Centro Università di Milano-Scuola per la diffusione delle bioscienze

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1 Centro Università di Milano-Scuola per la diffusione delle bioscienze

2 INTRODUZIONE - OBIETTIVI In questa attività impareremo ad esplorare il genoma umano utilizzando le informazioni contenute in alcune delle banche dati biomediche disponibili on line. Scopriremo le corrispondenze esistenti fra i cromosomi umani e quelli di altri organismi e impareremo a trovare un gene all interno del genoma e a scoprirne la struttura e la funzione. Avete a disposizione un computer collegato a internet e un percorso guida, con indicati i principali siti dove trovare informazioni sul genoma umano (e di altri organismi) e sui geni in esso contenuti. 1 Saper consultare database di interesse biomedico 2 Apprendere l utilizzo di alcuni strumenti bioinformatici 3 Sapere confrontare genomi di organismi differenti 4 Saper correlare fra loro geni e malattie 5 Utilizzare gli strumenti bioinformatici per lo studio dell evoluzione molecolare e della filogenesi Nelle pagine che seguono troverai le immagini delle schermate dei siti internet che ti aiuteranno nella navigazione. Ora iniziamo con la ricerca in banche dati bioinformatiche esattamente come fanno i ricercatori e gli scienziati che oggi si occupano di biologia e genetica molecolare. Navigare sul DNA CusMiBio Pag. 2

3 1. I genomi nel sito di NCBI Il primo compito è trovare i dati necessari per completare la tabella seguente. Ti suggeriamo di visitare il sito: NUMERO CROMOSOMI TOTALE TIPO CROMOSOMI SESSUALI GRANDEZZA GENOMA NUMERO DI GENI* UOMO SCIMPANZE TOPO POLLO CANE LIEVITO MOSCERINO ARABIDOPSIS Nella pagina che ti appare ci sono i link alle sequenze dei genomi di numerosi mammiferi, ma anche di organismi di altri classi. Sono disponibili pi_ di cento sequenze genomiche sia di organismi procarioti che eucarioti. Sul lato destro della pagina scegli l organismo che ti interessa e clicca sul bottone M (map viewer) e su P (genome project); otterai cosï i dati per completare la tabella che riguarda l uomo (Homo sapiens), lo scimpanzé (Pan troglodytes), il topo (Mus musculus), il cane (Canis familiaris), il pollo (Gallus gallus), il lievito (Saccharomyces cerevisiae), il moscerino della frutta (Drosophila melanogaster) e una pianta (Arabidopsis thaliana). Spunti di discussione 1 Considera e rifletti sulle differenze tra il numero di cromosomi dell uomo e dello scimpanzé; 2 I cromosomi sessuali sono sempre individuati da X e Y? Navigare sul DNA CusMiBio Pag. 3

4 2. Navigare con ENSEMBL Impariamo ad usare il sito di Ensembl, che ha una interfaccia di facile lettura. Ensembl (un gioco di parole fra ensemble cioè insieme e EMBL la sigla del European Molecular Biology Laboratory). È un progetto sviluppato in collaborazione tra Sanger Center (uno dei più importanti centri di ricerca sul genoma a Cambridge) e EMBL- EBI (European Bioinformatics Institute) per sviluppare un sistema software di annotazione automatica dei genomi animali. Con il termine annotazione si intende l inserimento di tutte le informazioni riguardanti la funzione di una determinata sequenza. Ensembl aggiorna i dati almeno dieci volte in un anno, ma nel sito si possono ritrovare comunque le versioni precedenti (Ensembl Pre!) nel riquadro Browse a Genome che si trova a sinistra della home page. Le immagini di questa dispensa si riferiscono alla versione (release) 56, aggiornata a settembre In questa pagina di ingresso si possono osservare i link alle sequenze dei genomi di diverse specie. Attualmente sono note le sequenze di molte più specie rispetto a quelle qui elencate, sia di organismi procarioti che eucarioti, tuttavia Ensembl prende in considerazione soprattutto le sequenze degli organismi del regno animale. I genomi degli animali sono particolarmente importanti perchè molto simili al nostro; per questo motivo, alcuni organismi sono utilizzati come modelli per ottenere in modo più semplice informazioni sui Navigare sul DNA CusMiBio Pag. 4

