1. LA RISPOSTA IMMUNITARIA CONTRO I TUMORI

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1 1. LA RISPOSTA IMMUNITARIA CONTRO I TUMORI 1.1 La teoria dell immunosorveglianza Agli inizi del 1900, Paul Ehrlich postulò che cellule maligne si formino frequentemente nel corso della vita e che sul loro plasmalemma compaiano continuamente nuove molecole antigeniche contro le quali l ospite può produrre una risposta anticorpale che, nella maggior parte dei casi, sarebbe sufficiente ad eliminare gli elementi neoplastici. Cinquant anni più tardi Thomas sviluppò l ipotesi che, nel corso dell evoluzione della specie, lo sviluppo dell immunità cellulare venisse stimolato dalla necessità di rigettare le cellule maligne insorte per mutazione somatica. La forma più radicale di teoria del controllo immune fu sviluppata da Burnet nel corso degli anni 70, sotto la spinta della scoperta dei meccanismi immunologici del rigetto dei trapianti da parte dei linfociti T, ed è nota come Teoria dell immunosorveglianza. Burnet ipotizzò che i meccanismi di rigetto, estremamente precisi ed efficienti, fossero deputati all'eliminazione delle cellule potenzialmente neoplastiche. Burnet coniò il termine sorveglianza immunologica per definire la capacità dell ospite di riconoscere tempestivamente i cloni cellulari maligni non appena emergono, in modo da distruggerli prima che la massa 4

2 tumorale possa raggiungere dimensioni critiche. La teoria dell immunosorveglianza fu inizialmente sostenuta dal riscontro sulla superficie cellulare di tumori sperimentali di antigeni di istocompatibilità tumore-specifici (TSTA, Tumor Specific Transplantation Antigen), in grado di provocare il rigetto di tumori innestati in animali preimmunizzati mediante innesto di tumore seguito da ablazioni chirurgiche, oppure mediante inoculo di cellule tumorali uccise. Successivamente la teoria dell immunosorveglianza nella sua formulazione originale fu messa in crisi dalla dimostrazione che i TSTA, e con loro una reazione immunitaria specifica antitumorale, sono espressi sulla superficie cellulare di tumori sperimentali indotti da virus e da sostanze chimiche, mentre non sono espressi su quelle di tumori spontanei dell animale e dell uomo. L ipotesi che le cellule delle neoplasie spontanee, pur incapaci di suscitare una forte reazione di rigetto, debbano differire da quelle normali per qualche caratteristica immunologicamente evidenziabile è tuttavia sopravvissuta al declino della teoria dell immunosorveglianza. E attualmente noto che in molti casi di tumori umano le cellule neoplastiche differiscono da quelle normali non perché posseggono antigeni assolutamente specifici per il tumore, ma perché presentano sulla loro superficie forme molecolari presenti sulle cellule normali solo in particolari fasi di differenziazione o in particolari tessuti. Contro queste proteine, denominate complessivamente antigeni tumore-associati (TAA, Tumor Associated Antigen), si può sviluppare una risposta immunitaria come dimostrato dal riscontro, nel sangue periferico di pazienti con tumore, di T linfociti capaci di reagire con peptidi derivati da tali antigeni. La reazione immune ed infiammatoria che ne deriva, documentata dalla 5

3 frequente presenza di infiltrati di linfociti, macrofagi e granulociti, è tuttavia generalmente debole ed inefficace. 1.2 Immunogenicità dei tumori Sebbene i tumori derivino da tessuti autologhi, essi esprimono sulla superficie cellulare molecole riconosciute come estranee al sistema immune. Questo avviene a causa dell elevata frequenza di mutazioni che caratterizza le cellule neoplastiche, oppure a causa dell espressione deregolata di geni normali che portano alla produzione di proteine non mutate. Inoltre, i tumori causati da virus trasformanti (o oncògeni) possono esprimere proteine virali, per lo più proteine nucleari, che hanno un ruolo nel mantenimento dello stato trasformato (canceroso). [Roitt I. et al., 2000] I prodotti di geni mutati, deregolati o virali possono essere riconosciuti come estranei dai linfociti T o B, in quanto essi non erano espressi sui tessuti autologhi precedentemente allo sviluppo del tumore, o erano espressi a livelli sufficientemente bassi da non indurre tolleranza. Queste proteine possono pertanto stimolare risposte immuni specifiche contro le cellule tumorali. Alternativamente, i prodotti di geni mutati o deregolati possono determinare la sintesi anormale di molecole non proteiche, quali carboidrati e lipidi, che possono essere riconosciuti come antigeni tumorali dai linfociti B. Inoltre, proteine di membrana espresse sui tumori in mancanza di molecole MHC di classe I possono funzionare come bersaglio per cellule effettrici dell immunità innata, come le cellule NK. Gli antigeni tumorali possono essere classificati in base al profilo di espressione. 6

