoli, ma le possono promuovere in caso di condizioni non gradite agli animali in questo test è fondamentale chiarire se il farmaco valutato possiede effetti non specifici che possono interferire con le interazioni sociali es: effetti stimolanti motori o deprimenti motori

30 TEST DEL MARBLE BURYING è un test specifico per i topi misura l ansia e la neofobia, può essere usato anche per alcuni farmaci antidepressivi che agiscono sul comportamento ossessivo compulsivo protocollo si mette un topo per 30 minuti in una gabbia nuova che contiene 24 biglie disposte a intervalli regolari. al termine del test si contano il numero di biglie che sono sotterrate per almeno 2/3

31 TEST DEL MARBLE BURYING farmaci ansiolitici riducono il numero di biglie sotterrate il test può essere sensibile anche ad alcuni antidepressivi

32 TEST DELLE VOCALIZZAZIONI ULTRASONICHE vocalizzazioni ultrasoniche modalità di comunicazione dei roditori usata per veicolare informazioni aventi vario significato vocalizzazioni a 22-kHz lunga durata, frequenza costante, veicolano segnali negativi vocalizzazioni a 50-kHz corta durata, frequenza variabile, veicolano segnali positivi

33 TEST DELLE VOCALIZZAZIONI ULTRASONICHE vocalizzazioni che si valutano per l ansia vocalizzazioni ratto neonato di

34 TEST DELLE VOCALIZZAZIONI ULTRASONICHE il test può essere effettuato secondo protocolli differenti il più utilizzato impiega delle sessioni di foot-shock in ratti adulti alle quali segue l emissione di vocalizzazioni condizionate a 22-kHz da parte del ratto il test può essere effettuato anche valutando le vocalizzazioni emesse da un ratto appena nato separato dalla madre i farmaci ansiolitici riducono il numero di vocalizzazioni a 22-kHz emesse ratti adulti ratti neonati

35 TEST DELL INIBIZIONE DELL EVITAMENTO il ratto tenderà a preferire il compartimento scuro della gabbia e cercherà di dirigersi verso questo si basa sull evitamento condizionato di una scarica elettrica veicolata nell ambiente scuro preferito dall animale

36 TEST DELL INIBIZIONE DELL EVITAMENTO durante i primi due giorni del test gli animali vengono lasciati all interno dello shuttle-box per 20 minuti, per consentire loro l ambientamento. i tre giorni successivi l animale viene testato sottoponendolo ad un training di 80, 40, 20 trial per un tempo totale di 40, 20, 10 minuti rispettivamente in comparto scuro La durata de singolo trial è di 6.5 sec. così suddivisa: Stimolo acustico/luminoso 6,5 sec Stimolo elettrico ultimi 3 sec dell intensità di 1 ma fastidioso ma non doloroso Ogni trial è distanziato dal precedente di 30 sec e per ottenere una migliore risposta si usano due stimoli (sonoro e visivo) contemporaneamente. il trattamento con il farmaco ansiolitico si fa il giorno del test, non dovrebbe essere fatto durante l addestramento

37 TEST DELL INIBIZIONE DELL EVITAMENTO si registrano i seguenti parametri: stop = numero di shock subiti e nessun passaggio del ratto durante stimolo fuga = numero di passaggi in presenza di shock evitamento = numero di passaggi in presenza di solo stimolo acustico/visivo attraversamenti = attraversamenti spontanei durante test latenza = tempo latenza (sec) tra stimolo acustico/visivo e passaggio

38 TEST DELL INIBIZIONE DELL EVITAMENTO gli ansiolitici riducono l evitamento l animale non percepisce più lo stato d ansia anticipatorio connesso all arrivo della scarica elettrica

39 TEST DEL CONFLITTO DI VOGEL in questo test l animale deve essere privato dell acqua per almeno 24h prima di iniziare il test il beccuccio della bottiglia è collegato ad un generatore di scariche elettriche in modo da generare una situazione di conflitto nell animale sete contro scarica elettrica