5 processi biologici e sulle malattie dell uomo. Cliccando su Homo sapiens si apre la pagina relativa al genoma umano: poche righe fanno riferimento alla provenienza dei dati presenti nella corrente versione di Ensembl. Fai clic su Karyotype, nella colonna di sinistra: si apre una nuova pagina, che permette di raccogliere varie informazioni sui cromosomi umani. In alto si ha una rappresentazione grafica del cariogramma umano, con gli ideogrammi dei 22 cromosomi autosomici e dei cromosomi sessuali; con MT viene rappresentato il genoma mitocondriale. Le linee nere o grigie sui cromosomi rappresentano le bande, regioni cromosomiche che avendo differenti proprietà fisico-chimiche si colorano in modo diverso dopo il trattamento con coloranti specifici. Navigare sul DNA CusMiBio Pag. 5

6 Le bande sui cromosomi possono essere considerate come punti di riferimento, dato che sono specifiche per ogni cromosoma; gli scienziati le hanno usate in passato come punti di riferimento per definire le diverse regioni cromosomiche e, ancora oggi, i citogenetisti utilizzano diverse tecniche di bandeggio per studiare i cromosomi. In basso sono evidenziati i dati che riguardano il genoma dell uomo. La sequenza del genoma umano è considerata oggi sufficientemente stabile, così che i tre maggiori browsers genomici (NCBI, Ensembl and UCSC Genome Browser) si sono accordati al fine di identificare e annotare ciascun gene con un codice unico valido per tutti (gene ID). Si contano 3,272,480,989 bp (paia di basi), 23,438 Known protein-coding genes (geni conosciuti che codificano proteine) and 183 Novel protein-coding genes, cioè geni previsti dalle analisi al computer, ma che non sono ancora stati verificati sperimentalmente (nota: i dati si riferiscono alla versione 56 di Ensembl, settembre 2009). A volte le previsioni bioinformatiche possono non essere corrette e l unico modo di provare l esistenza di un nuovo gene è la dimostrazione sperimentale in laboratorio! Gli pseudogeni sono geni che non sono più trascritti nelle cellule o che hanno perso, nel tempo, la capacità di codificare per proteine. Gli pseudogeni mantengono alcune delle caratteristiche proprie dei geni (quali essere preceduti da sequenze promotori, o far parte delle CpG islands, o avere siti di splicing), ma non sono più funzionanti perchè hanno perso la capacità di essere espressi a causa di eventi genetici (mutazioni) che hanno creato codoni di stop o frameshift di lettura del codice con conseguente perdita di espressione. Torna ora sulla home page di Ensembl e clicca su Mus musculus e poi su Karyotype : si aprirà la pagina relativa al cariotipo del topo con il suo tipico bandeggio. Navigare sul DNA CusMiBio Pag. 6

7 Tornando alla pagina iniziale e cliccando su View full list of all Ensembl species puoi controllare anche altre specie (cane, pollo ): noterai che non sempre sono presenti i cariotipi con i cromosomi o alcuni cromosomi non sono rappresentati nel cariotipo della specie oppure, ancora, sono presenti, ma non sono bandeggiati. Questo significa che un cromosoma è stato poco annotato o che non ci sono informazioni sui geni in esso contenuti, o infine che il bandeggio non è significativo per rintracciare zone specifiche. Torna ora alla home page di Ensembl e all Homo sapiens e prova ad osservare un cromosoma più da vicino, per esempio il cromosoma 1: cliccando sopra di esso si apre una tendina e scegliendo Chromosome summary si aprirà una pagina con una visione più dettagliata del cromosoma e di alcune sue caratteristiche. L ideogramma del cromosoma riporta annotazioni utili in citogenetica. Si possono vedere le sigle che sono state assegnate ad alcune delle bande con numeri crescenti dal centromero verso le estremità telomeriche, rispettivamente sul braccio corto del cromosoma p (petit) e sul braccio lungo q (la lettera q deriva da queue = coda, o è semplicemente la conseguenza alfabetica di p). La colonna immediatamente a destra mostra la densità genica, cioè quanti geni sono presenti in una regione specifica del cromosoma (ricorda che solo una piccola parte del genoma contiene geni) e, in particolare, la parte rossa dell istogramma mostra la percentuale di geni noti sul totale dei geni previsti. Nota che ci sono regioni con un numero di geni molto alto, altre con un numero molto basso e altre ancora senza geni (chiamate deserti ) tra cui la zona del centromero. La seconda colonna mostra la percentuale di sequenze ripetute e la linea rossa indica la percentuale di basi azotate GC. La colonna in blu indica la distribuzione di variazioni, o polimorfismi, del DNA. In basso nella schermata troverai altre informazioni sul cromosoma. Ci sono Known Protein-coding Genes, e 11 Novel Protein-Coding genes, cioè geni predetti con le analisi al computer ma che non sono ancora stati validati sperimentalmente. Navigare sul DNA CusMiBio Pag. 7

