Genetic engineering of Staphylococcus gallinarum for overproduction of the lantibiotic gallidermin

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1 DISS. ETH NO Genetic engineering of Staphylococcus gallinarum for overproduction of the lantibiotic gallidermin A dissertation submitted to the ETH Zurich for the degree of Doctor of Sciences presented by Giorgia Valsesia Dipl. Natw., ETH Zurich born on January 18 th, 1977 from Contone (TI) accepted on the recommendation of Prof. Dr. Sven Panke (ETH Zurich, Switzerland), examiner Prof. Dr. Brigitte Berger-Bächi (University of Zurich, Switzerland), co-examiner PD Dr. Wolfgang Minas (Biotech Concepts GmbH, Switzerland), co-examiner 2008

2 Abstract Antibiotic resistance has spread dramatically throughout the last two decades, particularly in hospitals, and it is threatening to undermine the ability to treat infections, as even drugs that once served as a last resort are losing their potency. As the number of resistant pathogens continues to grow, the number of new antibiotics to fight them is steeply declining. Therefore, the development of new antimicrobial agents is essential. Class I lantibiotics are cationic, amphiphilic peptides produced by a wide range of Gram-positive bacteria and show bactericidal activity against other Gram-positive bacteria. They show a dual mode of action at nanomolar concentrations, which involves pore formation and inhibition of peptidoglycan biosynthesis by specific interaction with cell wall precursor lipid II. Lantibiotics are ribosomally synthesized and undergo posttranslational modifications resulting in the formation of unusual residues like the thioether amino acids lanthionine and methyllantionine, which are crucial for a proper functional structure. So far, no lantibiotic has been developed into a clinical product, even though nisin has proven its potential to treat peptic ulcers caused by Clostridium difficile and Helicobacter pylori, gallidermin is effective against acne caused by Propionibacterium acnes and bovine mastitis caused by Staphylococcus aureus, and mersacidine can treat MRSA infections in mice. The major obstacle to the clinical development of class I lantibiotics is their generally very low production titer, which is a consequence of their toxicity for the producing strains. Attempts to improve volumetric productivity have been carried out, but generally failed to provide significant increase in titer. Gallidermin is a tetracyclic, 21 amino acids class I lantibiotic peptide, which is produced by the non-pathogenic S. gallinarum Tü3928, and shows broad-spectrum activity against important pathogens like S. aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus faecalis, and P. acnes. Gallidermin (6L-epidermin) is closely related to epidermin, which is synthesized by the class II strain S. epidermidis Tü3298. Biosynthesis, modification, secretion, and activation of epidermin have been broadly studied. Since gallidermin and epidermin have a high degree of identity on DNA and protein level, and several genes of the two gene clusters have been shown to be interchangeable, many i

3 assumptions on gallidermin biosynthesis and function have been made based on previous research on epidermin. In this study, various genetic engineering strategies have been followed in order to enhance the production of gallidermin and to develop a production strain suitable for an industrial-scale production process. These strategies include circumventing the effect of gallidermin toxicity by producing an inactive precursor molecule, increasing mrna template concentration for gallidermin overproduction, and heterologous production of gallidermin. The first strategy lead to a mutant that produced pregallidermin to a 50% higher molar titer than the wild-type S. gallinarum, suggesting that the absence of self-toxicity has a beneficial effect on gallidermin production. The second approach, which resulted to be very difficult due instability and recombination of plasmid vectors, did not lead to increased pregallidermin titers. Finally, among the many strains tested for pregallidermin heterologous production, only S. aureus produced pregallidermin in detectable quantities. Extensive efforts are still required for the implementation of an industrial-scale gallidermin production process. Nevertheless, this study has contributed with the development of a suitable strategy for overproduction, which might be adequate to an industrial context, and elucidated the problems and drawbacks of several other genetic strategies for gallidermin overproduction. ii

