Caratterizzazione demografica, fenotipica e genetica del cane di Mannara. Osservazioni preliminari

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1 Caratterizzazione demografica, fenotipica e genetica del cane di Mannara. Osservazioni preliminari Luigi Liotta, Florindo Arengi, Dino Miceli, Salvatore Tripoli Premessa In Sicilia si sono sviluppati e selezionati nei secoli diversi tipi di cani a seconda della funzionalità e dell utilizzo, cani che hanno accompagnato, sostenuto, coadiuvato l uomo in svariate attività. Nella caccia della piccola selvaggina appare il cane più antico d Italia, il Cirneco dell Etna; in quella della media e grossa selvaggina come l istrice ed il cinghiale, il cane Corso; nella difesa delle greggi e degli ovili, il cane Mastino Siciliano o cane di Mannara e lo Spino degli Iblei, mentre delle mandrie bovine il Branchiero; come guardiano delle macellerie il Vucciriscu. Il cane di Mannara è quindi quel cane, adibito fin da tempi remoti (segnalata la sua presenza a partire dall età del bronzo) alla guardia della mannara (dall arabo manzrah ovvero area chiusa) cioè tipico ricovero destinato all allevamento, o meglio al ricovero notturno, di ovini e caprini. La mannara era ed è costituita generalmente da un muro circolare di pietre a secco, alto un metro e mezzo su cui vengono sistemati rami di ginestra spinosa e susino selvatico, testimoniando la necessità di difendere il gregge dai predatori, principalmente dai lupi (estinti in Sicilia dal 1935). A tal proposito, il Chicoli (1870) nel suo testo di Riproduzione, Allevamento e Miglioramento degli animali domestici in Sicilia ricorda questo cane descrivendo il modo di condurre il gregge alla pastura con queste parole. Il gregge deve essere custodito, e difeso dall aggressione degli animali carnivori, segnatamente dai lupi. Il pastore, colla sua attenta vigilanza, minora siffatti inconvenienti, però la difesa è essenzialmente affidata ai cani. Questi sono lanosi, di alta taglia, intelligenti, e proprii per la custodia e difesa del gregge. Appartengono ad una razza di antichissima data, che porta il nome di razza da pastore. Il pastore per impedire che i cani fussero strangolati dai lupi, li mettono al collo un collaio di cuoio, molto resistente, e provveduto dai chiodi, le cui punte sporgono libere alla superficie, per modo che il lupo non solamente non può strangolarli, ma i chiodi riescono arma feritrice per esso. La popolazione canina Cane di Mannara oggi conta circa 90 esemplari adulti, è quindi identificabile come CRITICA in base alle categoria di rischio FAO (Tabella 1). 1

2 Il Progetto di Recupero Nell ottica di avviare attività finalizzate alla salvaguardia ed al recupero di questa antichissima popolazione canina autoctona siciliana, nonché al suo eventuale riconoscimento etnico, nel gennaio 2010 è stata fondata da un gruppo di appassionati cinofili l associazione SAMANNARA con la finalità ben precisa di tentare di evitare l estinzione del Cane di Mannara, associazione che si avvale, tramite specifiche convenzioni della collaborazione dell Unità di Produzioni Animali del Dipartimento di Scienze Veterinarie dell Università degli Studi di Messina per il censimento e la caratterizzazione fenotipica necessaria alla predisposizione di uno standard di razza, del Dipartimento di Medicina Veterinaria e Produzioni Animali dell'università degli Studi di Napoli Federico II per la caratterizzazione citogenetica e del Dipartimento Scienze e Tecnologie Biologiche Chimiche e Farmaceutiche dell Università degli Studi di caratterizzazione genetica Palermo per la Programma di lavoro Caratterizzazione fenotipica La prima fase del progetto ha riguardato il censimento della popolazione canina di Mannara concluso, per il momento, con l individuazione di 150 esemplari, di età compresa tra i 2 mesi e 6 anni, distribuiti in 13 Aziende ubicate in 4 provincie siciliane, precisamente Enna, Catania, Palermo e Messina (Tabella 2). Successivamente, su ciascun soggetto di età uguale o superiore ai 12 mesi (45 soggetti, 20 femmine e 25 maschi) sono stati rilevati, con l ausilio di un cinometro, il 2