8 È possibile visualizzare altri cromosomi aprendo la tendina posta sotto la rappresentazione grafica e scegliendo il numero del cromosoma. Andiamo ora alla scoperta della chromosome synteny cioè dell associazione di gruppi di geni nella stessa regione cromosomica, mettendo a confronto cromosomi di specie differenti. In specie diverse, tratti di cromosoma contenenti gruppi di geni associati (gruppi di sintenia) risultano conservati. Per provare a confrontare i gruppi di sintenia presenti sul cromosoma 1 umano rispetto ai cromosomi di topo clicca, nel riquadro di sinistra, su Synteny : nella nuova pagina sono evidenziati i gruppi di sintesia tra il cromosoma 1 umano e i cromosomi del topo. I geni del cromosoma 1 umano sono distribuiti nei cromosomi 1, 3, 4, 5, 6, 8, 11 e 13 del topo. Nota che interi gruppi di geni mantengono la loro posizione relativa (aplotipo) e sono spesso gruppi di geni che hanno un progenitore comune. Sotto la rappresentazione grafica si aprono due tendine che consentono di cambiare rispettivamente la specie con cui fare il confronto e il cromosoma umano. Prova ora a selezionare il cromosoma X. È interessante notare che il cromosoma X umano, a differenza degli autosomi, presenta sintenia solo col cromosoma X del topo e delle altre specie. Questo è dovuto al fatto che i geni localizzati su questo cromosoma sono espressi in copia singola sia nei maschi (che hanno un solo cromosoma X), sia nelle femmine, dove uno dei due cromosomi X viene inattivato, in modo casuale, durante lo Navigare sul DNA CusMiBio Pag. 8

9 sviluppo embrionale allo stadio di blastocisti; quindi una sola copia di ogni gene presente sul cromosoma X (con alcune eccezioni) è funzionante. Per questo motivo, nell evoluzione, i geni posti sul cromosoma X tendono a rimanere localizzati insieme: se si spostassero su un autosoma, sarebbe complicato garantire la loro espressione a partire da uno solo dei due alleli (esclusione allelica). Come avrai già notato lo scimpanzè ha un cromosoma in più rispetto all Homo sapiens. Quale cromosoma umano deriva dalla fusione di cromosomi dello scimpanzè? Quali sono i cromosomi coinvolti nella fusione? Per capire l origine del cromosoma in più nello scimpanzè scegli il cromosoma 2 umano e controlla la sintenia con lo scimpanzè. Capirai che il cromosoma 2 dell uomo deriva, in gran parte, dalla fusione dei cromosomi 2A e 2B dello scimpanzè! Osservando la sintenia tra altri cromosomi umani e di scimpanzè noterai che un gran numero di gruppi sintenici sono localizzati sugli stessi cromosomi; possiamo concludere quindi che più le specie sono vicine evolutivamente, più si ritrovano conservati i gruppi di sintenia e questi ultimi sono localizzati sugli stessi cromosomi. Navigare sul DNA CusMiBio Pag. 9

10 3. Uno zoom su i geni Adesso fai clic in alto su Ensembl Human e torna alla pagina iniziale con il cariogramma umano, quindi seleziona il cromosoma 13. Noterai che il cromosoma 13 ha una densità genica abbastanza bassa. Prova ora a cliccare su una regione del cromosoma e selezionare Jump to location View, magari scegliendo una zona con molti geni (le aree senza geni sono decisamente meno interessanti!). Per seguire un percorso comune, dopo aver fatto qualche prova autonomamente, inserisci il seguente link : 3: Il riquadro superiore Chromosome 13 indica il punto in cui ti trovi sul cromosoma. Nel riquadro Region in detail viene mostrata la regione del genoma che hai selezionato (rettangolo rosso); proprio come in una cartina geografica, sono indicati gli elementi principali che si trovano nel tratto di DNA visualizzato (cloni di DNA utilizzati per effettuare il sequenziamento della regione, marcatori polimorfici, geni, ecc.). Il secondo riquadro, mostra la struttura dei geni, scoperti tramite esperimenti o previsti mediante analisi al computer, presenti in quella regione. Si notano dei rettangolini e delle barre collegate da una linea spezzata. Per capire questa rappresentazione grafica è necessaria qualche informazione sull architettura dei geni. Abbiamo già detto che i geni costituiscono solo una piccola parte del genoma. Gli scienziati stanno ancora cercando di capire come sia composto il resto del DNA. Negli eucarioti, i geni sono spesso separati da lunghe stringhe di Navigare sul DNA CusMiBio Pag. 10

