Società Italiana di Fisiologia "Molecular and Cellular Biophysics of Excitable Cells Scuola di Fisiologia e Biofisica 2015, Pavia
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1 Società Italiana di Fisiologia "Molecular and Cellular Biophysics of Excitable Cells Scuola di Fisiologia e Biofisica 2015, Pavia Electrophysiology and imaging : methods Patch-clamp and calcium imaging recordings Masetto Sergio and Moccia Francesco
2 Electrophysiology Con il termine elettrofisiologia si indica una branca della fisiologia che ha come studio il funzionamento dell'organismo dal punto di vista elettrico. In particolare l'elettrofisiologia applicata al funzionamento elettrico delle cellule prende il nome di elettrofisiologia cellulare". L eccitabilità elettrica delle cellule dipende dai canali ionici.
3 I canali ionici Il canale ionico è una proteina transmembranaria Può essere aperto o chiuso, in funzione di voltaggio, ligando, tensione di membrana Può essere permeabile a una o più specie ioniche Il flusso netto di ioni può essere entrante o uscente (o zero) in dipendenza da Vm e V eq. Il patch-clamp è una tecnica utilizzata per registrare le correnti ioniche transmembranarie, ed è l unica che consente di risolvere le correnti che fluiscono attraverso i singoli canali ionici.
4 Il Patch-clamp Il patch-clamp è stato introdotta nel 1976 da due studiosi tedeschi, Erwin Neher e Bert Sakmann, ai quali per questa scoperta nel 1991 è stato conferito il premio Nobel.
5 Set-up da patch-clamp
6 Microscopio e pipette di registrazione
7 Con il patch-clamp è possibile variare il potenziale di membrana del patch (della cellula) e nel contempo registrare le correnti di singolo canale (macroscopiche) Cell-attached Inside-out Pull Suction Pull Whole-cell Outside-out
8 Cell-attached: singolo canale Le condizioni che modificano il gating dei canali ionici agiscono non sulla conduttanza, ma bensì sulla probabilità del canale di trovarsi nello stato aperto o nello stato chiuso.
9 La corrente macroscopica rappresenta il comportamento medio del singolo canale (per N canali)
10 La cinetica della corrente macroscopica riflette quella di singolo canale I = N * i * P o
11 Le bibbie : Ion channels of excitable membranes. B. Hille. Single-channel recording. Sakmann & Neher. Whole-cell: correnti macroscopiche Cell-attached
12 Whole-cell: risposta in voltaggio
13 Patch-clamp e eso/endocitosi Patch-clamp e mutagenesi E
14 Patch-clamp e fluorescenza Se alla soluzione intrapipetta si aggiunge un colorante fluorescente, è possibile visualizzare i dettagli della morfologia cellulare.
15 Ca 2+ imaging Se la sostanza aggiunta nella soluzione intracellulare emette fluorescenza in risposta all aumento della concentrazione di Ca 2+, esempio Fura-2 o Calcium Green-1, è possibile combinare il patch-clamp con misure fluorimetriche della concentrazione del Ca 2+.
16 Patch-clamp e optogenetica La tecnica optogenetica consente di controllare il potenziale di membrana di cellule geneticamente sensibilizzate alla luce. Questo è possibile grazie all espressione indotta, nella membrana cellulare, di proteine-canale quali ad esempio le channelrhodopsin normalmente espressa dalle alghe, il cui gating viene modulato dalla luce. IPSCs IPSCs Correnti postsinaptiche inibitorie (IPSC) registrate in un topo transgenico ingegnerizzato per esprimere la channelrhodopsin-2 (ChR2) nei neuroni GABAergici. La cellula postsinaptica non è GABAergica (ChR2-negativa). La luce blu produce una depolarizazione delle fibre afferenti GABAergiche, che esprimono ChR2, inducendo rilascio di GABA. Le barre blu indicano il tempo di illuminazione.
17 In conclusione Nonostante l età, il patch-clamp rimane la tecnica d elezione per la caratterizzazione delle proprietà più fini dei canali ionici, e più in generale della eccitabilità cellulare. Anzi, il suo potenziale è ulteriormente aumentato grazie all associazione con nuove metodologie, a dimostrazione delle notevole versatilità di questa tecnica.
18 Grazie per l attenzione
Patch clamp - 2. Bisogna avere:
Patch clamp - 1 La tecnica del voltage clamp ci ha permesso di studiare le correnti ioniche transmembranarie (ovvero le variazioni di conduttanza della membrana), in particolare quelle che sostengono i
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