ORTHOMYXOVIRUS Virus dell influenza

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1 Facoltà di Medicina e Chirurgia ORTHOMYXOVIRUS Virus dell influenza Prof. Oliviero E. Varnier Dr.ssa J. McDermott Sezione di Microbiologia Dipartimento Interdisciplinare di Scienze Chirurgiche, di Microbiologia e dei Trapianti d Organo (DISCMIT)

2 VIRUS DELL INFLUENZA 3 tipi: Influenzavirus A animali e uomo epidemie e pandemia Influenzavirus B solo uomo piccole epidemie Influenzavirus C solo uomo forme cliniche molto. lievi Virus dell'influenza A Generalmente specie-specifico ma infettare differenti specie animali. alcuni ceppi possono I ceppi che infettano gli uccelli (in particolare i migratori), il maiale e l uomo sono ritenuti la più importante causa di variabilità del virus 2

3 VIRUS DELL INFLUENZA Caratteri generali Virioni: Sferici, oppure filamentosi (pleomorfici) Involucro: Lipidico, contiene 2 glicoproteine HA e NA con uno strato costituito di 2 proteine matrice M1 e M2 Genoma: RNA a polarità negativa a unico filamento segmentato (8 segmenti in A e B, 7 in C) Core: Nucleoproteina associata ad ogni filamento di RNA formando i ribonucleoproteine (RNPs) Simmetria: Elicoidale Replicazione: Nucleare 3

4 VIRUS DELL'INFLUENZA: Morfologia RNA a singola filamento frammentato RNA Proteina PB2 PB1 PA HA NP NA M 1 M 2 NS 1 NS 2 Funzione Polimerasi Polimerasi Polimerasi Emoagglutinina Nucleoproteina Neuroaminidasi Matrice Proteine non strutturali 4

5 RNA segmento VIRUS DELL'INFLUENZA: RNA Prodotti dei segmenti genici Proteina Funzione Azione 1 PB1 polimerasi RNA-trascrittasi 2 PB2 Polimerasi RNA-trascrittasi 3 PA Polimerasi RNA-trascrittasi 4 HA emagglutinina Adsorbimento (proteina di fusione) 5 NP nucleoproteina Racchiude l RNA (nucleocapside) 6 NA neuraminidasi Taglia l acido sialico e promuove il rilascio del virus 7 M (M1-M2) matrice M1 - supporto per l involucro; partecipa al assemblaggio e al rilascio della progenie; M2 - favorisce il denudamento e la produzione di HA 8 NS (NS1-NS2) non strutturale trasporto degli RNA genomici nel citoplasma 5

6 VIRUS DELL'INFLUENZA: Morfologia Involucro lipidico o pericapside, derivato dalla cellula ospite, con 2 glicoproteine Emagglutinina (HA) Neuraminidasi (NA) Presentano instabilità genetica che e responsabile di EPIDEMIE (mutazioni minori o DRIFT) e PANDEMIE (mutazioni maggiori o SHIFT) (rapporto HA/NA circa 4-5 a 1) 6

7 VIRUS DELL'INFLUENZA: Emagglutinina (HA) Rappresenta l antirecettore che lega il virione al recettore (acido sialico) in seguito al taglio delle due subunità (HA1 e HA2) con specifiche proteasi cellulari. Promuove la fusione del virus con la membrana della vescicola endocitica Agglutina le emazie Induce Ab proteggenti Sono note 16 diverse varietà antigeniche (H1 H16). Forma trimerica bastoncellare 7

8 VIRUS DELL'INFLUENZA: Neuraminidasi (NA) Proteina ad attività enzimatica Scinde l acido sialico presente nelle glicoproteine del muco (mucose respiratorie). Facilita il rilascio del virus dalla superficie delle cellule infettate. il bersaglio dei farmaci: Oseltamivir (Tamiflu) e Zanamivir (Relenza) Forma tetramero Sono note 9 varietà di neuraminidasi (N1-N9). 8

9 VIRUS DELL'INFLUENZA: Classificazione Le proteine (M1, M2 e NP) sono tipo-specifici e vengono utilizzate per stabilire il virus TIPO (A, B o C) I tipi A e B vengono classificati in sottotipi sulla base della struttura antigenica delle loro glicoproteine di superficie 16 sottotipi di HA (da H1 a H16) 9 sottotipi di NA (da N1 a N9) Otto sottotipi identificati nel virus dell influenza A umano 6 HA (H1-H3, H5, H7 e H9) e 2 NA (N1 e N2) Il virus di tipo C umano ha: 1 sottotipo di HA e 1 sottotipo di NA 9

