La tecnica del patch clamp

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1 La tecnica del patch clamp Era noto da lungo tempo che attraverso la membrana plasmatica è possibile un rapido scambio di ioni. Tuttavia, Neher e Sakmann a cavallo tra gli anni 70 e 80 furono i primi a mostrare l esistenza di canali ionici specifici Erwin Neher & Bert Sakmann Premi Nobel per la medicina nel 1991 per lo sviluppo della tecnica del patch-clamp rendendo possibile la caratterizzazione di singoli canali ionici

2 La tecnica del PATCH CLAMP L "idea di base del PATCH CLAMP fu sviluppata da Neher e Sakmann tra il 1976 e il Il principio è riassunto nella figura seguente. Impiega un solo microelettrodo in intimo contatto con la membrana cellulare Lo stesso elettrodo è impiegato sia per variare il potenziale che per misurare direttamente la corrente della membrana. E possibile caratterizzare, a secondo della configurazione usata, sia i canali ionici sottostanti l orifizio dell elettrodo, che quelli presenti in una parte o in tutta la membrana

3 Il setup per il patch-clamp microelettrodo microscopio micromanipolatore computer preparato oscilloscopio amplificatore gabbia di Faraday

4 La configurazione di cell-attached

5 Registrazione di una corrente elettrica che fluisce attraverso un singolo canale ionico Amplificatore Elettrodo di registrazione: micropipetta di vetro ~10-6 m Resistenza della saldatura: >1 GW Con un opportuno equipaggiamento elettronico e opportune condizioni sperimentali è possibile misurare questa corrente microscopica Quando un singolo canale si apre, gli ioni si muoveranno attraverso il canale come una corrente elettrica

6 Pipetta di vetro Spazio extracellulare Spazio intracellulare Membrana cellulare Formazione del Gigaseal R s = ohm R s =resistenza del seal R p =resist. della pipetta R in =resist. d ingresso V p =potenziale della pipetta Correnti di membrana dovute ad un singolo canale aperto o chiuso. A membrana elettricamente eccitabile B Membrana chimicamente eccitabile

7 Una registrazione da patch richiede una forte saldatura tra pipetta e membrana la qualità della misura dipende da quanto si riesce a minimizzare le perturbazioni della cellula. Nel caso di una registrazione di potenziale tale aspetto può essere rappresentato in questo modo. infatti: resistenza del seal Rs I=E K /(R K +R S ) I=V/R S V/R S =E K /(R K +R S ) V=E K R S /(R K +R S ) CIRCUITO EQUIVALENTE intracellulare extracellulare L elettrodo sta misurando il potenziale di riposo di una cellula la cui membrana contiene solo canali del K aperti. All aumentare della resistenza di seal R s, la misura si avvicina sempre di più al valore di E K

8 Seals buoni e cattivi Nel caso di una registrazione da patch, le correnti attraverso la saldatura (seal) non distorcono il voltaggio o la corrente misurati, ma si sommano al rumore della corrente. AMPL. seal buono seal cattivo evento di singolo canale In una registrazione da patch (cell-attached, inside- o outside-out), anche la corrente attraverso il seal fluisce lungo il circuito di misurazione, aumentando il rumore sulla corrente misurata. Ad es., se la corrente attraverso il seal è dieci volte più ampia di quella attraverso il canale, allora le fluttuazioni statistiche nel flusso di corrente prodotta dal seal sono 10 (316%) più ampie di quanto sarebbero in un seal perfetto.