4 Il primo gruppo comprende gli antigeni tumore-specifici (TSA, Tumor Specific Antigen) che sono espressi esclusivamente su cellule tumorali e che sono quindi potenzialmente in grado di evocare una risposta immune spontanea dell ospite in quanto riconosciuti come antigeni estranei. Il secondo gruppo comprende gli antigeni tumore-associati (TAA, Tumor Associated Antigen) che, invece, sono espressi anche su cellule normali ma che compaiono sulla superficie delle cellule tumorali in modo abnorme per quantità, sede e tempo; essi soltanto raramente inducono una risposta immune dell ospite in quanto nei loro confronti esso è generalmente tollerante. I tipi principali di antigeni tumorali appartenenti al gruppo dei TSA sono: Prodotti di oncogeni mutati: gli oncogeni cellulari, o c-onc o protooncogeni, sono sequenze di DNA analoghe a quelle degli oncogeni virali, o v-onc. La loro funzione primaria sembra essere quella di intervenire nella regolazione della crescita e del differenziamento cellulare. I proto-oncogeni possono essere alterati per mutazioni puntiformi, delezioni o traslocazioni cromosomiche indotte da carcinogeni, così da formare oncogeni i cui prodotti posseggono attività trasformante. Le mutazioni a livello di alcuni oncogeni sono ricorrenti in molti tumori diversi, presumibilmente perché solo alcune mutazioni conferiscono un vantaggio di crescita alle cellule: un tipico esempio sono le mutazioni nella posizione 12 della proteina p21 ras, riscontrabili in circa il 10 % dei carcinomi mammari. [Shu S. et al., 1997] Prodotti di geni oncosoppressori mutati: i geni oncosoppressori 7

5 codificano per proteine coinvolte nella normale crescita e differenziazione cellulare. Mutazioni a carico di questi geni tali da rendere il loro prodotto inattivo possono portare alla trasformazione neoplastica, Un esempio di antigene tumorale derivato da una mutazione a carico di un gene oncosoppressori è rappresentato dall antigene p53, che è presente nella metà circa dei tumori mammari. [Houbiers J.G.A. et al., 1993] Prodotti di geni virali in tumori maligni associati ad infezioni virali: sia virus a DNA sia a RNA sono implicati nello sviluppo di tumori sia sperimentali che spontanei. Tali tumori presentano di solito il genoma provirale integrato nel patrimonio genetico delle cellule ospiti. Le cellule neoplastiche esprimono spesso antigeni codificati dal genoma virale; le relative proteine vengono sintetizzate endogenamente e processate, e i complessi costituiti dai peptidi virali e dalle molecole MHC di classe I vengono quindi espressi sulla membrana. Di conseguenza le cellule tumorali che esprimono antigeni virali possono stimolare una risposta linfocitaria T specifica e diventare il bersaglio elettivo. Esempi di questi tipi di antigeni tumorali sono prodotti genici del virus del papilloma umano nel carcinoma della cervice uterina, prodotti del virus di Epstein-Barr nel linfoma di Burkitt e nel carcinoma naso-faringeo. Prodotti di geni normalmente silenti: alcuni geni non sono in genere espressi sui tessuti normali o lo sono solo le fasi precoci dello sviluppo, prima che siano operativi i meccanismi della tolleranza verso il self. Quando questi geni vengono deregolati in seguito alla trasformazione neoplastica delle cellule e vengono espressi in modo 8