10 VIRUS DELL'INFLUENZA: Nomenclature Ogni sottotipo viene definito e identificato dal: 1) Tipo 2) Luogo dell isolamento 3) Numero di ceppo 4) Anno dell isolamento 4) Tipo di HA e NA 10

11 VIRUS DELL'INFLUENZA: Replicazione Meccanismo di replicazione simile a quello di altri virus a RNA a polarità negativa 11

12 VIRUS DELL'INFLUENZA: Caratteristiche 12

13 VIRUS DELL'INFLUENZA: Variabilità Antigenica La variabilità genetica è comune per: 1) i virus influenzali perché hanno un genoma di RNA segmentato. l RNA polimerasi non possiede attività proof reading 2) i virus influenzali tipo A perché hanno un ampio spettro d ospite 13

14 VIRUS DELL'INFLUENZA: Variabilità Antigenica Capacità dei virus influenzali nel mutare la specificità antigenica delle proteine di superficie (HA - NA) Varianti Epidemiche Drift Antigenico Mutazioni minori Varianti Pandemiche Shift Antigenico Mutazioni maggiori (riassortimento) = difficoltà nel prevenire l influenza 14

15 VIRUS DELL'INFLUENZA: Drift Antigenico Responsabile delle Epidemie Stagionali Mutazioni puntiformi nei geni che codificano le proteine di superficie (HA e NA) Il nuovo ceppo è una nuova variante virale correlato geneticamente alle varianti già circolanti nella stessa popolazione in grado di infettare individui già infettati dallo stesso sottotipo Gli anticorpi non riconoscono HA o NA modificati 15

16 VIRUS DELL'INFLUENZA Shift Antigenico Responsabile delle Pandemie Riassortimento genetico dei geni che codificano le proteine di superficie (HA e NA) L infezione contemporanea di una cellula con due diversi virus provocando l inserimento di filamenti di RNA di un virus nel nucleocapside dell altro. 256 possibili combinazioni degli 8 segmenti di RNA delle due virus Il nuovo ceppo è una nuova virus Antigenicamente distinto dagli altri virus che infettano una data specie 16

17 VIRUS DELL'INFLUENZA: Shift Antigenico HA NA Tutti i sottotipi identificati nei virus degli uccelli ma soltanto 9 nel tipo A umano 6 HA (H1-H3, H5, H7 e H9) 2 NA (N1 e N2) 17

18 Virus Influenzale: Recettori dell HA L emoagglutinina si lega ai residui di acido sialico con un legame α2,6-ga nell uomo α2,3-gal negli uccelli sia α2,3-gal che α2,6-gal nei maiali 18

19 Virus Influenzale: Shift Antigenico Ospiti come il maiale possiedono i recettori per virus di specie diverse e sono responsabili del RIASSORTIMENTO GENICO Virus avario Virus umano Il maiale può essere infettato con la stessa efficienza sia da virus influenzali umani sia da ceppi aviari Riassortimento genetico 1957 H2N2 Asian 1968 H3N2 Hong Kong 19

20 Virus Influenzale: Le Pandemie La comparsa di un virus influenzale completamente diverso da quelli precedenti non è di per sé sufficiente a determinare una pandemia. Perché si generi una pandemia è necessario che: emerga un nuovo sottotipo virale nei confronti del quale la popolazione non abbia un adeguato patrimonio anticorpale. il nuovo virus sia in grado di replicarsi nell uomo. il nuovo virus sia in grado di trasmettersi efficacemente da uomo a uomo, ovvero di creare una catena di trasmissione. 20

21 Virus Influenzale: Le Pandemie Riassortimento genetico: Nuova HA e/o nuova NA = NUOVA VIRUS Nel corso dell ultimo secolo siano avvenuti diversi shift antigenico. Il risultato è che sono apparse tre nuove HA e due nuove NA 21