9 La pipetta di vetro in questo caso ha una punta più grande di un elettrodo tradizionale, perchè non deve bucare la membrana plasmatica. Ha un diametro interno di µm ed è più o meno arrotondata. E' inserita in un portaelettrodo a tenuta, a sua volta collegato con un tubicino ad una fonte di suzione. Viene avvicinata alla cellula, ed a questo punto viene applicata una leggera pressione negativa; se tutto va bene, cellula ed elettrodo aderiscono saldamente. Non si ottiene solo un'adesione stabile meccanicamente (se la cellula è isolata e non aderisce al fondo della vaschetta è possibile sollevarla e spostarla a piacere), ma anche un sigillo ad altissima resistenza elettrica (Rs) (da 1 a centinaia di Gohm ohm), cioè tale da presentare una elevata resistenza al passaggio di corrente fuori dalla zona di contatto fra elettrodo (riempito anche qui di soluzione conduttrice) e membrana. In queste condizioni, se nell'area di membrana sottesa all'elettrodo, dell'ordine di pochi µm 2, ci sono dei canali ionici, la corrente che fluisce attraverso di essi quando sono nella conformazione "aperta" passerà attraverso l'elettrodo, senza disperdersi nello spazio esterno, e potrà essere rilevata da un sistema di amplificazione che abbia un rumore intrinseco sufficientemente basso (le correnti di singolo canale sono dell'ordine di pa). Questa configurazione, chiamata CELL ATTACHED PATCH, è quella di base, da cui si parte per tutte le successive modificazioni e applicazioni della tecnica. Essa consente quindi di effettuare registrazioni di singolo canale ( figura seguente) in condizioni in cui la cellula è intatta, il suo mezzo intracellulare imperturbato, in condizioni quindi il più libere possibile da artefatti sperimentali. Si lavora in VOLTAGE CLAMP, in quanto il voltaggio della pipetta è mantenuto ad un valore costante e che può essere variato a piacere con il potenziale di comando; in condizioni opportune è possibile misurare l'ampiezza della corrente in funzione del voltaggio applicato e ricavare informazioni sulla conduttanza di singolo canale.

10 Inconvenienti della configurazione di cell-attached patch Il principale inconveniente è che il potenziale di membrana (V m ) della cellula è sconosciuto, perchè nessun contatto con l'ambiente interno è stato realizzato, per cui è ignoto il valore della ddp (V c -V m ) presente ai capi del singolo canale di cui si misura la corrente. Per ricavarlo bisogna introdurre un elettrodo tradizionale (ma così si complicano di nuovo le cose), oppure distruggere il patch e passare alla configurazione WHOLE CELL (vedi sotto): a volte, più semplicemente, si prende un valor medio di Vm ottenuto con misurazioni separate, con tutti i limiti di una simile assunzione.

11 Sommando un gran numero di registrazioni di SCC sincronizzate, otterremo l evoluzione temporale della corrente macroscopica

12 Differenti tipi di Patch Whole-cell patch clamp: Simile alla tecnica di derivazione intracellulare. Una bassa resistenza di accesso produce registrazioni a basso rumore. Molti canali contribuiscono al segnale. Un certo tipo di canali viene isolato con protocolli di voltaggio e farmaci. Micropipetta Apertura mm Bassa resistenza Saldatura (50 MW) Membrana cellulare Una breve suzione rompe il patch di membrana Suzione Gigaseal (>1 GW) Corrente di leakage Corrente di membrana Il ponte citoplasmatico collassa Outside-out patch clamp: Usato per valutare la risposta di singoli canali al voltaggio e a sostanze extracellulari (neurotrasmettitori ecc.). Trazione Trazione Il ponte citoplasmatico collassa Trazione in un mezzo a basso Ca 2+ L esposizione all aria rompe la vescicola Inside out patch clamp: Usato per valutare la risposta di singoli canali al voltaggio e a sostanze intracellulari (secondi messaggeri ecc.). Resistenza dell elettrodo 2-10 MW

13 Configurazione di WHOLE-CELL Finora ci siamo riferiti alla condizione chiamata cell attached (A). Questa è necessaria per la registrazione delle correnti di singolo canale, ma non è l unica configurazione della tecnica del patch clamp. La condizione di whole cell (B) è quella più usata. Essa permette di registrare le correnti ioniche che attraversano tutta la membrana, effettuando un voltage clamp con un solo elettrodo anzichè due elettrodi Naturalmente la soluzione che riempie l elettrodo dev essere tale da perturbare il meno possibile la composizione ionica intracellulare. Che caratteristiche dovrà avere in linea di massima? Però le proteine intracellulari (protein-chinasi, calmoduline ecc.) vengono inevitabilmente dilavate.. Per aggirare questo problema, si può usare le tecnica del perforated patch, che consiste nel restare in cell-attached aggiungendo nell elettrodo delle molecole che formano canali ionici non selettivi, ad es. la Nistatina