6 inappropriato, cioè nel tessuto sbagliato e nel momento sbagliato, i loro prodotti possono comportarsi come antigeni tumorali ed evocare una risposta immune. Esempi di questo tipo di antigene sono i geni MAGE, BAGE, GAGE nel melanoma. [Van Pel A. et al., 1995] Gli antigeni TAA, condivisi da cellule tumorali e normali, possono essere raggruppati in : Antigeni oncofetali: sono proteine di norma espresse durante lo sviluppo tissutale nel feto, ma non nei tessuti differenziati dell adulto. La presenza di queste proteine sulle cellule tumorali è dovuta ad una derepressione genica che si verifica attraverso meccanismi ancora non chiariti. L espressione degli antigeni oncofetali nell adulto non è rigidamente limitata alle cellule tumorali: sono infatti dimostrabili in diversi tessuti in corso di molte condizioni infiammatorie e, seppur in piccole quantità, anche in tessuti normali. Gli antigeni oncofetali non sono immunogenici per l ospite durante lo sviluppo. Esempi di tali antigeni sono l αfetoproteina (AFP), elevata in corso di carcinoma epatocellulare, tumori a cellule genitali, carcinomi dello stomaco e del pancreas, e l antigene carcino-embrionale (CEA), elevato in corso di carcinoma del colon, del pancreas, dello stomaco, della mammella e del polmone. [Tsang K.Y. et al., 1995] Antigeni glicolipidici e glicoproteici alterati: alterazioni nell aggiunta sequenziale di residui carboidratici al nucleo lipidico o proteico possono determinare modificazioni delle caratteristiche della superficie cellulare in grado di condizionare alcuni aspetti del fenotipo maligno dei tumori, quale l invasione tissutale ed il 9

7 comportamento metastatico. Appartengono a questa classe di TAA i gangliosidi, gli antigeni dei gruppi ematici e le mucine, di cui li esempi più comuni sono gli antigeni CA-125, CA 19-9 e MUC-1. Antigeni di differenziazione: questi sono antigeni tessuto-specifici espressi transitoriamente sulle cellule normali in alcune fasi differenziative, e presenti stabilmente sulle controparti neoplastiche delle stesse. Queste proteine sono molto importanti sotto il profilo clinico, potendo essere impiegabili come marcatori diagnostici per l identificazione dell istotipo di origine della neoplasia, o come bersaglio per l immunoterapia. Sono esempi gli antigeni di differenziazione dei linfociti che caratterizzano i linfomi da essi derivati (CD10 o GALLA, CD25 o recettore per l IL-2), oppure alcuni antigeni di mielosa (S-100 o neural crest derived antigen). [Kuby J., 1995] 1.3 Cellule effettrici dell immunità antitumorale Gli antigeni tumorali evocano in vivo sia risposte umorali sia cellulari. In vitro molti meccanismi effettori immunologici sono in grado di uccidere le cellule tumorali, ma resta ancora da stabilire quali di questi meccanismi siano realmente importanti nell indurre in vivo risposte immuni protettive nei confronti dei tumori spontanei e come potenziarli in modo il più possibile specifico per il tumore. Le cellule effettrici coinvolte nell uccisione di cellule tumorali sono i linfociti T, le cellule Natural Killer, i macrofagi ed i linfociti B mediante la secrezione di anticorpi. 10

8 1.3.1 Linfociti T I linfociti T citotossici (CTL) costituiscono una sottopopolazione di linfociti T in grado di uccidere cellule bersaglio esprimenti peptidi antigenici associati a molecole MHC. Essi ricoprono un ruolo importante nel riconoscimento e nell eliminazione di cellule self modificate, quali le cellule neoplastiche, come dimostrato in numerosi studi sperimentali di trapianto di tumore in animali da esperimento. Nell uomo è dimostrata la presenza di CTL nel sangue periferico di pazienti con carcinomi o melanomi in fase avanzata in grado di lisare cellule tumorali espiantate dallo stesso paziente. Peraltro, l importanza dei CTL nell immunosorveglianza contro i tumori spontanei non indotti da virus è incerta, dato che questi tumori non insorgono con maggior frequenza in animali o soggetti con deficit, spontaneo o indotto, a carico del compartimento T. Anche le cellule mononucleate derivate dall infiltrato infiammatorio di tumori solidi umani, denominate linfociti infiltranti il tumore (TIL), comprendono CTL capaci di uccidere le cellule tumorali da cui sono state isolate, sebbene queste risposte citotossiche non siano probabilmente efficaci di per sé ad eradicare la maggior parte dei tumori, il potenziamento di queste risposte è un promettente approccio alla terapia anti-tumorale in un prossimo futuro. La risposta immune CTL-mediata può essere suddivisa in due fasi che riflettono i diversi aspetti delle risposte dei linfociti T citotossici. La prima fase coinvolge l attivazione e il differenziamento delle cellule TC in 11