11 sequenze non codificanti, il cui significato non è ancora del tutto compreso, talora chiamate impropriamente junk DNA, o DNA spazzatura; quando si arriva finalmente a un gene, la sua sequenza codificante è a sua volta frammentata in tanti pezzetti. Il risultato finale assomiglia a quello che accade quando si apre un file non di testo con un programma di scrittura. Ad esempio, quando si apre un file html (il linguaggio speciale usato per creare pagine web) con un programma di videoscrittura si potrà leggere un testo, ma sarà interrotto da una serie di istruzioni, i comandi, che dicono ad un altro programma come trasformare il testo in una pagina web. Nei geni le parti utilizzate per dirigere la sintesi di proteine o di molecole di RNA e che costituiscono il testo, e sono dette esoni (i rettangolini) e sono alternate ad altre sequenze di DNA, chiamate introni (le linee spezzate), che contengono l equivalente biologico delle istruzioni per la formattazione. La struttura dei geni in esoni e introni è caratteristica della maggior parte dei geni eucariotici anche se esistono alcuni geni non interrotti. Cliccando nel riquadro di sinistra Alignment (text) si visualizza la sequenza delle basi (A, C, G, T) che costituiscono il DNA evidenziato. Questa è la formula di un gene. Disponendo dell attrezzatura appropriata, questa informazione ti permetterebbe di produrre parte di questo gene in laboratorio. La sequenza può essere confrontata con quella di altre specie: aprire la tendina di Alignment e selezionare lo scimpanzè e poi Go. Compaiono le due sequenze del tratto di DNA, di uomo e di scimpanzè, allineate. Torna a Region in detail, fai clic su uno dei rettangolini rossi e scegli la sigla alla voce Gene: si aprirà un nuovo collegamento, ad esempio: 13: ;t=ENST Questa regione di cromosoma contiene il gene BRCA2 (BReast CAncer 2 - I nomi dei geni umani vengono per convenzione scritti in corsivo maiuscolo): qui puoi trovare molte informazioni relative al gene che hai selezionato come, ad esempio, la sua posizione all interno della sequenza del cromosoma 13 (Location). Selezionando la voce Show transcripts e scegliendo nella tabella uno dei Transcript ID, vedrai la struttura esoneintrone del gene, con i rettangoli che rappresentano gli esoni e la linea spezzata gli introni. Navigare sul DNA CusMiBio Pag. 11

12 Nel riquadro Gene summary, cliccando su BRCA2 e, nella nuova tabella, su OMIM, si aprirà un link alle malattie associate ad alterazioni in questo gene. Navigare sul DNA CusMiBio Pag. 12

13 Il gene BRCA2, insieme al gene BRCA1, rappresenta uno dei principali geni di suscettibilità al cancro della mammella e dell ovaio. BRCA2 è stato scoperto studiando famiglie islandesi con carcinoma della mammella ereditario. Questi due geni sono coinvolti nei meccanismi di riparazione dei danni al DNA, anche se tutte le loro complesse funzioni non sono state ancora completamente chiarite. Solo il 5-10% dei tumori della mammella ha un'origine ereditaria, e in questi casi, nel 90% dei pazienti sono presenti mutazioni in BRCA1 o BRCA2. BRCA1 è coinvolto nel 50-85% dei casi di tumore ereditario della mammella e conferisce un aumento del rischio di tumore all'ovaio del 15-45%. BRCA2 è responsabile del 35% dei casi di tumore ereditario della mammella. Le mutazioni nel gene BRCA2 conferiscono un rischio minore di tumore all'ovaio (10-20%) e sono associate con lo sviluppo di carcinoma della mammella maschile (6%). In entrambi i casi, esiste un piccolo aumento del rischio di sviluppare altri tipi di tumore come ad esempio colon, pancreas e prostata (6-14%). Nei carcinomi non ereditari le mutazioni di BRCA1 e BRCA2 sono invece molto rare. Si stima che, nella popolazione globale, la frequenza di soggetti portatori di mutazioni in uno di questi due geni sia fra 1/500 e 1/1000; a causa dell effetto fondatore, nei diversi gruppi etnici singole o poche mutazioni possono essere predominanti. Cliccando sulle varie voci della tabella si aprono altre pagine che ci portano a scoprire tutte le informazioni note relative al gene in esame, nonché link a banche dati di secondo livello, che raccolgono informazioni dalle banche dati di primo livello (banche dati di sequenze nucleotidiche, proteiche, di mutazioni ecc.) per organizzarle in maniera organica e integrata. Provate a cliccare Gene alla voce EntrezGene. Entrez Gene è un database di secondo livello da cui si possono trarre molte informazioni. In questa pagina viene evidenziato il rapporto tra mutazioni nei geni BRCA 1 e 2 e la probabilità di sviluppo di cancro alla mammella (summary). Navigare sul DNA CusMiBio Pag. 13