14 Configurazione di whole cell patch-clamp E' l'applicazione della tecnica del PATCH CLAMP utilizzata per ottenere i risultati di un VOLTAGE CLAMP tradizionale. Sempre partendo dalla configurazione CELL ATTACHED, con un 'ulteriore suzione si può rompere il patch di membrana, e stabilire così un accesso diretto fra microelettrodo e citoplasma (vedi figura), senza, se tutto va bene, peggiorare la qualità del sigillo. perfusione elettrodo Cellula Cellattached patch suzione Whole-cell recording

15 L'accesso è migliore di quello che si può realizzare perforando la membrana plasmatica con un microelettrodo tradizionale, in quanto la resistenza della pipetta è minore, e la dispersione di corrente verso il mezzo esterno è minore, grazie al sigillo ad alta resistenza. Sempre a causa della bassa (massimo qualche Mohm) resistenza della pipetta (dovuta al suo diametro relativamente grande), il potenziale a cui è mantenuto l'elettrodo dal sistema elettronico di amplificazione e controllo può essere considerato in prima approssimazione lo stesso della cellula, e le correnti che fluiscono attraverso tutta la membrana cellulare possono essere registrate dall' elettrodo. Si possono così effettuare registrazioni di correnti totali in condizioni di VOLTAGE CLAMP utilizzando un solo elettrodo. Tutto questo è in realtà vero se forma e dimensioni della cellula sono adeguate; se no, il sistema non permette un mantenimento della costanza del potenziale in tutta l'estensione della cellula, cioè un vero VOLTAGE CLAMP. Un importante aspetto di questa configurazione è che, dato il grande diametro della via di accesso fra elettrodo e cellula, e dato che il volume dell'elettrodo è infinitamente più grande di quello della cellula, ci sarà un mescolamento fra i contenuti dei due scomparti, ed in sostanza l'ambiente citosolico si porterà in equilibrio con i soluti contenuti nell'elettrodo. Questo può essere importante in alcuni casi, in cui si vogliano effettuare registrazioni con un ambiente controllato sulle due facce della membrana, ma comporta l'inconveniente che componenti citosolici importanti per la risposta che si vuole studiare (enzimi, messaggeri interni) possono essere lavati via, diluiti. D'altra parte, se la cellula è di grosse dimensioni e/o di forma molto lontana da quella sferica, può essere molto difficile non solo ottenere un buon VOLTAGE CLAMP, ma anche una buona perfusione intracellulare.

16 LE ALTRE CONFIGURAZIONI DEL PATCH-CLAMP Dalla configurazione di cell-attached, con alcune manovre sperimentali, se ne possono ottenere delle altre, oltre a quella del whole-cell patch: - L'INSIDE OUT PATCH Se si ritrae l'elettrodo, è possibile, se il sigillo è molto buono, che il patch si stacchi insieme all'elettrodo. Si ha così (figura pagina seguente) un frammento di membrana, con uno o più canali ionici, sotteso all'orifizio dell' elettrodo, con la faccia citoplasmatica rivolta verso la soluzione presente nella vaschetta; questa soluzione può essere rapidamente e ripetutamente cambiata, e si può così studiare, ad esempio, il ruolo di messaggeri intracellulari nella regolazione delle proprietà dei canali ionici. Lo svantaggio è che, separando il canale dall'ambiente citoplasmatico, può andare perso un qualche fattore indispensabile per l'apertura del canale stesso, e difficilmente identificabile. - L'OUTSIDE OUT PATCH Quest'ultima configurazione può essere ottenuta ritraendo l'elettrodo dalla cellula dopo che si è realizzata la configurazione WHOLE CELL. Si forma un ponte citoplasmatico che può, spezzandosi, lasciare attaccato all'elettrodo un frammento di membrana plasmatica con la faccia esterna rivolta verso il contenuto della vaschetta, e quella citoplasmatica verso l'interno dell'elettrodo. Si possono così effettuare registrazioni di singolo canale, con l'opportunità in questo caso di cambiare facilmente la composizione del mezzo presente sulla faccia esterna della membrana, e studiare gli effetti di sostanze (agonisti, bloccanti) che possono influenzare le proprietà dei canali presenti in quel patch.

17 Configurazione di OUTSIDE-OUT Dalla configurazione whole cell si può facilmente passare alla configurazione di outside out, nella quale il patch presenta all esterno dell elettrodo il versante extracellulare della membrana.