9 CTL effettori funzionali, mentre nella seconda i CTL riconoscono i complessi antigene-mhc di classe I presenti sulle cellule bersaglio specifiche, iniziando una sequenza di eventi che culmina con la distruzione di queste ultime.. Le cellule TC quiescenti non sono in grado di uccidere e sono quindi considerate come precursori dei CTL che si differenzieranno in CTL funzionali con attività citotossica solo dopo essere stati attivati. La generazione di CTL da precursori richiede diversi segnali: il primo viene fornito quando il recettore della cellula T, il CD8, il CD2 e LFA-1 interagiscono con un complesso peptide antigenico-mhc di classe I, LFA- 3 ed ICAM-1 o -2 presenti sulla membrana di una cellula bersaglio; un secondo segnale viene dato da citochine prodotte da cellule T H CD4 + attivate. L IL-2 è la principale citochina richiesta per il differenziamento in CTL effettori, ma è stato mostrato che anche un certo numero di altre citochine (IL-4, IL-6 ed IFN-γ) gioca un ruolo in questo processo. I primi eventi della citotossicità CTL-mediata sono la formazione del legame fra le due cellule, l attacco alla membrana, la dissociazione del CTL e la distruzione della cellula bersaglio. Alla formazione del coniugato segue una fase Ca + -dipendente che richiede energia, in cui il CTL infligge un danno alla membrana della cellula bersaglio. Questa, in un periodo di tempo variabile da 15 minuti a 3 ore dopo la dissociazione del CTL, va incontro a lisi. Il complesso di membrana TCR-CD3 presente sul CTL riconosce l antigene in associazione a molecole di MHC di classe I presente sul bersaglio. In seguito a questo riconoscimento antigene-specifico, il recettore integrinico LFA-1 sui CTL si lega alle molecole di adesione intercellulare sulla cellula bersaglio. In uno studio di Dustin e Springer 12

10 venne messo in evidenza il fatto che l attivazione antigene-mediata del CTL converte l LFA-1 da uno stadio a bassa avidità ad uno stadio ad alta avidità. A causa di questo fenomeno, i CTL aderiscono e formano complessi solo con appropriate cellule bersaglio che mostrano peptidi antigenici associati con molecole MHC di classe I. L LFA-1 persiste in uno stadio ad alta avidità solo per 5-10 minuti dall attivazione e poi ritorna ad uno stadio a bassa avidità facilitando la dissociazione del CTL. Immediatamente dopo la formazione del complesso, l apparato di Golgi e i granuli contenenti alcuni proteoglicani ad alto peso molecolare,varie citochine tossiche, una proteina chiamata perforina e una famiglia di sette esterasi dette granzimi, si orientano nel citoplasma del CTL concentrandosi vicino alla giunzione con la cellula bersaglio. I monomeri di perforina vengono poi rilasciati dai granuli mediante esocitosi nello spazio giunzionale fra le due cellule. Quando i monomeri di perforina vengono a contatto con la membrana della cellula bersaglio, subiscono un cambiamento conformazionale, esponendo un dominio anfipatico che si inserisce nella membrana; i monomeri poi polimerizzano in presenza di Ca + e formano un poro cilindrico con un diametro interno di 5-20 nm. Si pensa che questi pori facilitino l ingresso di varie sostanze litiche che distruggono la cellula bersaglio. Una singola cellula CTL è in grado di uccidere molte cellule bersaglio tuttavia non viene danneggiata da questo processo. Un ipotesi avanzata è che il CTL abbia una proteina di membrana chiamata protectina, che inattiva la perforina prevenendo la sua inserzione nella membrana del CTL o impedendo la sua polimerizzazione. [Young J.D.E, Cohn Z.A.., 1998] Una seconda ipotesi è che la perforina non venga rilasciata in forma 13