3 metro flessibile ed il compasso misuratore, undici parametri morfologici di tipo lineare riguardanti la Testa (Lunghezza testa e muso, Larghezza muso e cranio), il Tronco (Altezza garrese, lunghezza tronco, larghezza, altezza e lunghezza e circonferenza toracica ), gli Arti (circonferenza stinco anteriore). Si è proceduto inoltre al calcolo di alcuni indici biometrici per una più rispondente identificazione del tipo morfologico. Gli Indici biometrici considerati sono stati quelli cefalico (Larghezza della testa/lunghezza della testa x 100), corporale (Lunghezza del tronco/perimetro toracico) e toracico (Larghezza toracica/altezza toracica x 100). Inoltre, utilizzando un sistema di analisi d immagine computerizzato (Image Pro Plus vers. 5.0), su fotografie acquisite con macchina fotografica digitale della testa sia di profilo che di fronte, sono stati valutati rispettivamente (Foto 1) il comportamento reciproco degli assi longitudinali superiori cranio facciali, che risultano, nella razza, lievemente divergenti, nonché di stimare come oscillante tra un minimo di 140 ed un massimo di 190 gradi l angolo cranio- facciale e la posizione degli occhi (Foto 2), che appare essere sub- frontale. Inoltre sono stati presi in considerazione il colore e le eventuali particolarità del mantello e la tipologia di occlusione. 3

4 Creazione Banca Campione Biologico e caratterizzazione genetica Su ciascuno dei 45 soggetti sottoposti alle valutazioni morfologiche è stato prelevato un campione individuale di sangue utilizzando provette contenenti K- EDTA per la successiva estrazione del DNA presso il laboratorio di Genomica del Dipartimento di Scienze Veterinarie dell Università degli Studi di Messina e la creazione quindi di una banca del DNA con lo scopo di: esplorare la variabilità genetica del cane di Mannara intra- popolazione per poter associare differenze molecolari alle numerose rilevazioni morfologiche fin ora effettuate e capire quale è il livello di inbreeding nella popolazione considerata. indagare sulla diversità genetica del cane di Mannara rispetto ad alcune razze canine filogeneticamente a lui molto vicine ed ufficialmente riconosciute. Inizialmente sarà effettuata un analisi di microsatelliti, piccole regioni genomiche ripetute in tandem solitamente molto polimorfiche, cioè variabili, e comunemente utilizzate negli studi caratterizzazione della struttura genetica di popolazione in diverse specie animali (Klukkowska et al., 2003, Amstrong et al., 2013). La scelta dei microsatelliti da analizzare si basa sul pannello messo a punto dall ISAG (International Society for Animal Genetics) nel 2005 per l analisi di parentela (ISAG/FAO, 2004), utilizzato anche per l esplorazione della variabilità genetica del Bracco italiano (Ciampolini et al., 2011). In commercio è disponibile il kit, Canine Genotypes Panel 1.1 (Thermo Scientific), che permette l analisi di 19 microsatelliti, sottoinsieme del pannello ISAG. Un primo approccio, come di seguito descritto, è stato effettuato dal gruppo di lavoro coordinato dal Prof. Vincenzo Arizza presso il Dipartimento Scienze e Tecnologie Biologiche Chimiche e Farmaceutiche dell Università degli Studi di Palermo, testando 3 miscrosatelliti appartenenti al Canine Genotypes Panel 1.1 su 18 animali. I risultati, assolutamente preliminari, indicano una certa variabilità intra popolazione; per una visione d insieme più dettagliata e fin ora unica nel cane di Mannara, è necessario completare il pannello dei 19 microsatelliti ed aumentare il numero di campioni. Data la totale assenza di informazioni genetiche sul cane di Mannara, questo approccio potrebbe fornire una prima panoramica sulla struttura genetica, confrontabile anche con altre razze canine e potrebbe offrire spunti interessanti per sfruttare, in un immediato futuro, tecniche più avanzate di next generation sequencing e next generation genotyping, 4

5 Foto 1. Valutazione dell asse cranio facciale con sistema d analisi d immagine computerizzato Foto 2. Definizione della posizione dell occhio con sistema d analisi d immagine computerizzato (in questo esemplare posizione sub- frontale, angolo tra ) 5

6 Risultati Caratterizzazione fenotipica I valori medi dei parametri morfologici rilevati (Tabella 3), da considerarsi comunque preliminari ritenendo non concluso il censimento, ed i relativi indici calcolati, ci hanno permesso di inquadrare questa popolazione canina nel tipo morfologico mesobrachimorfo, anche se è emersa una certa variabilità all interno del campione sotto osservazione che ha fatto registrare pure la presenza di soggetti riconducibili sia al tipo morfologico mesomorfo che al tipo dolicomorfo. Tabella 3. Rilievi biometrici e relativi indici della popolazione canina autoctona siciliana Cane di Mannara (valori espressi in cm). Maschi (n. 25) Femmine (n. 20) Rilievi biometrici Media±ds Minimo Massimo Media±ds Minimo Massimo Misure della testa Lunghezza della testa 24,39±1, ,05±1, Lunghezza del muso 11,04±0, ,09±0, Larghezza cranio 12,89±0, ,73±0, Larghezza muso 5,79±0, ±0,70 4,50 6 Misure del tronco Altezza al garrese 62±2, ,90±1, Lunghezza del tronco 68,45±5, ,67±3, Larghezza del torace 17,83±1, ,94±1, Altezza del torace 26,50±1,97 24, ,07±1, Lunghezza del torace 39,67±4, ,67±1, Circonferenza del torace 80,13±4, ±3, Misure degli arti Circonferenza stinco 13,63±1, ,39±1,29 10,50 14 Principali indici Indice cefalico 53,08±5, ,70 53,32±3, ,90 Indice corporale 86,06±7,05 80,50 94,90 83,61±7,55 73,42 97,22 Indice toracico 66,83±3,43 64,20 73,50 68,18±5,32 61,11 76 Il diverso comportamento in lunghezza del mascellare superiore ed inferiore fra loro, espresso dall Indice cefalico totale e che permette di classificare le razze canine in Brachicefale Mesocefale e Dolicocefale ha, a nostro avviso, essere responsabile delle tipologie di chiusure osservate, riportate in tabella 4. La forma della testa, o meglio la proporzione tra i suoi diametri, condiziona necessariamente il posizionamento dei denti e quindi influisce sulle loro reciproche relazioni. 6