18 Configurazione di OUTSIDE-OUT L outside-out è molto utile per studiare le correnti di singolo canale date dai recettori-canale, come ad esempio il recettore nicotinico per l acetilcolina

19 Configurazione di INSIDE-OUT La quarta config. è l inside out (B), nella quale il patch presenta all esterno dell elettrodo il versante intracellulare della membrana. La sua principale applicazione è nello studio dei canali chemiodipendenti attivati per via indiretta dal versante intracellulare, facendo arrivare sul patch ad es. proteine-g, o secondi messaggeri, o proteinchinasi, ecc.. Più avanti vedremo come questa configurazione sia stata fondamentale nello studio dei canali GIRK

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21 Alcune considerazioni generali sul patch clamp In tutti i quattro casi descritti sopra si parte, comunque, dalla formazione di un sigillo fra pipetta e membrana. Perchè questo possa avvenire è necessario che sia l'elettrodo che il mezzo in cui è tenuto il preparato siano il più puliti possibile, ma anche, che la membrana plasmatica della cellula da cui si vuole registrare non presenti detriti o sostanze che possano ostacolare il contatto col vetro della micropipetta. Per ridurre questi problemi è consigliato filtrare il mezzo dell'elettrodo subito prima del riempimento e di avvicinarsi alla cellula applicando una lieve pressione positiva che allontana eventuali frammenti dalla punta dell'elettrodo. Si può più facilmente realizzare una situazione di cellule pulite effettuando un leggero trattamento enzimatico, o utilizzando cellule isolate, dissociate enzimaticamente o in coltura. Ed è proprio lo sviluppo, soprattutto a partire dagli anni '70, delle tecniche di preparazione di colture cellulari che ha consentito la grande e rapida diffusione del PATCH CLAMP. Un successivo sviluppo, che ha avuto un impatto notevole in neurobiologia, è legato alla possibilità di lavorare su fettine di SN: è stato così possibile effettuare registrazioni da cellule che conservano, almeno in parte, le loro normali relazioni funzionali. Nonostante la tecnica sia stata sviluppata all'inizio soprattutto per poter registrare gli eventi di singolo canale, la configurazione più utilizzata è sicuramente quella di WHOLE CELL. Questo sviluppo, in parte imprevisto, è attribuibile a vari fattori.

22 Innanzitutto, le misure di singolo canale, molto importanti per determinare in maniera diretta le proprietà molecolari dei canali (cinetiche, meccanismi di blocco, ecc.) hanno senso compiuto solo se vengono utilizzate su preparati di cui siano note le proprietà elettrofisiologiche macroscopiche. Nel caso di molti tipi cellulari le cui proprietà sono state studiate solo nell'ultimo decennio, questo ha voluto dire fare prima (o comunque anche) gli esperimenti di WHOLE CELL. Grazie a questa tecnica è stato possibile studiare le proprietà elettrofisiologiche di piccoli neuroni, cellule ghiandolari, cellule muscolari lisce e cardiociti, fibroblasti, cellule epiteliali e linfociti, tutte cellule che era molto difficile studiare con le tecniche di VOLTAGE CLAMP tradizionali. Grazie a questi dieci e più anni di nuova elettrofisiologia, oltre che alle nuove tecniche di biologia cellulare e molecolare, è scaturito un panorama molto più vario e complesso della natura e del ruolo degli eventi elettrici a livello cellulare. Se la nuova tecnica ha consentito di allargare la nostra visione al di là dei preparati "classici", nervo e muscolo, ha avuto anche un impatto profondo sulla neurofisiologia: la possibilità di registrare dalle arborizzazioni dendritiche e dai terminali pre- e postsinaptici ha fatto sì che la concezione della cellula nervosa come semplice relè cedesse il posto ad una visione più complessa ed articolata, e che si potessero gettare le basi, a livello cellulare, della comprensione di fenomeni fondamentali come la memoria.