11 solubile, ma piuttosto in piccole vescicole membranose immagazzinate nei granuli dei CTL.[Peter P.J., 1990] Sebbene i linfociti T helper CD4 non abbiano in genere una funzione citotossica, essi possono svolgere un ruolo nelle risposte anti-tumorali fornendo le citochine necessarie per un efficace sviluppo dei CTL quali, ad esempio, l IL-2 che è in grado di attivare anche i macrofagi, le NK ed i linfociti B. I linfociti T helper attivati da antigeni tumorali possono inoltre secernere TNF e IFN-γ, in grado di potenziare l espressione di MHC di classe I da parte di cellule tumorali e, quindi, la sensibilità alla lisi mediata da CTL. Un piccolo numero di tumori che esprimono molecole MHC di classe II può attivare direttamente i linfociti T helper CD4 tumore-specifici, ma comunemente sono le APC professionali che processano e presentano le proteine internalizzate che derivano da cellule tumorali morte o fagocitate Le cellule natural killer Le cellule NK costituiscono una sottopopolazione di linfociti presente nel sangue periferico e nei tessuti linfoidi. Derivano dal midollo osseo e si presentano come linfociti di grandi dimensioni dotati di numerosi granuli citoplasmatici; per tale motivo sono talvolta denominate grandi linfociti granulari o LGL. Dati sperimentali ed epidemiologici suggeriscono che le cellule NK svolgono un importante ruolo nell immunosorveglianza, ma solo nei confronti di tumori in via di sviluppo, specialmente quando questi esprimono antigeni di origine virale. 14

12 Le cellule NK possono interagire con le cellule tumorali in due modi differenti: possono entrare in contatto diretto con i loro bersagli in modo non specifico e non mediato da anticorpi, oppure possono legare anticorpi fissati sulla superficie della cellula tumorale. Molte cellule NK, infatti, esprimono il CD16, un recettore di membrana specifico per l estremità carbossi-terminale dell anticorpo. Queste cellule possono pertanto interagire con anticorpi anti-tumore fissati sulle cellule neoplastiche e distruggerle. Questo processo è denominato citotossicità cellulo-mediata dipendente da anticorpi (ADCC). La lisi della cellula bersaglio mediante ADCC non coinvolge il complemento, ma un certo numero di meccanismi citotossici. Le NK, così come i monociti attivati ed i macrofagi, secernono il fattore di necrosi tumorale (TNF-α) che ha un effetto citotossico; inoltre esse contengono dei granuli citoplasmatici di perforina che causa un danno alla membrana. E stato dimostrato che le NK uccidono la cellula bersaglio mediante apoptosi: un certo numero di molecole citotossiche, incluso il TNF-α, possono iniziare il processo di apoptosi. Si è scoperto che le cellule NK uccidono cellule tumorali e cellule infettate da virus anche se non possiedono recettori antigene-specifici perché possiedono recettori per l MHC di classe I ed in realtà riconoscono una diminuita espressione di quest ultimo sulle cellule modificate che diventano quindi il loro bersaglio. Diversi studi suggerirono l esistenza di questi recettori e spiegarono come l interazione con le molecole di classe I sulle cellule bersaglio inibisse la distruzione delle stesse. Al contrario, se i bersagli mancavano di MHC di classe I o ne esprimevano livelli particolarmente bassi, i recettori delle NK non erano impiegati interamente 15