40 TEST DEL CONFLITTO DI VOGEL esempio di protocollo privazione dell acqua primo test (3 min) in cui agli animali è consentito bere per verificare se trovano la bottiglia gli animali che non la individuano si scartano 24h, senza acqua test vero e proprio (3 min) in cui agli animali è consentito bere fino ad un certo limite (es 20 leccate), oltre il quale ricevono la scossa l arrivo della scossa può essere segnalato da uno stimolo luminoso o sonoro 24h risposte non punite leccate fatte prima dello shock risposte punite leccate fatte dopo che lo shock è stato veicolato

41 TEST DEL CONFLITTO DI VOGEL i farmaci ansiolitici aumentano il numero di risposte punite riducono lo stato d ansia associato alla scossa MTEP = antagonista mglu5, SB = antagonista 5-HT6 fattori da considerare nel test di Vogel effetto dei farmaci sulla sensazione della sete ed effetti sedativi (le risposte non punite non devono modificarsi)

42 TEST DEL CONFLITTO DI GELLER la leva è elettrificata in questo test l animale deve essere privato del cibo per almeno 24h prima di iniziare il test si utilizza un box di Skinner, in cui è presente una leva che l animale dovrà manovrare per ottenere il cibo, e che sarà collegata ad un generatore di scariche elettriche in modo da generare una situazione di conflitto nell animale fame contro scarica elettrica

43 TEST DEL CONFLITTO DI GELLER esempio di protocollo privazione del cibo primo test (3 min) in cui agli animali è consentito azionare la leva per verificare se apprendono il collegamento tra cibo e leva gli animali che non lo fanno si scartano 24h 24h, senza acqua test vero e proprio (3 min) in cui agli animali è consentito premere la leva fino ad un certo limite (es 20 pressioni), oltre il quale ricevono la scossa l arrivo della scossa può essere segnalato da uno stimolo luminoso o sonoro risposte non punite pressioni fatte prima dello shcok risposte punite pressioni fatte dopo che lo shock è stato veicolato

44 TEST DEL CONFLITTO DI GELLER i farmaci ansiolitici aumentano il numero di risposte punite riducono lo stato d ansia associato alla scossa fattori da considerare nel test di Geller effetto dei farmaci sulla sensazione della sete ed effetti sedativi o stimolanti motori (le risposte non punite non devono modificarsi)

45 TEST DELLA DISCRIMINAZIONE si basa sulla capacità dei farmaci di provocare specifiche sensazioni che l animale è in grado di riconoscere ed associare a uno stimolo è un test complesso che richiede un addestramento degli animali molto impegnativo impiega un box che contiene due leve che possono essere azionate per ottenere cibo o acqua la specifica leva che sarà azionata è determinata dalla sensazione che il farmaco provoca nell animale

46 TEST DELLA DISCRIMINAZIONE Veicolo - leva A addestramento H2O / cibo Farmaco A - leva B H2O / cibo esperimento Farmaco B - leva B H2O / cibo Farmaco C - leva A H2O / cibo si prosegue fino a che l animale non impara ad associare gli stimoli alle leve con un efficienza di circa 85% somministrazione del farmaco da valutare e verifica del comportamento operante se il farmaco A e il farmaco B inducono le stesse sensazioni, l animale premerà la leva associata al farmaco A durante l addestramento se il farmaco C e il farmaco B inducono sensazioni differenti o se il farmaco C antagonizza gli effetti mediati dal farmaco B, l animale premerà la leva che durante l addestramento era stata associata al veicolo

47 TEST DELLA DISCRIMINAZIONE: PROCEDURA addestramento gli animali si addestrano o somministrando un farmaco ansiogeno (PTZ, b-carboline) oppure un farmaco ansiolitico è più difficile valutare effetti ansiolitici in condizioni basali, ma comunque è possibile farlo esperimento durante l esperimento si somministra nuovamente il farmaco che l animale ha imparato a discriminare l animale premerà la leva secondo quello che ha imparato durante l addestramento successivamente si somministra il farmaco ansiolitico da valutare la leva che sarà azionata dall animale dipenderà dalle proprietà del farmaco

48 TEST PER FARMACI ANSIOLITICI i test che valutano farmaci ansiolitici devono essere necessariamente accompagnati da valutazioni dell attività sedativa dei farmaci valutazioni interne al test es: distanza percorsa in un labirinto, numero di risposte totali nei test di conflitto, etc valutazioni accessorie es: attività motoria, rotarod, etc.

49 MODELLI GENETICI DI ANSIA