23 Ulteriori sviluppi ed applicazioni. In questi anni ci sono stati importanti sviluppi tecnici in varie direzioni (a parte l'uso delle fettine di SN cui abbiamo già accennato), per allargare le potenzialità della tecnica e cercare di superare alcuni suoi inconvenienti. Uno dei problemi principali legati all'uso del WHOLE CELL PATCH CLAMP, è come abbiamo visto, legato alla perfusione interna della cellula da parte del contenuto dell' elettrodo: questo problema è stato affrontato in due modi radicalmente diversi. Il primo approccio consiste nello sfruttare compiutamente questo fatto, realizzando un sistema che consenta di cambiare rapidamente la soluzione contenuta nell'elettrodo: se la cellula non è troppo grande si può pensare che in tempi relativamente rapidi (decine di secondi) le variazioni si ripercuotano sulla composizione dell 'ambiente intracellulare. E' una tecnica abbastanza difficile da usare come routine, ma è stata impiegata da vari laboratori per studiare gli effetti di messaggeri intracellulari sulla regolazione delle correnti ioniche. Una recente variazione sul tema consiste nell'uso dei cosiddetti caged compounds, molecole o ioni legati ad un inibitore da cui possono.essere liberate per fotolisi con un flash di luce UV. Si mette il composto caged nell'elettrodo, si realizza la condizione di WHOLE CELL, si inizia la registrazione, e poi si libera per fotolisi la sostanza (calcio, IP3' ecc.), la cui concentrazione aumenta così istantaneamente, consentendo di osservare eventuali effetti rapidi sulle correnti.

24 Il secondo approccio punta ad evitare gli inconvenienti della diluizione dei componenti citosolici solubili: questa modificazione della tecnica di base va sotto il nome di "perforated patch" o di "slow whole celi". Si tratta in sostanza di realizzare un CELL ATTACHED PATCH con un elettrodo riempito con una soluzione che contiene sostanze permeabilizzanti (ATP in alcuni casi, o più comunemente, nistatina o anfotericina, tutte molecole che formano pori ionici nelle membrane): le piccole molecole e gli elettroliti possono essere scambiati, mentre le macromolecole citosoliche non possono uscire dalla cellula. Si possono così effettuare registrazioni di eventi elettrici, anche in condizioni di VOLTAGE CLAMP, senza che la biochimica della cellula sia perturbata. Un altro tipo di misure che si può realizzare in condizioni di WHOLE CELL CLAMP è quello della capacità della membrana (con opportuni amplificatori): è stato così possibile, ad esempio, studiare in maniera quantitativa l'accoppiamento eccitamentoesocitosi in diversi preparati. Sono state infine effettuate registrazioni da strutture subcellulari isolate, come i mitocondri, la membrana nucleare, il reticolo endoplasmatico: da frazioni cellulari (il "whole terminal" patch su terminali presinaptici; il "perforated vescicle patch", che consiste nello staccare dalla cellula e trattenere nella pipetta, non un patch di membrana isolato, ma una vescicola contenente anche organelli subcellulari).

25 AMPLIFICATORI OPERAZIONALI L amplificatore operazionale ideale (A.O.) è essenzialmente, un amplificatore di tensione, avente le seguenti caratteristiche: guadagno infinito; ingresso differenziale; impedenza di ingresso infinita e impedenza di uscita nulla. V 1 : tensione sull ingresso invertente + V cc e - V cc :tensioni di alimentazione V + cc V 0 : tensione di uscita V 1 V 2 + V - cc V 0 V 2 : tensione sull ingresso non invertente

26 L AO può essere definito funzionalmente come un amplificatore differenziale, cioè un dispositivo attivo a tre terminali che genera al terminale di uscita una tensione proporzionale alla differenza delle tensioni fornite ai due terminali di ingresso. V 1 V 2 + V + cc V - cc = V 0 V 0 A V 2 A V 1 Il segnale di uscita V 0 è il risultato della somma tra il segnale applicato all ingresso invertente, V1, invertito di segno e amplificato di un fattore A -, con il segnale all ingresso non invertente, V2, a sua volta amplificato di fattore A +.

27 Compensazione dei potenziali di giunzione Un notevole contributo ai potenziali misurati presenti all uscita dell amplificatore è dato dalla somma dei vari potenziali di giunzione o di diffusione. Questi sono generati ogniqualvolta metalli (elettrodi) sono in contatto con soluzioni ioniche oppure soluzioni con diverse concentrazioni sono in contatto fra loro (punta del microelettrodo. Si può eliminare la somma di tutti questi potenziali introducendo, per mezzo del comando offset dell amplificatore, un potenziale di segno opposto quando il microelettrodo si trova nel bagno esterno, prima di penetrare la cellula.