13 e quindi uccidevano le cellule bersaglio. Questa teoria fu supportata da altri studi che dimostravano una relazione inversa tra il livello di molecole MHC di classe I espresse su una cellula e la sua suscettibilità alla lisi NK-mediata. Ad esempio fu dimostrato che cellule murine di una linea cellulare deficiente per la classe I venivano prontamente uccise dalle cellule NK, ma se transfettate con geni per molecole MHC di classe I, le cellule diventavano resistenti alla lisi. [Kuby J., Immunologia ] I macrofagi I macrofagi svolgono un ruolo importante nelle interazioni bidirezionali fra immunità innata ed acquisita. Rappresentano un elemento potenzialmente molto importante nell immunità antitumorale, infatti, numerose osservazioni in vitro dimostrano che i macrofagi attivati sono in grado di lisare preferenzialmente cellule tumorali rispetto a cellule normali. Come le cellule NK, i macrofagi esprimono recettori per le porzioni Fc delle immunoglobuline con cui possono indirizzare la loro attività citocida verso cellule ricoperte da anticorpi. La lisi delle cellule tumorali da parte dei macrofagi è probabilmente mediata da numerosi meccanismi diversi, alcuni dei quali sostanzialmente identici a quelli utilizzati per l uccisione di microrganismi, quali il rilascio di enzimi lisosomiali e di radicali dell ossigeno. L uccisione della cellula tumorale può avvenire anche tramite la secrezione da parte dei macrofagi attivati di TNF-α. Questa citochina è in grado di uccidere le cellule tumorali, ma non quelle normali, attraverso un effetto tossico diretto. Il TNF-α si lega ai recettori ad alta affinità espressi 16

14 sulla membrana elle cellule tumorali e uccide le cellule bersaglio tramite vari meccanismi: attivazione di una via di morte cellulare simile a quella attivata dall interazione del ligando di Fas con Fas, produzione di radicali liberi non contrastata nelle cellule neoplastiche da adeguata sintesi di superossido-dismutasi in risposta al TNF-α, azione sulle proteine del citoscheletro con sovvertimento della normale architettura cellulare. Il TNF-α può causare necrosi tumorale anche indirettamente, inducendo in vivo una trombosi della rete vascolare del tumore. Numerose osservazioni sembrerebbero indicare che il TNF-α possa agire selettivamente sulla rete vascolare intratumorale, in quanto alcuni fattori angiogenetici di derivazione tumorale, come il fattore di crescita endoteliale, potenzierebbero la risposta delle cellule endoteliali al TNF-α Gli anticorpi Sebbene i linfociti T svolgano un ruolo più importante degli anticorpi nel mediare le risposte immuni antitumorali, i pazienti neoplastici producono effettivamente anticorpi diretti contro antigeni tumorali. In alcuni casi di tumori virus associati, queste risposte sono specifiche per antigeni virali, mentre in altri casi i pazienti affetti da tumore producono anticorpi rivolti verso il proprio tumore. In questi casi gli antigeni individuati sono quasi sempre espressi anche da tessuti normali. Non esiste nessuna evidenza a favore di un ruolo protettivo di queste risposte umorali nei confronti dello sviluppo e della crescita dei tumori. La potenziale funzione per una distruzione anticorpo-mediata è stata dimostrata un vitro e si basa sull attivazione del complemento, determinando l assemblaggio sulla membrana del complesso di attacco 17

15 (membrane complex attac, MAC), la formazione di pori e la lisi delle cellule. Alcuni tumori, tuttavia, sono in grado di fagocitare il foro formato dal MAC e di riparare la membrana prima che la cellula venga lisata. Un meccanismo alternativo di distruzione si basa sulla citotossicità cellulare anticorpo dipendente madiata da macrofagi o cellule NK che possiedono il recettore per l Fc. Resta però ancora da stabilire se questi meccanismi di uccisione delle neoplasie possano svolgere un qualche ruolo anche in vivo. [Abbas A.K. et al., 1998] 1.4 Le cellule dendritiche nella regolazione dei meccanismi effettori Le cellule dendritiche (DC) sono cellule accessorie che svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione della risposta immunitaria. L importanza delle DC nell immunità antitumorale è ascrivibile alla loro capacità di presentare antigeni tumorali su molecole MHC di classe II nonché di classe I (cross-priming), di orientare le risposte immunitarie attraverso la secrezione di citochine regolatrici (IL-12 versus IL-10) e di attivare i linfociti T naive, inducendo così risposte T-citotossiche tumore-specifiche. Sono inoltre essenziali nella generazione di risposte anticorpali primarie e potenti stimolatrici dell attività citotossica delle cellule NK. Nel sangue periferico umano sono presenti tre distinte popolazioni di precursori della linea dendritica: monociti CD14 +, precursori mieloide e precursori linfoidi. E noto che monociti CD14 +, in seguito ad opportuna stimolazione con citochine, possono differenziarsi in modo reversibile in cellule dendritiche di tipo mieloide. 18