4 Riassunto Il fenomeno della resistenza agli antibiotici si è diffuso sempre più ampiamente negli ultimi decenni, soprattutto negli ospedali, e oggi minaccia di compromettere l abilità dei medici nel trattare con successo importanti infezioni batteriche, poiché anche l efficacia degli antibiotici, usati come ultima risorsa, sta scemando. E, mentre il numero di microorganismi patogeni continua a crescere, il numero di nuovi antibiotici per combatterli diminuisce costantemente. Per questo motivo è essenziale e necessario sviluppare nuovi agenti antimicrobici. I lantibiotici di classe I sono peptidi cationici e anfifilici, prodotti da una vasta gamma di batteri Gram-positivi, che mostrano un azione battericida contro altri batteri Gram-positivi. A concentrazioni nanomolari mostrano un duplice meccanismo di azione, che implica la formazione di pori nelle membrane cellulari e l inibizione della biosintesi dello strato peptidoglicanico, grazie a un interazione specifica con il lipide II, un precursore della parete cellulare. I lantibiotici sono prodotti della sintesi ribosomale e sono sottoposti a modificazioni post-traslazionali, che si manifestano nella formazione di amminoacidi inusuali, quali la lantionina e la metillantionina, contenenti gruppi tioeteri che sono essenziali per l assunzione di una struttura funzionale adatta. Finora nessun lantibiotico è stato sviluppato in un prodotto clinico, nonostante siano stati dimostrati l efficacia della gallidermina contro l acne, causata da Propionibacterium acnes, della mersacidina contro le infezioni causate da MRSA in un modello murino e il grande potenziale della nisina nella cura delle ulcere peptiche causate da Clostridium difficile e Helicobacter pylori. Il maggior ostacolo per lo sviluppo clinico dei lantibiotici di classe I è il basso titer di produzione, dovuto alla loro tossicità verso i ceppi produttori. In passato, sono stati fatti vari tentativi per migliorarne la produttività volumetrica, senza mai sfociare in un aumento significativo della loro concentrazione finale. La gallidermina è un rappresentante dei lantibiotici di classe I, è formata da 21 amminoacidi e presenta una struttura tetraciclica. È prodotta da S. gallinarum Tü3928, un batterio apatogeno (classe I), e mostra un attività a largo spettro contro importanti patogeni, quali S. aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus faecalis, e P. acnes. La gallidermina (6L-epidermina) è molto simile all epidermina sintetizzata dal ceppo di classe II S. epidermidis Tü3298. Nel caso dell epidermina, la biosintesi, la modificazione, la iii

5 secrezione e l attivazione sono state dettagliatamente studiate. Dato l alto grado di identità sia a livello di DNA che proteico tra la gallidermina e l epidermina e, essendo stato dimostrato che diversi geni dei due cluster genetici sono intercambiabili, sono state fatte molte supposizioni sulla biosintesi e sulla funzione della gallidermina, basate su precedenti ricerche sull epidermina. In questo studio sono state seguite diverse strategie di ingegneria genetica al fine di aumentare la produzione di gallidermina e di sviluppare un ceppo adeguato a un processo di produzione su scala industriale. Queste includono la produzione di un precursore inattivo della gallidermina così da evitare il suo effetto tossico, l aumento della concentrazione dei trascritti dei geni del suo cluster e la sua produzione eterologa. La prima strategia ha portato alla generazione di un mutante che produce pregallidermina a concentrazioni molari del 50% più alte rispetto al wild-type S. gallinarum, suggerendo che l assenza di tossicità ha effettivamente un effetto benefico sulla produzione di gallidermina. Il secondo approccio è risultato essere difficoltoso a causa dell instabilità e della ricombinazione dei vettori di produzione e non ha portato a un miglioramento dei titer di produzione della pregallidermina. Infine, tra i vari microorganismi testati per la produzione eterologa di pregallidermina, solo S. aureus è risultato produrla in concentrazioni rilevabili. Ampi studi sono dunque tuttora necessari per l implementazione di un processo di produzione di gallidermina su scala industriale. Ciò nonostante questo studio rappresenta un importante contributo, poiché fornisce una strategia adeguata per la sovrapproduzione di gallidermina, che potrebbe essere rilevante anche in un contesto industriale, e elucida problemi e svantaggi di altre strategie di ingegneria genetica. iv