14 Adesso puoi provare a navigare secondo questa modalità a partire dal nome di un gene specifico. Ad esempio, a partire dalla pagina sul genoma di Homo sapiens ( digita FOXP2 nella casella accanto a Search. Nella pagina dei risultati, seleziona Homo sapiens e, nel riquadro che si apre, Gene. Scegli il primo gene, indicato con Ensembl protein_coding Gene: ENSG Naviga come descritto per il gene BRCA2 per trovare informazioni sul gene e la sua importanza nell uomo. Navigare sul DNA CusMiBio Pag. 14

15 4. Una carta d identità per i geni Gene Card è un altro database di secondo livello che presenta in maniera organica le informazioni relative a tutti i geni noti. Vai a Alla voce search scrivi ad esempio FOXP2, quindi clicca su Go. Nell elenco dei risultati seleziona FOXP2. Nella nuova schermata sono raccolte le principali informazioni sul gene FOXP2 localizzato sul cromosoma 7 umano. Navigare sul DNA CusMiBio Pag. 15

16 Nel campo Proteins prova a selezionare la voce 3D, che appare evidenziata in blu. Si apre una schermata con la struttura tridimensionale della proteina codificata da FOXP2: andando sull immagine e tenendo premuto il tasto sinistro del mouse è possibile muovere e osservare da varie angolazioni la figura. Navigare sul DNA CusMiBio Pag. 16

17 5. Dalla malattia al gene Navigare nel genoma in questa maniera è divertente e interessante. Proviamo adesso a interrogare le banche dati facendo un percorso inverso: andiamo a cercare il gene (o i geni) collegato ad una particolare malattia. Prendiamo come esempio il morbo di Alzheimer. Vediamo se si conoscono i geni responsabili della malattia e proviamo a cercarli nel genoma. Torna all indirizzo Digita alzheimer disease nel campo search, facendo attenzione a scrivere il termine correttamente, altrimenti non otterrai alcun risultato. Per avviare la ricerca, clicca sul pulsante Go. Otterrai una serie di risultati: ne esistono tanti perchè gli scienziati hanno scoperto diverse forme del morbo di Alzheimer, probabilmente riconducibili a geni differenti. Fai clic su Homo sapiens e poi su gene. Scorri verso il basso e clicca sul link di Ensembl protein_coding Gene: ENSG Si apre il sommario del gene PSEN1 e cliccando su Chromosome 14: 73,603,155-73,687,109 ne visualizzerai la localizzazione sul cromosoma 14. Il riquadro Gene Summary del gene PSEN1, contiene le informazioni sul trascritto, sulla struttura esone/introne del gene e sulla proteina codificata. Navigare sul DNA CusMiBio Pag. 17

18 Nel menu in alto a sinistra sono presenti collegamenti che rimandano a informazioni sulla struttura del gene, sui suoi possibili splicing, sulle variazioni nucleotidiche e anche alle caratteristiche del trascritto e della proteina codificata. Cliccando sulla voce Export Gene Data, sempre sulla sinistra, è possibile scaricare le informazioni che interessano, come, ad esempio, un tratto della sequenza del genoma umano da analizzare ulteriormente con altri software o da utilizzare come sequenza di riferimento per nuovi esperimenti. Cliccando sulle coordinate alla voce Location, si apre la pagina in cui puoi osservare il gene sempre più nel dettaglio, così come hai fatto precedentemente per il gene BRCA2 con Region in detail e Alignment (text). Se tu fossi un biologo che lavora sul morbo di Alzheimer, potresti voler sapere se nei topi esiste un gene simile a quello umano; trovare un gene di questo tipo ti consentirebbe di usare il topo come organismo modello e ottenere ulteriori informazioni sulla malattia. Nel riquadro a sinistra, è possibile selezionare la voce Synteny. Scoprirai così che sul cromosoma 12 del topo esiste un gene molto simile al gene umano, tanto da essere indicato con la stessa sigla (ma in minuscolo!): Psen1. Navigare sul DNA CusMiBio Pag. 18

19 Cliccando sul gene Psen1 del topo è possibile evidenziare tutte le sue caratteristiche e confrontarle con quelle del gene umano. Navigare sul DNA CusMiBio Pag. 19