22 Virus Influenzale: Le Pandemie 22

23 Virus Influenzale: Diagnosi Secrezioni respiratorie, nasali, tonsillari, tamponi Test rapidi (bassa sensibilità) Coltura in uova embrionate di pollo Coltura in cellule di rene di cane Madin-Darby (MDCK) = CPE dopo 2-3 gg Coltura rapida in shell-vial e immunofluorescenza diretta: dopo 24-48h Tecnica di emoadsorbimento Ricerca anticorpi (solo a fini epidemiologici) = sieroconversione Test immunoenzimatici: ELISA Amplificazione genica (RT-PCR) M bp 23

24 Virus dell influenza: TERAPIA AMANTADINA e RIMANTADINA Inibitori dell ingresso del virus nella cellula ospite mediante interferenza con la proteina M2 virale (canali ionici). Attività soltanto contro il tipo A (i ceppi H5N1 sono resistenti) 24

25 Virus dell influenza: TERAPIA ZANAMIVIR (RELENZA) e OSELTAMIVIR (TAMIFLU) Analoghi di acido sialico, sostituzione al 4 OH con un gruppo aminico o guanidinico Il bersaglio è il sito attivo della proteina NA virale, regione molto conservata, inibendo il rilascio dei virus dell influenza A e B Attività anche contro H5N1 se somministrati molto presto 25

26 Virus dell influenza: VACCINI Esistono diversi tipi di vaccini Il vaccino a subunità (il più utilizzato): estremamente purificato, contiene solo le proteine necessarie a stimolare la risposta anticorpale (HA e NA di diversi ceppi di tipo A e di tipo B) in modo che la copertura antigenica sia più larga possibile. Il vaccino a virus frammentati dalla disgregazione, mediante solventi, di diversi ceppi di virus influenzali Il vaccino virosomale costituito da particelle liposomali che nel loro doppio strato fosfolipidico incorporano le proteine virali per ottenere una più elevata immunogenicità. IL FUTURO La strategia di genetica inversa: virus ricombinanti con genoma riassortito, derivato cioè da virus altamente patogeni e virus non patogeni o attenuati. 26

27 Virus dell influenza AVIARIA 27

28 Virus dell influenza Aviaria H5N1 I virus dell influenza avaria: normalmente infettano gli uccelli e meno frequentemente i maiali sono tutti classificati come Virus Influenzali di Tipo A. sono diffusi fra uccelli selvatici (l ospite naturale) sono altamente specie-specifici (virus H5N1) ma in rare occasioni possono infettare un ospite diverso quale l uomo. H5N1 ha causato la morte di numerosi uccelli migratori. Il virus H5N1 non deriva da riassortimento 28

29 Virus dell influenza Aviaria H5N1 Molto virulento L uomo non ha una immunità. La prima infezione nell uomo nel 1997 Acquisita dai polli Nessuna trasmissione diretta uomo-uomo documentata. Evolution di H5N1 dal 1997 I dati suggeriscono che H5N1 ha acquisito la capacità di replicarsi nei mammiferi (probabilmente maiali). Dal 1997 ceppi di virus dell influenza aviaria (H5N1, H7N7 e H9N2) sono stati trasmessi all uomo 29

30 INFLUENZA AVARIA: H5N1 Patogenicità La Patogenicità è basata sulle caratteristiche dell emoagglutinina e/o sul grado di diffusione e severità della malattia nei volatili Esistono virus aviari: a bassa patogenicità (LPAI) infettano le cellule epiteliali degli appararati respiratorio ed intestinale (sottotipi da H1 a H16) ad alta patogenicità (HPAI) infettano le cellule epiteliali di numerosi apparati (alcuni sottotipi H5 o H7) Sottotipi a bassa patogenicità H5 o H7 possono mutare in sottotipi ad alta patogenicità 30

31 Virus dell influenza A Suino 31

32 Virus dell influenza A Suino 2009 S-OIV H1N1 è un quadruplo riassortante di due ceppi suini, un ceppo umano e un ceppo aviario I segmenti genici HA, NP e NS sono di un virus suino classico, NA e M sono da un riassortante suino avian-like Eurasian PB1 è da un virus H3N2 umano, PA e PB2 da un ceppo aviario del Nord America 32

33 Facoltà di Medicina e Chirurgia PARAMYXOVIRUS Virus Parainfluenzale Prof. Oliviero E. Varnier Dr.ssa J. McDermott Sezione di Microbiologia Dipartimento Interdisciplinare di Scienze Chirurgiche, di Microbiologia e dei Trapianti d Organo (DISCMIT)