7 Tabella 4. Tipi di chiusure identificate (in % dell intera popolazione identificata) Tenaglia Forbice Prognatismo 50% 33% 17% I mantelli riscontrati sono stati: fulvo in tutte le sue sfumature dal mogano al crema, nero, pulce (fegato chiaro) con distribuzione del bianco più o meno estesa a formare pezzature o la cosiddetta distribuzione a monaca (estese macchie bianche su gola, petto, collo calzini e punta della coda), tigrato associato ai suddetti colori, nero focato con distribuzione delle focature tipiche dei mantelli black and tan senza o con presenza del bianco (tricolore). Si ritiene che il bianco rappresenti un carattere di esclusione. Caratterizzazione genetica Su venti soggetti scelti casualmente all interno del gruppo sottoposto a rilievi biometrici (45 soggetti), è stato eseguito un prelievo di sangue utilizzando provette con K 3 EDTA come anticoagulante, per la successiva estrazione del DNA. La metodica per l analisi dei microsatelliti ai fini della nostra indagine molecolare si è articola come segue: Scelta dei loci micro satelliti da analizzare; Reazione di amplificazione mediante PCR (reazione a catena della polimerasi); Analisi dei frammenti di DNA amplificato mediante sequenziatore automatico (genotyping). Nel presente lavoro si è stabilito di utilizzare tre loci micro satelliti così descrivibili: AHTK211: posizionato sul cromosoma 26, repeat di due basi con range di grandezza di bp; INU030: posizionato sul cromosoma 12, repeat di due basi con range di grandezza bp; REN169D01: posizionato sul cromosoma 14, repeat di due basi con range di grandezza bp. L analisi del polimorfismo di marcatori genomici STR offre un potente strumento per l indagine diretta del livello di variabilità genetica esistente nell ambito di una popolazione animale. Tra i parametri utilizzati per la stima della diversità genetica si annovera il numero di alleli 7

8 per locus. Gli alleli dei soggetti in seguito a categorizzazione, sono stati elaborati dal software GENETIX. Tabella 5. Confronto numero di alleli per locus tra i vari gruppi di cani. Il profilo genetico del cane di Mannara è stato confrontato con quello del Bracco Italiano (Cecchi et al., 2010). Per quanto riguarda l eterozigosità osservata (H ) e l eterozigosità unbiased (H = Obs Exp eterozigosità attesa, pesata sulla dimensione della popolazione) in condizioni di equilibrio di Hardy- Weinberg (HW) può essere fatto un confronto tra i tre gruppi: Cane da mannara, Bracco italiano, Cani del comparison test (Tabella 6). Tabella 6. Eterozigosità osservata e attesa nel Cane di Mannara, nel Bracco Italiano e nei cani del Comparison test. La media dell H Exp = eterozigosità attesa nel Cane da mannara è di 0,75; nel Bracco Italiano è di 0,58 e nei cani del Comparison test è del 0,71; la media dell eterozigosità osservata (H Obs ) nel 8

9 Cane di Mannara è di 0,79; nel Bracco Italiano è di 0,59 e nei cani del Comparison test è del 0,63; questi valori medi ci mostrano come ancora una volta nel Bracco la varibilità genetica sia bassa e come nel Cane da Mannara ci sia la più elevata variabilità; la maggiore differenza tra H e H si Exp Obs osserva nei cani del Comparison Test, dove cioè rispetto alle aspettative non c è una variabilità genetica elevata. Il fenomeno dell eccesso di omozigosità, indice di suddivisione delle popolazioni e dell inbreeding, viene comunemente studiato applicando le statistiche F, definite da Wright (1978) e riderivate da Weir e Cockerham in termini di analisi della varianza (1984). F, misura la IS consanguineità (inbreeding) relativa degli individui (I) rispetto alla popolazione (S) a cui appartengono. Un valore positivo di F corrisponde a un deficit di eterozigoti, mentre un valore IS negativo indica un loro eccesso. Nel nostro caso il Fis medio è = - 0 9