34 Paramyoxvirus Alcuni di questi virus erano stati classificati nei Myxovirus per alcuni caratteri che li accomunano ai virus influenzali come l affinita per i mucopolisaccaridi, la proprieta emoagglutinante e neuraminidasica e l essere prevalentemente agenti infettivi dell apparato respiratorio. 34

35 Caratteri generali Virioni: Sferici Involucro: Doppio strato lipidico, con 2 glicoproteine: una con proprietà emagglutinante/neuraminidasica (HN); l altra con attività emolitica e di fusione (proteina F). Matrice Uno strato proteico (M) Genoma: RNA a polarità negativa a unico filamento non segmentato Core: Nucleoproteina (NP) associata al filamento di RNA insieme al RNA-polimerasi ovirus Paramyoxvirus Ribonucleoproteina elicoidale La ribonucleoproteina elicoidale dei paramyxovirus. 35

36 Paramyoxvirus 36

37 Paramyoxvirus Questa famiglia di virus e divisa in 3 generi: 1) Paramyxovirus: Virus parainfluenzali 1-4 Virus della malattia di Newcastle (aviaria) Virus della parotite epidemica 2) Morbillivirus: Virus del morbillo Alcuni virus animali Paramyxovirus Alcuni di questi virus erano stati classificati nei Myxovirus per alcuni caratteri che li accomunano ai virus influenzali come l affinità per i mucopolisaccaridi, la proprietà emoagglutinante e neuraminidasica e l essere prevalentemente agenti infettivi dell apparato respiratorio. -Il genoma è formato da un unico filamento di RNA a singola elica a polarità negativa che codifica per 6-7 proteine. -Hanno un diametro medio di nm. -Hanno un capside a simmetria elicoidale. 3) Pneumovirus: Virus respiratorio sinciziale umano Alcuni virus animali(bovino e topo) 37

38 Paramyoxvirus Struttura del genoma L RNA A virionico virionico di di tutti tutti i i paramyxovirus consiste consiste in una inserie una lineare serie lineare di geni collegati di geni collegati I geni geni sono sono legati da legati una sequenza da una intergenica sequenza intergenica altamente conservata, altamente GAA. conservata, GAA. I geni contenuti nei genomi virali I geni contenuti nei genomi virali presentano qualche qualche differenza differenza tra tra i diversi i diversi generi, ma malelestrutture di di base sono identiche base sono identiche 38

39 1. Adsorbimento mediante legame tra l HN e il recettore acido sialico. 2. L Involucro del virus fonde con la membrana citoplasmatica, mediato dalla glicoproteina F 3. Il virione libera nel citoplasma il nucleocapside (RNA+NP) Ciclo replicativo 4. L avvio delle sintesi macromolecolari virus specifiche avviene nel citoplasma 5. Gemmazione dei virioni neoformati La glicoproteina F causa anche: l emolisi degli eritrociti quando il virus si adsorbe sui globuli rossi la formazione dei sincizi, la conseguenza della fusione di cellule infette che esprimono la proteina F sulla superficie cellulare Paramyoxvirus 39

40 VIRUS PARAINFLUENZALE (1-4) Danno malattie a carico delle prime vie respiratorie, con un breve periodo di incubazione. Spesso presentano sintomi simili a quelli del comune raffreddore e dell influenza. Sono soprattutto malattie dell infanzia. Nei bambini i virus di tipo 1 e 2 provocano nella gran parte dei casi una laringo-tracheo-bronchite (croup) e il tipo 3 bronchiolite e polmonite. Negli adulti i virus tipo 1, 3, 4 infettano la mucosa nasofaringea causando raffreddore 40

41 VIRUS PARAINFLUENZALE (1-4) Possono essere isolati dal gargarizzato o dal tampone faringeo, mediante colture in cavità amniotica di embrioni di pollo; possono essere coltivati in membrana allantoidea di embrione di pollo. Crescono bene su linee cellulari umane e le aree citopatiche possono essere messe in evidenza con l adsorbimento delle emazie o con immunofluorescenza. L identificazione si può fare mediante inibizione dell emoadsorbimento con sieri standard, oppure con l immunofluorescenza. Distribuiti in tutto il mondo, frequentemente danno epidemie Esistono vaccini preparati con virus inattivati con formalina, che però non hanno ancora completato la sperimentazione clinica. 41